一种进行HPV检测或分型的探针及其引物探针组合物的制作方法

本发明涉及一种hpv检测和/或分型方法，特别是涉及一种探针。

背景技术：

1、宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。根据临床数据显示，人乳头状瘤病毒(papillomavirus，hpv)与宫颈癌的发生存在明确的关系，在99.9％的宫颈癌患者中均可检测出人乳头状瘤病毒。

2、hpv是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性。hpv可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。hpv属双链闭环的小dna病毒，包含约8000个碱基对分为3个功能区。早期转录区(e区)主要控制病毒的复制和转化功能；晚期转录区(l区)编码病毒的衣壳蛋白；长控制区(lcr区)包含复制起始区和复制转录控制元件。20世纪80年代，德国病毒学家harald zur hausen教授首次提出hpv病毒与宫颈癌发病相关的假说之后，经过20多年的科学研究，国际癌症研究所在1995年正式确认，高危型hpv持续感染是宫颈癌的主要病因。依照who国际癌症研究机构(iarc)的研究成果，hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73等15种基因型在2005年的专题讨论会议上被正式认定为高危型。

3、因此，检测宫颈细胞样本中人乳头瘤状病毒(hpv)的存在与具体基因型，成为宫颈癌预防及治疗的一种普遍早期诊断方法。目前检测人乳头瘤病毒dna大多选择的靶点为e6、e7区或者l1区。其中l1区是区分不同亚型的主要依据根据l1区基因序列差异，可将hpv分为不同亚型。

4、荧光实时定量pcr是检测病原体核酸应用最广泛的方法，它利用特异性或通用引物对目的片段进行扩增并与特异性荧光标记的探针杂交或通过荧光染料与pcr产物结合，连续监测探针或荧光染料产生的荧光信号的变化，通过在pcr指数扩增其间的荧光信号强弱来测定特异性产物的量，从而推断目的基因的初始量。

5、其中用到的taqman荧光探针是一段序列特异的、荧光标记的寡核苷酸，其5’端标记一个报告荧光基团(reporter，r)，一般为fam、vic、hex、tet等荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团(quencher，q)，一般为tamra、bhq1或bhq2等。taqman探针法qpcr的原理是在pcr扩增时加入一对引物的同时另外加入一条特异性的taqman荧光探针，该探针与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。当探针完整时，报告荧光基团和淬灭荧光基团的空间距离很近，报告荧光基团发射的荧光信号会被淬灭荧光基团吸收，使仪器检测不到荧光信号。在pcr延伸阶段，taq dna聚合酶沿着模板链从5’到3’的方向合成新链，当taq dna聚合酶到达探针结合位点时，taq dna聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性将探针5’端连接的报告荧光基团切割下来，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光，切割的荧光分子数与pcr产物的数量成正比，因此，通过检测pcr反应体系中的荧光强度可以达到检测pcr产物扩增量的目的。

6、虽然taqman探针法有众多优点，但也有明显的局限性最关键的问题就是其探针的设计难度大,限制性因素多。各探针之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在。特别是在多重体系扩增的时候，各探针之间随着个数增多设计难度加大，整体扩增效率可能由于探针的设计不完美而大大降低。

7、另外，探针合成费用较贵，实验成本较高。

8、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种进行hpv检测和/或分型的探针及其使用方法。该探针能提高整体扩增效率，减少二聚体、二级结构、非特异性扩增产物生成的概率，减少探针合成成本。

2、本发明是这样实现的：

3、本发明实施例提供一种进行hpv检测和/或分型的探针：包括以下探针的一种或多种：

4、探针1具有包含seq id no:1的核酸序列或其互补序列；

5、探针2具有包含seq id no:2的核酸序列或其互补序列；

6、探针3具有包含seq id no:3的核酸序列或其互补序列；

7、探针4具有包含seq id no:4的核酸序列或其互补序列。

8、在一些实施方式中，上述探针还包括以下探针的一种或两种：

9、探针5具有包含seq id no:5的核酸序列或其互补序列；

10、探针6具有包含seq id no:6的核酸序列或其互补序列。

11、本发明实施例还提供了一种hpv检测和/或分型的引物与探针组合。

12、本发明实施例还提供了一种hpv检测和/或分型的试剂盒，包含上述的探针或引物与探针组合。

13、本发明实施例还提供了一种标记探针或标记探针与引物组合，包括上述的探针或探针与引物组合，探针5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。具体地，所述报告荧光基团为fam、vic、hex、tet、rox、cy5或cy3，所述淬灭荧光基团为tamra、bhq1或bhq2。

14、本发明实施例还提供了上述的探针、引物与探针组合、标记探针或标记探针与引物组合在制备hpv检测和/或分型的试剂盒中的应用。

15、可选地，hpv分型选自33、52、58、39、45、68、56、66、31、35、51或59；

16、可选地，hpv分型选自33、52、58；可选地，hpv分型选自39、45、68；可选地，hpv分型选自56、66；可选地，hpv分型选自31、35。

17、本发明实施例还提供了一种hpv检测和/或分型的方法，包含将上述的探针、引物与探针组合、标记探针或标记探针与引物组合，与待测核酸反应的步骤。

18、本发明实施例还提供了一种筛查或辅助诊断宫颈癌的试剂盒，其包括上述的探针、引物与探针组合、标记探针或标记探针与引物组合。

技术特征：

1.一种进行hpv检测和/或分型的探针，其特征在于：包括以下探针的一种或多种：

2.如权利要求1所述的探针，其特征在于：还包括以下探针的一种或两种：

3.一种hpv检测和/或分型的引物与探针组合，其特征在于：包括以下引物与探针组合的至少一种：

4.如权利要求3所述的引物与探针组合，其特征在于：还包括以下引物与探针组合的至少一种：

5.如权利要求3或4所述的引物与探针组合，其特征在于：

6.标记探针或标记探针与引物组合，包括权利要求1或2所述的探针或如权利要求3-5任一项所述的探针与引物组合，其特征在于，探针5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团；

7.如权利要求1或2所述的探针、权利要求3-5任一项所述的探针与引物组合、或权利要求6所述的标记探针或标记探针与引物组合在制备hpv检测和/或分型的试剂盒中的应用；

8.一种hpv检测和/或分型的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的探针、权利要求3-5任一项所述的探针与引物组合、或权利要求6所述的标记探针或标记探针与引物组合。

9.一种hpv检测和/或分型的方法，其特征在于，包括将权利要求1或2所述的探针、权利要求3-5任一项所述的探针与引物组合、或权利要求6所述的标记探针或标记探针与引物组合，与待测核酸反应的步骤；

10.一种筛查或辅助诊断宫颈癌的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的探针、权利要求3-5任一项所述的探针与引物组合、或权利要求6所述的标记探针或标记探针与引物组合。

技术总结
本发明公开了一种进行HPV检测和/或分型的探针的具体序列；还提供了一种基于荧光实时定量PCR进行HPV检测和/或分型的引物与探针组合。该探针能提高整体扩增效率，减少二聚体、二级结构、非特异性扩增产物生成的概率，减少探针合成成本。

技术研发人员：黄菁,徐璨
受保护的技术使用者：广东菲鹏生物有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13