一种腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种编辑效率高、范围窄的腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用。

背景技术：

1、crispr/cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr associated proteins)系统一经问世，便迅速成为了炙手可热的第三代基因编辑工具。但crispr/cas系统编辑基因时并不十分精确，因此会产生不需要的编辑副产物。鉴于此，基于crispr/cas系统发展起来的碱基编辑技术(base editing)应运而生。与crispr/cas系统不同，碱基编辑技术发挥作用不依赖于dna双链断裂(dsb)的产生，也不需要供体dna的参与便可实现高效精准的单个碱基的编辑，因此保真性和安全性更高。针对这些特性，碱基编辑技术也被认为是更安全的第四代基因编辑工具。

2、目前，碱基编辑技术可分为dna碱基编辑器和rna碱基编辑器两大类。2016年，david liu团队率先开发了第一种形式的dna碱基编辑器——胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebase editor，cbe)，实现了胞嘧啶(c)到胸腺嘧啶(t)的转换。2017年，该团队又创新性地开发了第二种形式的dna碱基编辑器——腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor，abe)，可实现腺嘌呤(a)到鸟嘌呤(g)的转换。其中，abe主要由三个元件组成：sgrna、改造的cas9蛋白和人工进化的腺嘌呤脱氨酶(tada)。与cbe作用原理相似，abe系统首先在sgrna的引导下，特异地与靶序列的互补链配对，然后经过ncas9的作用，非互补链便会逐渐暴露出来，此时，tada便会将非互补链上一定活性窗口内的a水解脱氨生成肌苷(i)，由于dna聚合酶活性位点的限制，i与c配对，进而被读取或复制为g，实现非互补链上a-to-g(或互补链上t-to-c)的碱基转换。

3、然而，现有的abe系统普遍存在靶向范围广、编辑窗口宽的现象，在精准编辑方面仍存在缺陷，需要进一步优化。因此，需要开发出具有高活性、编辑窗口缩窄的abe，从而极大地扩充基因编辑工具的应用，尤其是为临床疾病实现精准治疗提供强有力的研究工具。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种编辑效率高、范围窄的新型腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用，以提高现有abe编辑的精准性、缩小其编辑窗口以及增加其在生物医学领域的应用。

2、为实现该目的，本发明提供一种腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，包括ng-abe9e表达载体，所述的ng-abe9e表达载体为质粒pcmv-ng-abe9e，其序列如seq id no.1所示。质粒pcmv-ng-abe9e用于编码表达突变型蛋白：r111t+n127k+q154r。

3、所述腺嘌呤碱基编辑工具包括sgrna表达载体。sgrna表达载体针对不同基因靶点其序列不同。

4、所述sgrna表达载体为序列如seq id no.2-13所示的序列中一条或多条。

5、所述sgrna表达载体为序列如seq id no.14所示。

6、所述的腺嘌呤碱基编辑工具还包括真核细胞和基因转染、转导试剂。

7、所述ng-abe9e表达载体编码的ng-abe9e氨基酸序列，如seq id no.30所示。

8、本发明还提供一种腺嘌呤碱基编辑工具，包括ng-abe9e氨基酸序列，如seq idno.30所示。

9、本发明还提供了上述的腺嘌呤碱基编辑工具的构建方法，其特征在于:利用含有相应突变信息的引物，从pcmv-ng-abe8e载体上扩增出突变片段一、二、三、四；pcmv-ng-abe8e载体酶切后得到骨架；将突变片段一、二、三、四搭桥后与骨架通过无缝克隆得到编码突变型蛋白的表达载体pcmv-ng-abe9e。

10、利用如seq id no.18和seq id no.24所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段一；利用如seq id no.23和seq id no.20所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段二；利用如seq id no.19和seq id no.22所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段三；利用如seq id no.21和seq id no.25所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段四。

11、优选地，所述突变片段一、二、三、四序列如seq id no.26、27、28、29所示。

12、本发明还提供上述腺嘌呤碱基编辑工具在真核细胞单碱基编辑中的应用。

13、优选地，腺嘌呤碱基编辑工具用于对含突变的rho基因的真核细胞的修复。

14、优选地，对含突变的rho基因的真核细胞的修复方法包括如下步骤：

15、(1)根据mutrho致病基因dna靶点序列设计相应的sgrna；

16、(2)将含有突变的rho基因的真核细胞接种于12孔板，调整细胞密度；24h后将针对mutrho致病基因dna靶点的sgrna分别与ng-abe9e表达载体共转入hek-293-mutrho细胞中；48h后更换新鲜培养基；

17、(3)第3天收集细胞，进行dna测序确定腺嘌呤碱基编辑结果。

18、本发明还提供了上述的新型腺嘌呤碱基编辑工具的应用方法，其特征在于:

19、(1)构建用于检测ng-abe9e编辑效率和编辑窗口的egfp报告系统，其利用的egfp基因序列如seq id no.15、16所示；

20、(2)构建ng-abe9e疾病修复模型hek-293-mutrho细胞系，其利用的mutrho基因序列如seq id no.17所示；

21、(3)对于处理后的真核细胞消化过滤，进行流式细胞分析；或对处理后的真核细胞基因组dna进行抽提，利用针对靶点的特异性引物进行pcr扩增，再利用基因组dna的pcr产物构建高通量测序dna文库，并进行高通量dna测序。

22、与现有的技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过改造ng-abe8e的腺苷脱氨酶编码序列，引入关键突变信息，从而在维持其较高编辑效率的同时，成功缩窄了编辑范围。为实现高效、精准和安全的碱基编辑提供了新的方法和思路。这将有助于促进基因组编辑在基础研究、临床治疗、微生物以及动植物育种等领域更为广拓的应用。

技术特征：

1.一种腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，包括ng-abe9e表达载体，所述ng-abe9e表达载体为质粒pcmv-ng-abe9e，其序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，包括sgrna表达载体。

3.根据权利要求2所述的腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，sgrna表达载体，其序列如seq id no.14所示。

4.根据权利要求1-3所述的腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，ng-abe9e表达载体编码的ng-abe9e氨基酸序列，如seq id no.30所示。

5.一种腺嘌呤碱基编辑工具，其特征在于，包括ng-abe9e氨基酸序列，如seq id no.30所示。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的腺嘌呤碱基编辑工具的构建方法，其特征在于:利用含有相应突变信息的引物，从pcmv-ng-abe8e载体上扩增出突变片段一、二、三、四；pcmv-ng-abe8e载体酶切后得到骨架；将突变片段一、二、三、四搭桥后与骨架通过无缝克隆得到编码突变型蛋白的表达载体pcmv-ng-abe9e。

7.根据权利要求6所述的腺嘌呤碱基编辑工具的构建方法，其特征在于，利用如seq idno.18和seq id no.24所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段一；利用如seqid no.23和seq id no.20所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段二；利用如seq id no.19和seq id no.22所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段三；利用如seq id no.21和seq id no.25所示的含有相应突变信息的引物序列获得突变片段四。

8.根据权利要求7所述的腺嘌呤碱基编辑工具的构建方法，其特征在于，所述突变片段一、二、三、四序列如seq id no.26、27、28、29所示。

9.一种权利要求1-5任一项所述的腺嘌呤碱基编辑工具在真核细胞单碱基编辑中的应用。

10.一种权利要求9所述的腺嘌呤碱基编辑工具的应用，其特征在于：腺嘌呤碱基编辑工具用于对含突变的rho基因的真核细胞的修复。

技术总结
本发明涉及一种腺嘌呤碱基编辑工具及其方法和应用。腺嘌呤碱基编辑工具包括NG‑ABE9e表达载体，所述NG‑ABE9e表达载体为质粒pCMV‑NG‑ABE9e，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过在NG‑ABE8e腺苷脱氨酶编码序列中引入关键突变信息，从而在保持高活性、高保真的基础上有效缩窄其编辑窗口，以提高ABE编辑的精确性以及增加其在生命领域的应用。

技术研发人员：谷峰,涂天祥,何晓雪
受保护的技术使用者：温州医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12