一种大鼠及其体外血管平滑肌细胞血管重构的造模方法

1.本发明涉及医药生物领域，特别涉及一种大鼠及其体外血管平滑肌细胞血管重构的造模方法。


背景技术：

2.glp-1是由胰高血糖素原基因加工后形成的一种长促胰岛素多肽，该基因在1983年被首次克隆成功，其蛋白产品于2005年被批准作为ii型糖尿病的治疗药物。人们在利用glp-1治疗ii型糖尿病的过程中发现其对心血管系统具有保护作用，例如改善内皮功能障碍、增加心肌细胞存活率、改善心肌损伤和心力衰竭后局部和整体心输出量。此外，glp-1能够降低高血压患者的血压，改善糖尿病患者的心血管预后效应。
3.glp-1的功能是由glp-1r介导的。glp-1r在胰腺、肺脏、肾脏、大脑、脂肪组织、胃肠道、血管和心脏、肝脏等部位都有表达。同大多数gpcrs一样，glp-1r一直以来被认为是一种经典的膜受体，其亚细胞定位主要集中在细胞质和细胞膜。配体诱导的glp-1r内化和循环已经在中国仓鼠肺成纤维细胞、大鼠胰岛素瘤细胞和大鼠胰岛细胞中得到证明。glp-1r的表达对心血管疾病的治疗能发挥保护作用，蛋白激酶c的β型亚基表达的上调可以降低高血压大鼠肾动脉内glp-1r的表达，glp-1r表达的降低导致高血压患者中的血管舒缩功能受损。在慢性肾病和心肌梗塞中，二肽基酶iv的抑制可以增加肾小管和心肌中glp-1r的表达。在生理浓度范围内的glp-1(10-20nmol/l)可改善心血管疾病的作用，然而高浓度的glp-1对血管重构的影响未见文献报道。我们建立一种方法使用高浓度的glp-1及其类似物干预大鼠，以及体外干预大鼠主动脉血管平滑肌细胞可以引起血管重构现象的发生。这一建立血管重构模型的方法，对将来治疗和预防心血管疾病提供了良好模型和理论基础。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是提供一种大鼠及其体外血管平滑肌细胞血管重构的造模方法，利用高浓度的glp-1及其类似物，促进大鼠体内、外血管平滑肌细胞异常增值、迁移和细胞外基质重构，建立血管重构大鼠模型或血管重构体外细胞模型。
5.为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：
6.本发明的一方面提供一种大鼠及其体外血管平滑肌细胞血管重构的造模方法，该方法以胰高血糖素样肽glp-1、利拉鲁肽或艾塞那肽为诱导因子处理大鼠或大鼠体外血管平滑肌细胞构建血管重构大鼠模型或血管重构体外细胞模型。
7.血管重构大鼠模型的构建方法包括：对大鼠腹腔注射glp-1、利拉鲁肽或艾塞那肽，单次给药量3mg/kg大鼠，一天2次，连续注射8周，获得大鼠血管重构模型。
8.进一步，所述大鼠为wistar大鼠。
9.血管重构体外细胞模型的构建方法包括：在大鼠主动脉血管平滑肌细胞的完全培养基中添加100nm及其以上浓度的glp-1、利拉鲁肽或艾塞那肽，对大鼠主动脉血管平滑肌细胞进行培养，获得血管重构体外细胞模型。
10.进一步，所述完全培养基中含有l-谷氨酸、羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、碳酸氢钠、丙酮酸钠与胎牛血清。
11.进一步，所述完全培养基中，l-谷氨酸含量为4mm，羟乙基哌嗪乙磺酸含量为6.0g/l，葡萄糖含量为4.5g/l，碳酸氢钠含量为3.7g/l，丙酮酸钠含量为0.11g/l，胎牛血清含量10％。
12.进一步，培养时间为24～48h。
13.本发明的另一方面提供上述血管重构大鼠模型或血管重构体外细胞模型在筛选或制备治疗心血管疾病药物中的应用。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
15.(1)正常生理浓度范围内的glp-1对血管重构相关疾病的预防和治疗发挥有益作用，本发明首次以100nm及其以上浓度的glp-1、glp-1类似物来构建血管重构模型，动物模型、体外细胞模型构建方法简单，操作步骤时间较短，节约了时间成本和经济成本。
16.(2)本发明血管重构大鼠模型或血管重构体外细胞模型为glp-1及其类似物诱导的血管重构模型，将为心血管疾病的多因素诱导发病机制提供支持，为开发一种有效治疗心血管疾病的新药物制剂提供重要的理论依据。
附图说明
17.图1为本发明实施例1利拉鲁肽干预组与对照组中大鼠血管壁厚度及胶原蛋白含量的比对图；
18.图2为本发明实施例1利拉鲁肽干预组与对照组中大鼠血管细胞外基质重构的比对图；
19.图3为本发明实施例2glp-1干预组、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预组中大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖的比对图；
20.图4为本发明实施例3glp-1干预组、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预组中大鼠主动脉血管平滑肌细胞迁移的比对图；
21.图5为本发明实施例4glp-1干预组、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预组中大鼠主动脉血管平滑肌细胞外基质重构的比对图。
具体实施方式
22.以下所述实例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但并不限制本发明专利的保护范围，凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
23.实施例1
24.血管重构大鼠模型的构建：8周龄的wt大鼠12只，实验开始当天记为第0天开始称重，wt大鼠根据体重随机分为2组：利拉鲁肽干预组和对照组，每组各6只。第1天开始给予利拉鲁肽或生理盐水，利拉鲁肽干预组腹腔注射利拉鲁肽lirglutide，单次给药量为3mg/kg大鼠，对照组同一时间给予等量的生理盐水，一天2次，连续注射8周。
25.血管重构大鼠模型的鉴定：将上述大鼠处死，收集组织样品。将血管部分进行包埋、切片，然后通过he染色和masson染色分别检测血管壁厚度和胶原纤维含量的变化情况。
羟乙基哌嗪乙磺酸，4.5g/l葡萄糖，3.7g/l碳酸氢钠，0.11g/l丙酮酸钠，10％胎牛血清)培养24h，待细胞密度达到90％以上时，用200μl的枪头在每个孔的中央划痕，将其分为四组：对照组、glp-1干预组、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预组，对照组用无血清培养基(4mm l-谷氨酸，6.0g/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，4.5g/l葡萄糖，3.7g/l碳酸氢钠，0.11g/l丙酮酸钠)干预，glp-1干预组、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预组分别用无血清培养基(成分同对照组)配置好的100nm的glp-1、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预，然后置于二氧化碳恒温培养箱培养24h。
36.细胞迁移检测：使用倒置显微镜(
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10倍镜)对划的宽度拍照，捕获0h和24h每个样品的图像，并通过使用image-proplus 6软件测量2个时间点测量的划痕宽度来评价大鼠主动脉血管平滑肌细胞迁移的程度，细胞迁移率＝(对照组-实验组)/对照组*100％。
37.参见图4，结果显示100nm的glp-1或利拉鲁肽和艾塞那肽的处理促使rasmc细胞的迁移能力显著增加，该结果说明100nm的glp-1或利拉鲁肽和艾塞那肽能够促进大鼠主动脉血管平滑肌细胞的异常迁移。
38.实施例4
39.血管重构体外细胞模型的构建：将状态良好的大鼠主动脉血管平滑肌细胞置于完全培养基(4mm l-谷氨酸，6.0g/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，4.5g/l葡萄糖，3.7g/l碳酸氢钠，0.11g/l丙酮酸钠，10％胎牛血清)中，然后将其放置在温度为37℃，体积浓度为5％co2的恒温培养箱中进行培养；待细胞密度达到95％以上时，弃去旧的培养基，用磷酸缓冲盐溶液(pbs)洗涤3次，加入0.25％的胰酶对贴壁的细胞在培养箱内消化1-2min；然后加入含有胎牛血清的新鲜完全培养基(成分同上)使其终止消化，1100rpm离心5min，去上清；用含有胎牛血清的新鲜完全培养基(成分同上)将细胞再次悬起，将细胞悬浮液接种于6孔板内，且分为四组：对照组、glp-1干预组、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预组；待细胞密度达到90％以上时，用无血清的培养基(4mm l-谷氨酸，6.0g/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸，4.5g/l葡萄糖，3.7g/l碳酸氢钠，0.11g/l丙酮酸钠)代替完全培养基分别配置100nm glp-1、利拉鲁肽和艾塞那肽，配置好后将其分别添加至相应组的细胞悬浮液中，持续干预细胞24h，对照组用等体积的无血清培养基干预相同的时间。
40.细胞外基质中蛋白表达的检测：
①
收集上述不同处理组的细胞，将细胞置于提前用蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟配置好的细胞裂解液中，在冰上裂解20min；
②
12000rpm，4℃低温离心机离心15min，取出，用bca定量试剂盒检测蛋白浓度；
③
保证每组样品相同的上样量，进行sds-page；
④
电泳完成后，将pvdf膜置于甲醇中5s将其活化，从转膜仪的正极到负极按照“滤纸-pvdf膜-sds凝胶-滤纸”的顺序制备转膜“三明治”，加入提前配置好的电转液，根据所需的目的蛋白的分子量设定相应的转膜条件；
⑤
当湿转完成后，从滤纸中间取出pvdf膜，用洗膜缓冲液tbst对其进行清洗，最后用tbst配制好的5％脱脂奶粉，室温下对pvdf膜封闭2h；
⑥
洗膜缓冲液tbst清洗3次，每次5min，在4℃低温条件下，过夜孵育一抗；
⑦
洗膜缓冲液tbst清洗3次，每次5min，在4℃低温条件下，过夜孵育二抗；
⑧
在暗室用ecl进行x-光片显影、定影。
41.参见图5，结果显示100nm的glp-1、利拉鲁肽或艾塞那肽都能明显上调col1a1、col3a1、mmp9、mmp2和mmp1蛋白的表达，细胞外基质中蛋白发生重构，说明glp-1干预组、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预组中glp-1血管重构体外细胞模型构建成功。
42.实施例5
43.将状态良好的大鼠主动脉血管平滑肌细胞接种于6孔板，保证每孔1
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105个细胞；用含有胎牛血清的完全培养基(4mm l-谷氨酸，6.0g/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，4.5g/l葡萄糖，3.7g/l碳酸氢钠，0.11g/l丙酮酸钠，10％胎牛血清)培养24h，待细胞密度达到90％以上时，用200μl的枪头在每个孔的中央划痕，将其分为四组：对照组、glp-1干预组、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预组，对照组用无血清培养基(4mm l-谷氨酸，6.0g/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，4.5g/l葡萄糖，3.7g/l碳酸氢钠，0.11g/l丙酮酸钠)干预，glp-1干预组、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预组分别用无血清培养基(成分同对照组)配置好的200nm的glp-1、利拉鲁肽和艾塞那肽干预，然后置于二氧化碳恒温培养箱培养24h。
44.细胞增值活力检测：检测方法参见实施例2，mtt检测结果显示200nm的glp-1、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽明显提升了细胞活力。
45.细胞周期蛋白检测：检测方法参见实施例2，蛋白质免疫印迹结果表明200nm的glp-1、利拉鲁肽和艾塞那肽的干预能够明显上调细胞周期蛋白pcna和cyclind1的表达，该结果表明200nm的glp-1、利拉鲁肽和艾塞那肽能够导致大鼠主动脉血管平滑肌细胞的异常增殖。
46.细胞外基质蛋白检测：检测方法参见实施例2，结果显示200nm的glp-1、利拉鲁肽和艾塞那肽都能明显上调col1a1、col3a1、mmp9、mmp2和mmp1蛋白的表达，细胞外基质中蛋白发生重构。
47.细胞迁移检测：检测方法参见实施例3，结果显示200nm的glp-1、利拉鲁肽和艾塞那肽的处理促使rasmc细胞的迁移能力显著增加，该结果说明200nm的glp-1、利拉鲁肽和艾塞那肽能够促进大鼠主动脉血管平滑肌细胞的异常迁移。
48.综上所述，200nm的glp-1、利拉鲁肽和艾塞那肽也可诱导体外平滑肌细胞的血管重构，glp-1干预组、利拉鲁肽干预组和艾塞那肽干预组中glp-1血管重构体外细胞模型构建成功。