技术特征：
1.一种β-丙氨酸生产菌，由如下方法构建获得：以e. coli w3110为出发菌，将其基因组中pand基因的启动子替换为trc启动子，得到重组菌株e. coli w3110/trc-pand，记为ala1；将源自bacillus subtilis的外源基因pand整合入质粒ptrc99a中，得到质粒ptrc99a-pand；将质粒ptrc99a-pand导入步骤ala1中，增强pand基因的表达，得到重组菌株ala1/ptrc99a-pand，记为ala2；将ala2基因组中的ppc基因的启动子替换为trc启动子，得到重组菌株ala2/trc-ppc，记为ala3；将ala3基因组中的pyka基因敲除，得到重组菌株ala3/
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pyka，记为ala4；将ala4基因组中的aspa基因敲除，得到重组菌株ala4/
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aspa，记为ala5，即为所述β-丙氨酸生产菌。2.构建权利要求1所述β-丙氨酸生产菌的方法，其特征在于所述方法如下：运用crispr-cas9基因编辑技术，将出发菌e. coli w3110基因组中的pand基因的启动子替换成trc启动子，得到重组菌株w3110/trc-pand，记为ala1；将源自bacillus subtilis的外源基因pand整合入质粒ptrc99a中，得到质粒ptrc99a-pand；将质粒ptrc99a-pand导入步骤ala1中，增强pand基因的表达，得到重组菌株ala1/ptrc99a-pand，记为ala2；运用crispr-cas9基因编辑技术，将ala2基因组中的ppc基因的启动子替换为trc启动子，得到重组菌株ala2/trc-ppc，记为ala3；运用crispr-cas9基因编辑技术，将ala3基因组中的pyka基因敲除，得到重组菌株ala3/
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pyka，记为ala4；运用crispr-cas9基因编辑技术，将ala4基因组中的aspa基因敲除，得到重组菌株ala4/
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aspa，记为ala5，即为所述β-丙氨酸生产。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（1）trc启动子核苷酸序列如seq id no.1所示。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（2）外源基因pand核苷酸序列如seq id no.2所示。5.权利要求1所述β-丙氨酸生产菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述β-丙氨酸生产菌接种至发酵培养基中，于28~32 ℃、400~800 rpm条件下进行发酵培养48~100h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到β-丙氨酸；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10~30g/l、硫酸铵10~20g/l、酵母浸粉1~5g/l、kh2po
4 1~5g/l、mgso
4 0.1~2.0g/l、微量金属盐溶液0.5~5ml/l，ph 6.5~7.0，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10 g/l cucl2、10 g/l feso4·
7h2o、1 g/l znso4·
7h2o、0.20 g/l cuso4、0.02 g/l nicl2·
7h2o，溶剂为去离子水。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20 g/l，硫酸铵16 g/l，酵母粉2 g/l，kh2po
4 2 g/l，mgso
4 0.5 g/l，盐溶液 2 ml/l，溶剂为去离子水。
技术总结
本发明涉及一种β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用。所述β-丙氨酸生产菌是以E.coli W3110为出发菌，将其基因组中的panD基因的启动子替换为Trc启动子，导入整合了Bacillus subtilis来源panD的pTrc99A-panD质粒，并增强ppc基因的表达，和敲除pykA和aspA后所得。本发明构建所得β-丙氨酸生产菌在补料发酵过程中，β-丙氨酸产量可达29.35g/L，为后续高产β-丙氨酸工程菌的构建奠定了基础。丙氨酸工程菌的构建奠定了基础。丙氨酸工程菌的构建奠定了基础。
技术研发人员：柳志强 李波 张博 郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2021.11.22
技术公布日：2022/1/14