一种同时检测三种腹泻细菌的三重荧光PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种同时检测三种腹泻细菌的三重荧光pcr检测试剂盒，本发明提供用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌检测的特异性引物和探针，并建立了金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的三重荧光pcr检测方法。本发明的特异性引物探针和检测方法特异性强、灵敏度高、且具有良好重复性和稳定性，为引起腹泻性疾病病原微生物的鉴别提供了快速、敏感、特异的临床检测方法，属于体外诊断领域。

背景技术：

1、腹泻是多病原、多因素引起的，主要临床表现为肠道运动频率加快、粪便含水量增加的一组肠道疾病的总称。世界卫生组织广义上将腹泻分为感染性腹泻及非感染性腹泻两种。感染性腹泻的发病率高危害严重是我国及全球普遍存在的重要公共卫生问题，许多国家都开展了腹泻相关的监测和研究。而金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌是常见的引起感染性腹泻的病原微生物。因此对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌监测和检测可以有效的预防大部分腹泻的发病，干涉金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的传播使得腹泻病在一定程度上得以控制。

2、金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，是革兰氏阳性菌的代表。该菌可引局部化脓感染；也可引起内脏器官感染，如肺炎、心包炎、心内膜炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶（如溶血毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、脱氧核糖核酸酶、肠毒素等）。毒素性疾病表现有：食物中毒，出现恶心、呕吐、腹部疼痛和腹泻等急性胃肠炎症状。中毒性休克综合征，主要表现为高热、低血压、红斑皮疹伴脱屑和休克等。

3、沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒，沙门氏菌感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。由沙门氏菌引起的食物中毒症状主要有恶心、呕吐、腹痛、头痛、畏寒和腹泻等，还伴有乏力、肌肉酸痛、视觉模糊、中等程度发热、躁动不安和嗜睡，延续时间2～3d，平均致死率为4.1%。

4、志贺菌传染源是病人和带菌者，传播途径主要为粪-口途径。人类对志贺氏菌较易感，夏秋两季患者最多。致病物质主要是侵袭力和内毒素，有的菌株还产生外毒素。临床感染类型为(1)急性菌痢：局部症状有脓血便，腹痛，里急后重。急性中毒性菌痢，以小儿多见，无明显的消化道症状，主要表现全身严重的中毒症状，各型志贺菌都有可能引起，临床主要有高热，神志障碍，休克，病死率较高；(2) 慢性菌痢：病程大于2个月，迁延不愈，局部症状为主。

5、目前，以实时荧光定量pcr技术为基础的核酸诊断方法是国内应用最为广泛的方法之一，该方法的原理主要基于标记不同颜色taq-man荧光探针。现有的核酸检测试剂盒大多采用单重或双重荧光探针方法实现靶基因的快速诊断。本发明采用三重荧光定量pcr技术，在同一反应体系中加入3条不同颜色标记的荧光探针，可以实现在一管反应中同时检测3个靶基因的目的，能够同时检测三种常见腹泻病原微生物检测方法，将有助于提升腹泻细菌检测水平，通量高，检测速度快。在疾病诊断和防治等方面具有重要的应用前景。

6、

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种腹泻病原微生物三重荧光pcr检测试剂盒及使用方法，快速准确地检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌，提供一种特异性检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的多重荧光pcr试剂盒。

2、组分包括pcr反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中pcr反应液主要含有上述的3种细菌的引物和探针、反应缓冲液、mg2+和dntp等，酶混合液主要含有热启动taq酶，阴性质控品为无rnase和dnase水，阳性质控品为含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌检测靶序列的重组质粒。

3、pcr反应液中用于核酸扩增的引物为p1和p2，p1和p2为针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；pcr反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为probe1，probe1为针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针具体引物序列（见表1）。

4、表1 引物和探针序列

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6、试剂盒选用的pcr反应体系为20 µl，包括2×pcr缓冲液10 µl、10mmol/l dntp1.0 µl、热启动taq酶混合液0.4 µl、混合引物0.35µl、样品dna 2µl，加灭菌水至终体系20µl。

7、试剂盒的pcr反应循环参数为94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。

8、质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无ct值（或ct值为0），阳性对照ct值≤30，否则实验结果不成立。

9、结果判读：

10、阳性：出现“s”型扩增曲线，ct值≤35；可疑：出现“s”型扩增曲线，但ct值＞35；阴性：没有出现“s”型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈“s”型；对可疑结果，应重复实验，如果重复实验还是出现“s”型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。

11、样本要求：临床样本类型包括粪便、肛拭子、呕吐物和分离培养物；临床样本采集后应带冰运输，-20℃保存，不能反复冻融；从临床样本提取dna，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的dna应立即检测，否则，应将dna分装后-80℃～-20℃保存。

12、本发明提供的试剂盒具有很好的特异性，可以检出金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌，且不能检出非金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌病原体的核酸；对金黄色葡萄球菌核酸的检测下限为10拷贝每反应体系；只需要2小时即可完成检测，可为金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的疾病监测和临床诊断提供实验依据。

技术特征：

1.一种同时检测三种腹泻细菌的引物组合，其特征在于，包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的检测引物和探针，具体引物探针序列如下：

2.一种同时检测三种腹泻细菌的三重荧光pcr检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物探针混合物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌同时进行检测；金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌上游引物、下游引物和探针mix配比，金黄色葡萄球菌引物探针mix配比，上游引物p1：下游引物p2：探针probe1=0 .032～0.128：0 .032～0.128：0 .012～0.08；沙门氏菌引物探针mix，上游引物p1：下游引物p2：探针probe1=0 .032～0.128：0.032～0.128：0 .012～0.08；志贺氏菌引物探针mix，上游引物p1：下游引物p2：探针probe1=0 .032～0.128：0 .032～0.128：0 .012～0.08。

3.根据权利要求2所述的三重荧光pcr检测方法，其特征在于，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌上游引物、下游引物和探针配比，金黄色葡萄球菌引物探针mix，上游引物p1：下游引物p2：探针probe1=0 .048～0.08：0 .08～0.112：0 .02～0.06；沙门氏菌引物探针mix，上游引物p1：下游引物p2：探针probe1=0 .032～0.064：0 .032～0.064：0 .02～0.028；志贺氏菌引物探针mix，上游引物p1：引物p2：探针probe1=0 .032～0.064：0 .032～0.064：0 .016～0.032。

4.根据权利要求2所述的三重pcr检测方法，其特征在于，所述三重荧光pcr的反应体系为：2×pcr缓冲液10 µl、10mmol/l dntp 1.0 µl、热启动taq酶混合液0.4 µl、混合引物0.35µl、样品dna 2µl，加灭菌水至终体系20 µl。

5.根据权利要求2所述的三重pcr检测方法，其特征在于，所述三重荧光pcr的扩增程序为：94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。

6.权利要求1所述的引物混合物在制备用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌检测的试剂盒中的用途。

7.根据权利要求6和3所述，其特征在于，所述试剂盒中，引物混合物中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌引物探针mix的配比，金黄色葡萄球菌引物探针mix：沙门氏菌引物探针mix：志贺氏菌引物探针mix＝0 .05～0.25：0 .05～0.25：0 .05～0.25。

8.根据权利要求7所述，其特征在于，所述试剂盒中，引物混合物中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌引物探针mix的配比，金黄色葡萄球菌引物探针mix：沙门氏菌引物探针mix：志贺氏菌引物探针mix＝0 .05～0.15：0 .10～0.20：0 .15～0.25。

技术总结
本发明公开了一种同时检测三种腹泻细菌的三重荧光PCR检测方法及其用途。本发明提供用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌检测的特异性引物和探针，并建立了金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的三重荧光PCR检测方法。本发明的特异性引物探针和检测方法特异性强、灵敏度高、且具有良好的重复性和稳定性，为腹泻性疾病的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。

技术研发人员：丁小静
受保护的技术使用者：江苏和创生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12