一种基于突变特征的小细胞肺癌分子分型确定方法及应用

1.本发明属于基因技术领域，尤其涉及一种基于突变特征的小细胞肺癌分子分型确定方法及应用。


背景技术：

2.目前，小细胞肺癌(sclc)恶性程度高、预后差，化疗或化疗联合放疗作为两种重要的治疗手段一直被应用在临床上。最近，尽管免疫治疗在小细胞肺癌中取得了一定的研究进展，然而，进展有限。由于小细胞肺癌独特的生物学特性，确定并分析其基因组的特征，具有非常重要的临床意义。实际上，分子生物学研究表明，小细胞肺癌可以分为sclc
‑
a、sclc
‑
n、sclc
‑
p和sclc
‑
y四种亚型，而这些亚型能够为个性化治疗提供必要的线索。然而，目前的分子分型是通过分析国外数据的转录组水平得出的。
3.目前，针对小细胞肺癌的基因组突变特征以及免疫相关特征进行相关的分子分型，国内外并没有相关的文献报道。因此，深入而全面地分析小细胞肺癌的基因组改变特征和免疫特征，进而进行相关的亚类分型，将有助于进一步推动小细胞肺癌的个体化治疗。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术没有针对小细胞肺癌的基因组特征以及免疫特征进行亚类分型分析确定的技术。
5.解决以上问题及缺陷的难度为：由于tp53和rb1是小细胞肺癌最常见的两个突变，很难基于基因改变特征再次进行分子分型。
6.解决以上问题及缺陷的意义为：对小细胞肺癌的个体化治疗以及药物靶点的挖掘非常重要。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于突变特征的小细胞肺癌分子分型确定方法及应用。
8.本发明是这样实现的，一种小细胞肺癌基因改变分子分型在制备治疗小细胞肺癌药物上的用途。
9.所述小细胞肺癌基因改变分子分型为：cluster 1(主要富集signature 4:吸烟相关基因特征(导致g
·
c转换为t
·
a，有甲基化cpg二核苷酸的倾向))、cluster2(主要富集signature 6:dna错配修复相关基因特征(在npcpg碱基位点,额外的c
·
g转换为t
·
a))以及cluster 3(主要富集signature 5:不明相关基因特征(以a
·
t转换为g
·
c的几个特征))。
10.本发明的另一目的在于提供一种试剂盒，所述试剂盒包含所述用途中的小细胞肺癌基因改变分子分型。
11.本发明的另一目的在于提供一种基于突变特征的小细胞肺癌分子分型确定方法，所述基于突变特征的小细胞肺癌分子分型确定方法包括：
12.通过分析小细胞肺癌的基因改变特征，对基因组进行signature相关分析，并进行
无监督聚类，确定小细胞肺癌分子的分型。
13.进一步，所述基于突变特征的小细胞肺癌分子分型确定方法包括以下步骤：
14.步骤一，进行dna文库构建及全外显子组测序；并进行序列比对与变异检测；
15.步骤二，采用增强标记聚合物系统进行免疫组织化学染色；分析小细胞肺癌的基因改变特征，对基因组进行signature相关分析，并进行无监督聚类，确定小细胞肺癌分子的分型结果。
16.进一步，步骤一中，所述进行dna文库构建及全外显子组测序包括：
17.用酶法将基因组dna酶切成200bp大小的片段；在端部修复和a拖尾后，在两端均增加t形接头；通过连接介导的pcr扩增纯化的dna，使用novaseq6000系统对成对端多路样品进行测序；使用96rxn xgen exome research panel v1.0生成测序文库。
18.进一步，所述测序包括：测序深度为每个组织样本200
×
，每个对照100
×
。
19.进一步，步骤一中，所述序列比对与变异检测包括：
20.(1)将原始数据进行fastp预处理，得到适配子序列，用burrow
‑
wheeler aligner将fast q格式的清洁读数与参考人类基因组hg19/grch37进行比对；利用sam工具和picard对映射的bam文件进行排序并处理pcr副本；
21.(2)利用gatk生成最终的bam文件，用mutect检测体细胞单核苷酸变异，用gatk体细胞indel检测器检测体细胞小插入和缺失；利用annovar进行基于多个数据库的变体注释；
22.(3)对保留的非同义snv用变异等位基因频率即截止≥为3％或vaf截止≥为1％从疾病数据库中筛选得到的癌症热点进行进一步分析；
23.(4)计算肿瘤突变负荷，计算每个编码区的非同义snv数和内含变异数；通过结合mutsigcv和dndscv两种方法识别重要的驱动基因；
24.(5)利用癌症重要靶点基因组识别2.0识别拷贝数变异。
25.进一步，所述多个数据库包括变体描述、群体频率数据库、变体功能预测数据库以及表型或疾病数据库。
26.进一步，所述利用癌症重要靶点基因组识别2.0识别拷贝数变异包括：在染色体臂水平，用fdr基于截断值<10％的标准筛选有意义的扩增或缺失进行进一步分析；在病灶水平，用fdr基于截断值<5％的标准和g
‑
score基于截断值>0.3的标准筛选显著扩增，用fdr(基于截断值<5％的标准和g
‑
score基于截断值<
‑
0.2的标准筛选显著缺失进行进一步分析。
27.进一步，所述进行免疫组织化学染色包括：
28.用抗pd
‑
l1、抗cd8
+
在4℃染色过夜后，用磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5min；
29.用相应的二抗在37℃下染色30min，用pbs洗涤3次，每次5min；
30.用3，3
‑
二氨基苯甲酸进一步染色，用蒸馏水洗涤；
31.进行苏木精染色，脱水，清除，并用中性牙龈固定；
32.用kf
‑
pro
‑
120、kf
‑
bio数字病理玻片扫描仪采集染色组织图像。
33.进一步，所述抗pd
‑
l1为cst，13684，1：100；所述抗cd8
+
为cst，85336，1：100。
34.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明通过全外显子测序(wes)的方法全面分析了178例小细胞肺癌的基因突变、拷贝数改变等特征，并分
析了tmb、tnb以及pdl1、cd8+t细胞等免疫特征。本发明对小细胞肺癌的基因特征和免疫特征进行了整合，并首次提出了小细胞肺癌的三个基因改变分子分型。本发明对于解小细胞肺癌异质性的特征和发展个体化治疗是必不可少的，并将推动小细胞肺癌个体化临床实验的发展。
附图说明
35.图1是本发明实施例提供的基于突变特征的小细胞肺癌分子分型确定方法流程图。
36.图2是本发明实施例提供的小细胞肺癌的基因组分子分型示意图。
37.图3是本发明实施例提供的小细胞肺癌分子分型基因突变的差异示意图。
38.图4是本发明实施例提供的小细胞肺癌分子分型基因拷贝数差异示意图。
39.图5是本发明实施例提供的小细胞肺癌分子分型免疫相关特征差异示意图。
具体实施方式
40.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
41.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于突变特征的小细胞肺癌分子分型确定方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
42.本发明实施例提供的基于突变特征的小细胞肺癌分子分型确定方法包括：
43.通过分析小细胞肺癌的基因改变特征，对基因组进行signature相关分析，并进行无监督聚类，确定小细胞肺癌分子的分型。
44.本发明提供一种小细胞肺癌基因改变分子分型在制备治疗小细胞肺癌药物上的用途。
45.所述小细胞肺癌基因改变分子分型为：
46.cluster 1(主要富集signature 4:吸烟相关基因特征(导致g
·
c转换为t
·
a，有甲基化cpg二核苷酸的倾向))、cluster 2(主要富集signature 6:dna错配修复相关基因特征(在npcpg碱基位点,额外的c
·
g转换为t
·
a))以及cluster 3(主要富集signature 5:不明相关基因特征(以a
·
t转换为g
·
c的几个特征))。
47.本发明的另一目的在于提供一种试剂盒，所试剂盒包含所述用途中的小细胞肺癌基因改变分子分型。
48.如图1所示，本发明实施例提供的基于突变特征的小细胞肺癌分子分型确定方法包括以下步骤：
49.s101，进行dna文库构建及全外显子组测序；并进行序列比对与变异检测；
50.s102，采用增强标记聚合物系统进行免疫组织化学染色；
51.s103，分析小细胞肺癌的基因改变特征，对基因组进行signature相关分析，并进行无监督聚类，确定小细胞肺癌分子的分型结果。
52.本发明实施例提供的进行dna文库构建及全外显子组测序包括：
53.用酶法将基因组dna酶切成200bp大小的片段；在端部修复和a拖尾后，在两端均增
加t形接头；通过连接介导的pcr扩增纯化的dna，使用novaseq6000系统对成对端多路样品进行测序；使用96rxn xgen exome research panel v1.0生成测序文库。
54.本发明实施例提供的测序包括：测序深度为每个组织样本200
×
，每个对照100
×
。
55.本发明实施例提供的序列比对与变异检测包括：
56.(1)将原始数据进行fastp预处理，得到适配子序列，用burrow
‑
wheeler aligner将fast q格式的清洁读数与参考人类基因组hg19/grch37进行比对；利用sam工具和picard对映射的bam文件进行排序并处理pcr副本；
57.(2)利用gatk生成最终的bam文件，用mutect检测体细胞单核苷酸变异，用gatk体细胞indel检测器检测体细胞小插入和缺失；利用annovar进行基于多个数据库的变体注释；
58.(3)对保留的非同义snv用变异等位基因频率即截止≥为3％或vaf截止≥为1％从疾病数据库中筛选得到的癌症热点进行进一步分析；
59.(4)计算肿瘤突变负荷，计算每个编码区的非同义snv数和内含变异数；通过结合mutsigcv和dndscv两种方法识别重要的驱动基因；
60.(5)利用癌症重要靶点基因组识别2.0识别拷贝数变异。
61.本发明实施例提供的多个数据库包括变体描述、群体频率数据库、变体功能预测数据库以及表型或疾病数据库。
62.本发明实施例提供的利用癌症重要靶点基因组识别2.0识别拷贝数变异包括：在染色体臂水平，用fdr基于截断值<10％的标准筛选有意义的扩增或缺失进行进一步分析；在病灶水平，用fdr基于截断值<5％的标准和g
‑
score基于截断值>0.3的标准筛选显著扩增，用fdr(基于截断值<5％的标准和g
‑
score基于截断值<
‑
0.2的标准筛选显著缺失进行进一步分析。
63.本发明实施例提供的进行免疫组织化学染色包括：
64.用cst，13684，1：100的抗pd
‑
l1、cst，85336，1：100的抗cd8
+
在4℃染色过夜后，用磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5min；
65.用相应的二抗在37℃下染色30min，用pbs洗涤3次，每次5min；
66.用3，3
‑
二氨基苯甲酸进一步染色，用蒸馏水洗涤；
67.进行苏木精染色，脱水，清除，并用中性牙龈固定；
68.用kf
‑
pro
‑
120、kf
‑
bio数字病理玻片扫描仪采集染色组织图像。
69.本发明实施例提供的抗pd
‑
l1为cst，13684，1：100；所述抗cd8
+
为cst，85336，1：100。
70.本发明实施例提供的小细胞肺癌分子的分型结果包括：
71.通过进行无监督聚类得到3个分子分型亚类，分别为cluster 1、cluster 2以及cluster 3。
72.下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
73.实施例1：
74.dna文库构建及全外显子组测序(wes)。
75.用酶法将基因组dna酶切成200bp大小的片段。在端部修复和a拖尾后，在两端都增加了t形接头。为了构建文库，通过连接介导的pcr扩增纯化的dna，随后根据制造商的说明
使用96rxn xgen exome research panel v1.0(integrated dna technologies，usa)生成最终的测序文库。使用novaseq6000系统对成对端多路样品进行测序。测序深度为每个组织样本200
×
，每个对照100
×
。
76.序列比对与变异检测。
77.原始数据被fastp预处理以修剪适配子序列，随后，用burrow
‑
wheeler aligner(bwa，v0.7.15)将fast q格式的清洁读数与参考人类基因组(hg19/grch37)进行比对。sam工具和picard(2.12.1)(http://picard.sourceforge.net)用于对映射的bam文件进行排序并处理pcr副本。为了计算测序覆盖率和深度，最终的bam文件由gatk(基因组分析工具包3.8)生成，用于局部比对和碱基质量重新校准。用mutect检测体细胞单核苷酸变异(snv)，用gatk体细胞indel检测器检测体细胞小插入和缺失(indels)。annovar软件用于基于多个数据库的变体注释，包括变体描述(hgv)、群体频率数据库(1000基因组计划、dbsnp、exac)、变体功能预测数据库(polyphen
‑
2和sift)以及表型或疾病数据库(omim、cosmic、clinvar)。对保留的非同义snv用变异等位基因频率(vaf)(截止≥为3％)或vaf(截止≥为1％)从疾病数据库中筛选出癌症热点进行进一步分析。计算肿瘤突变负荷(tmb)，计算每个编码区的非同义snv数和内含变异数。通过结合mutsigcv和dndscv两种方法识别重要的驱动基因，如先前研究所述，错误发现率(fdr，截止<10％)。拷贝数变异(cnv)是使用癌症重要靶点基因组识别(gistic)2.0算法识别的。在染色体臂水平，用fdr(截断值<10％)筛选有意义的扩增或缺失进行进一步分析。在病灶水平，用fdr(截断值<5％)和g
‑
score(截断值>0.3)筛选显著扩增，用fdr(截断值<5％)和g
‑
score(截断值<
‑
0.2)筛选显著缺失进行进一步分析。
78.免疫组织化学染色。
79.采用增强标记聚合物系统(elps)进行免疫组织化学染色。用抗pd
‑
l1(cst，13684，1：100)、抗cd8+(cst，85336，1：100)在4℃染色过夜后，用磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5min。用相应的二抗在37℃下染色30min，然后用pbs洗涤3次，每次5min。用3，3
‑
二氨基苯甲酸(dab)进一步染色，然后用蒸馏水洗涤。然后，进行苏木精染色，然后脱水，清除，并用中性牙龈固定。用kf
‑
pro
‑
120、kf
‑
bio数字病理玻片扫描仪采集染色组织图像。
80.结果
81.小细胞肺癌的基因组分子分型构建
82.通过分析小细胞肺癌的基因改变特征，对基因组进行signature相关分析，并进行无监督聚类，最终得到3个亚类，分别为cluster 1、cluster 2以及cluster 3.
83.本发明比较了cluster 1、cluster 2以及cluster 3三个分子分型的驱动基因突变的差异。结果表明，tp53以及rb1仍然是小细胞肺癌突变频率最高的基因，分别为93.26％以及44.38％。而or51i2基因突变在三个亚型中存在差异。
84.本发明比较了cluster 1、cluster 2以及cluster 3三个分子分型的染色体层面的基因拷贝数改变之间的差异。结果表明，在基因拷贝数扩增层面，三个分子分型在染色体1、2、3、5、6、15、16、20以及22存在一定的差异。另外，在基因拷贝数缺失方面，三个分子分型在染色体5、7、9、10、11、14、15、16存在一定的差异。(*<0.05；**<0.01；***<0.001)
85.本发明比较了cluster 1、cluster 2以及cluster 3三个分子分型的免疫相关特征的差异。结果表明，三个分子分型中，tnb、pdl1(tps)、pdl1(cps)以及cd8+t细胞均存在一
定的差异。重要的是，本研究惊喜的发现，cluster 1亚型具有更高的tnb，并具有更高的pdl1表达以及cd8+t细胞的浸润。
86.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。