一种杆状链霉菌及其使用方法与流程

1.本发明属于土壤环境治理领域，特别涉及一种降解秸秆的杆状链霉菌及其使用方法。


背景技术：

2.秸秆直接打碎还田，在自然环境中不易腐化，同时，秸秆直接粉碎还田会同作物争水争肥，给农业生产带来不利影响，影响春耕。开发添加外源微生物促进秸秆原位腐化的菌剂就有非常重要意义。
3.目前能够降解秸秆的菌种有很多种，中国申请号201810941807.3，含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂及应用，采用的是6种菌的混合菌剂。中国申请号cn201710804153.5，地衣芽孢杆菌在秸秆降解中的应用、包含该菌的微生物菌剂及其应用，发酵温度为18℃-30℃。
4.中国申请号cn202110217463.3一种低温高效玉米秸秆降解菌剂的制备方法及应用，本发明所述菌剂由2个单株细菌组配而成，2个单株细菌分别为假单胞菌(pseudomonas sp.)和不动杆菌(acinetobacter sp.)。
5.中国申请号cn201910433174.x一株高温秸秆降解细菌b-8，分类命名为土芽孢杆菌geobacillus sp.。细菌b-8能产生有关降解纤维素和半纤维素的酶类，将农作物秸秆中的大分子物质转化为可供植物吸收利用的小分子物质，实现高温条件下农业废弃物的资源化利用。实验表明，水稻秸秆接种b-8菌剂后，75℃、170r/m液体发酵培养7d，水稻秸秆的降解率为17.67％。
6.但是由于环境温度或菌体生长速度的限制，这些现有技术中的菌种对秸秆的降解效果尚有待提高，或者有时需要采用混合菌剂。


技术实现要素：

7.本发明的目的开发能够单独使用的降解秸秆效果较好的菌种，提供了一种杆状链霉菌及其使用方法。
8.为了实现本发明的目的，本发明的技术方案之一为，一种杆状链霉菌(streptomyces bacillaris)，编号s381-2，保藏编号cgmcc no.23569，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间2021年10月11日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
9.菌种培养：采用高氏一号培养基。
10.本发明的技术方案之二为，一种杆状链霉菌的使用方法，为s381-2杆状链霉菌降解秸秆。
11.进一步的，上述杆状链霉菌的使用方法，方法之一为：
12.在培养瓶中加入液态发酵液和粉碎的秸秆，然后接入s381-2杆状链霉菌菌悬液，在20～25℃的振荡培养箱中培养10～20天。
13.进一步的，上述使用方法，所述液态发酵液、秸秆和菌悬液的比例为：90～100ml：4～6g：2～6ml。
14.进一步的，上述使用方法，杆状链霉菌菌悬液的浓度为1～9
×
107个/ml。
15.进一步的，上述使用方法，所述液体发酵培养液为：每3000ml去离子水中加入蛋白胨5～6g，mgso4.7h2o 1.2～1.5g，kh2po
4 2.5～3.0g，nacl 1.2～1.5g/l，cacl
2 0.4～0.6g，酵母膏1.2～1.5g，并将溶液ph调至6.8～7.2。
16.进一步的，上述杆状链霉菌的使用方法，方法之二，包括如下步骤：
17.1)取秸秆与含有s381-2杆状链霉菌的液态发酵液混合均匀；
18.2)将混合了上述发酵液的秸秆堆制成条垛状，上覆塑料布；
19.3)控制初期发酵温度在28～30℃之间，含水率在50～55％之间，当秸秆堆内部温度达到55℃时，掀开塑料布通风，使其与外界空气接触1～2h，然后盖上塑料布继续堆腐发酵，每隔四至五天通风一次，每次1～2h，直至堆腐物颜色变为黑褐色、手感变软。
20.进一步的，上述使用方法，秸秆与液态发酵液的比例为100kg：2～3l。
21.进一步的，上述使用方法，液态发酵液中杆状链霉菌的浓度为1～9
×
107个/ml。
22.与现有技术相比，本发明的优势在于：
23.本发明的杆状链霉菌对秸秆的降解能力较好，单一菌种对秸秆降解率20天达到35％。
24.说明书附图
25.图1、杆状链霉菌(1000
×
)图片。
具体实施方式
26.实施例1
27.杆状链霉菌的分离纯化选育方法，包括如下步骤：
28.1、获取目标菌株：无菌室，超净工作台上，称量20份铁尾矿改良后的盐碱土土样，均匀的铺在培养皿内部，琼脂水培养基培养，将培养皿放入15℃-45℃培养箱中分别培养一周。
29.2、纯化目标菌株：无菌室，超净工作台上，将目标菌株肉眼可见菌落，分离划线到基本培养基(nacl 0.25g；k2hpo
3 0.25g；mgso
4 0.25g；kno
3 0.5g；feso
4 0.005g；可溶性淀粉10g；琼脂8g；水500ml)，平皿中，15℃-45℃培养箱分别培养24小时。
30.3、目标菌株确证：无菌室，超净工作台上，采用秸秆水98％、琼脂2％培养基，纯化目标菌株中分离的单菌落划线接种，将其分别放入15℃-45℃、培养箱分别进行培养。
31.4、目标菌株驯化：铁尾矿改良土壤、秸秆铺满平皿，1.5％琼脂水培养基培养，将确证后菌株接种到培养基上。
32.5、将分离到的微生物再次筛选，得到纯化菌株。
33.s381-2杆状链霉菌为白色粉末状菌落，革兰氏染色阳性，生理生化鉴定不产酸也不产气，产生淀粉水解酶，可以把硝酸盐还原成亚硝酸盐，不产生色氨酸酶分解色氨酸，该菌种不可产生丙酮酸，葡萄糖产酸少，不能利用柠檬酸盐，不产生过氧化氢酶。杆状链霉菌(1000
×
)图片见图1。
34.实施例2
35.s381-2杆状链霉菌酶活的测定：
36.以葡萄糖溶液的含量作为横坐标，以od值作为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线方程。
37.粗酶液的提取：将所筛s381-2菌株的14-40小时菌悬液吸取5ml于液体产酶培养液中培养，于4000r/min离心10min，弃沉淀，余下上清液即为粗酶液，用于后续操作。
38.滤纸酶活力的测定(fpa酶活测定)：各试管中加入0.5ml粗酶液和1.5ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，在各个空白组中加入1.5ml的3，5-二硝基水杨酸试剂(dns试剂)，钝化空白组酶活，终止酶反应。将试管混匀后放到50℃的水浴锅中水浴5～10分钟。然后将准备好的0.05g的卷好的滤纸条放各个试管中，保温1h后取出，立即向实验组的试管中加上1.5ml的3，5-二硝基水杨酸试剂，快速终止反应。在试管内溶液完全混匀后，放到100℃的水浴锅中，水浴加热5分钟，时间到后，取出放到冷水中，迅速降温冷却，用去离子水定容至20ml。以空白组做标定，调零，在波长540nm的紫外分光光度计下测定各个的吸光值，记录下结果。
39.根据上述每组三个吸光度的平均值，在葡萄糖标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，计算得出酶活力5.06u/ml。
40.实施例3
41.将粉碎的玉米秸秆用去离子水泡发后，在105℃的烘箱烘干至恒重，在250ml的锥形瓶中加100ml液态发酵液(液体发酵培养液：称量蛋白胨6g，mgs04.7h2o 1.5g，kh2po
4 3.0g，nacl 1.5g/l，cacl
2 0.6g，酵母膏1.5g，煮溶于3000ml去离子水中，(ph7.0)，分装于锥形瓶内，在121℃的高压灭菌锅灭菌30分钟后，备用)，再加入5g干的秸秆，然后接入5mls381-2杆状链霉菌菌悬液(孢子数3.49
×
107/ml)，做五组平行实验，在25℃的振荡培养箱中培养，每四天测一次，计算秸秆前后重量的差值来算出秸秆的平均降解率。4天：11.26％，8天：20.21％，12天：28.94％，16天：31.76％，20天：34.96％。
42.实施例4
43.s381-2杆状链霉菌不同接种量秸秆降解率的实验：
44.将粉碎的玉米秸秆用去离子水泡发后，在105℃的烘箱烘干至恒重，在250ml的锥形瓶中加100ml液态发酵液(同实施例3)，再加入5g干燥的玉米秸秆，按液态发酵液的质量比2％、3％、4％、5％、6％接入降解秸秆的菌悬液(孢子数3.49
×
107/ml)，做五组平行实验，在25℃的振荡培养箱中培养16天，水洗除去菌体及可溶物，测定秸秆的平均降解率。接入质量比为2％、3％、4％、5％、6％的秸秆的降解率37.30％、38.10％、38.60％、39.30％、39.10％。
45.实施例5
46.取秸秆1吨，将上述经过优化培养后获得的s381-2菌发酵液(孢子数3.49
×
107/ml)共计25升，加到物料中混合均匀。将混合物料堆制成宽1.5m，高1.2m的条垛状，将混合了上述发酵液的秸秆堆制成条垛状，上覆塑料布；控制初期发酵温度30℃，含水率53％，当秸秆堆内部温度达到55℃时，掀开塑料布通风，使其与外界空气接触1h，然后盖上塑料布继续堆腐发酵，每隔四至五天通风一次，每次1h，直至堆腐物颜色变为黑褐色、手感变软，共计55天。