一种平衡苯丙醇合成工程菌胞内还原力的方法

本发明涉及生物，具体涉及一种强化大肠杆菌还原力循环以提高苯丙醇产量的方法。

背景技术：

1、苯丙醇，也称为3-苯基丙醇，具有清新香甜的气味，是一种天然存在于植物中的物质。可以用作香料，添加于化妆品和日用品中，也可以用作食物香料。在医药工业中可以作为前体合成松弛剂强盘松。目前苯丙醇的制备主要依赖植物提取和化学合成，考虑到植物提取法效率低，化学合成法需要重金属作为催化剂，同时需要氢气作为还原剂，不够环保节能，因此使用微生物发酵法生产苯丙酸成为一种新的选择，具有污染小、耗能少、环境友好的优点。liu以大肠杆菌作为平台进行代谢工程改造，实现了苯丙醇在大肠杆菌中的生物合成[1]。但苯丙醇与前体苯丙酸的合成均为nadh依赖型，反应中存在还原力不足的问题。[1]liu et al.microb cell fact(2021)20:121

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种强化大肠杆菌胞内还原力，增进合成苯丙醇的大肠杆菌工程菌胞内还原力的平衡性，进而增加苯丙醇产量的方法。

2、为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

3、一种平衡苯丙醇合成工程菌胞内还原力的方法，其特征在于，包括：

4、使用大肠杆菌作为宿主菌，异源引入来自植物的酪氨酸解氨酶(tal)和来自细菌的烯酸还原酶(er)基因，以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。

5、进一步的，包括：使用大肠杆菌作为宿主菌，合成酪氨酸解氨酶(tal)和烯酸还原酶(er)基因片段，通过同源重组方法将酪氨酸解氨酶(tal)和烯酸还原酶(er)基因分别连接到高拷贝质粒pze12-luc上，获得pze-tal-er重组质粒；将构建好的质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。

6、进一步的，在摇瓶反应器中以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。

7、进一步的，所述发酵方法包括：

8、在摇瓶反应器加入液体培养基，高温灭菌后接入1％活化后的大肠杆菌工程菌种子液，在温度37℃条件下进行振荡培养。当od600值为0.4-0.6时，加入iptg进行诱导。

9、进一步的，所述液体培养基成分为m9培养基。

10、进一步的，m9培养基的配方是：重量0.5％的酵母粉，重量1％的甘油和重量0.25％的葡萄糖，重量0.2％的甲酸钠，且ph7-7.5。

11、与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

12、本发明针对苯丙醇生产过程中，前体苯丙酸的合成与终产物苯丙醇合成均消耗nadh、从而导致胞内还原力不平衡的重点问题，提出以使nadh再生为策略，引入异源基因甲酸脱氢酶，通过甲酸脱氢酶对甲酸钠的作用，实现辅酶nadh再生，从而提高关键酶的催化效率。通过上述技术方法，本发明能够强化大肠杆菌工程菌胞内还原力的平衡，提高前体苯丙酸与终产物苯丙醇产量，有利于降低生产成本。

技术特征：

1.一种平衡苯丙醇合成工程菌胞内还原力的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：使用大肠杆菌作为宿主菌，合成酪氨酸解氨酶(tal)和烯酸还原酶(er)基因片段，通过同源重组方法将酪氨酸解氨酶(tal)和烯酸还原酶(er)基因分别连接到高拷贝质粒pze12-luc上，获得pze-tal-er重组质粒；将构建好的质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在摇瓶反应器中以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵方法包括：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述液体培养基成分为m9培养基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，m9培养基的配方是：重量0.5％的酵母粉，重量1％的甘油和重量0.25％的葡萄糖，重量0.2％的甲酸钠，且ph7-7.5。

技术总结
一种平衡苯丙醇合成工程菌胞内还原力的方法，包括：以使NADH再生为策略，构建合成苯丙醇的大肠杆菌，并引入异源基因甲酸脱氢酶，通过甲酸脱氢酶对甲酸钠的作用，实现辅酶NADH再生，从而提高关键酶的催化效率。本发明的方法能够强化大肠杆菌工程菌胞内还原力的平衡，提高前体苯丙酸与终产物苯丙醇产量，有利于降低生产成本。

技术研发人员：孙婧
受保护的技术使用者：江苏师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13