一种防治烟草青枯病的生物制剂、制备方法和应用与流程

1.本发明涉及烟草青枯病防治技术领域，尤其涉及一种防治烟草青枯病的生物制剂、该制剂的制备方法和应用。


背景技术：

2.烟草(学名：nicotiana tabacum)属于茄科，一年生草本植物。烟草种植中，青枯病的发生比较严重，影响着烟草的整个生育期。烟草青枯病是由青枯雷尔氏杆菌引起的一种维管束细菌性土传病害，对烟草种植业造成了巨大的经济损失。目前尚无防治烟草青枯病的特效药剂。
3.大量研究表明，烟草青枯病的防治首先需选择种植抗病品种；移栽时用55％敌克松可湿性粉剂350-400克/亩穴施；最后在发病期结合化学药剂进行防治。但随着化学农药的长期使用，农药残留及环境污染问题愈发严重，且长期使用化学农药会导致土壤中适宜烟株生长的微生物群落种群密度降低，影响土壤微生物群落的平衡，导致烟株的生长发育受到不同程度的影响。
4.生物防控及生态防控近几年得到广泛重视，生物防控主要是利用有益微生物与病原菌的拮抗或竞争作用降低病原对植株的侵染，而生态防控主要通过诱导土壤中的有益微生物的种群数量增加，从而通过竞争等作用实现对土传病害的防治。因此，急需研究开发新的防治烟草青枯病的生物防控技术。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提出一种防治烟草青枯病的生物制剂、制备方法和应用，解决了现有技术中采用化学农药防控烟草青枯病，存在农药残留及环境污染的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
6.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明防治烟草青枯病的生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
8.以枯草芽孢杆菌yws-20-2072为菌种，将菌种进行活化；
9.将枯草芽孢杆菌yws-20-2072菌种进行培养，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072一级种子液；
10.将枯草芽孢杆菌yws-20-2072一级种子液进行培养，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072二级种子液；
11.将枯草芽孢杆菌yws-20-2072二级种子液进行培养，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072发酵液，枯草芽孢杆菌yws-20-2072发酵液即为防治烟草青枯病的生物制剂。
12.本发明的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，其编号为yws-20-2072，保藏登记号为cgmcc no.20200，保藏日期2020年07月06日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
13.根据一个优选实施方式，以枯草芽孢杆菌yws-20-2072为菌种，将菌种进行活化包
括如下步骤：将﹣80℃保存的枯草芽孢杆菌yws-20-2072接种在液体lb培养基上，36℃培养12h，得活化的枯草芽孢杆菌yws-20-2072。
14.根据一个优选实施方式，将枯草芽孢杆菌yws-20-2072菌种进行培养，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072一级种子液包括如下步骤：按10％接种量，将活化的枯草芽孢杆菌yws-20-2072接种到一级种子培养基，在培养温度36℃、转速160rpm/min条件下，摇床培养24h，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072一级种子液。
15.根据一个优选实施方式，所述一级种子培养基为液体lb培养基，并且所述一级种子培养基的ph为7.0～8.0。
16.根据一个优选实施方式，将枯草芽孢杆菌yws-20-2072一级种子液进行培养，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072二级种子液包括如下步骤：按1％接种量，将枯草芽孢杆菌yws-20-2072一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在35℃～38℃，转速100rpm/min，通气量为1500l/h，罐压保持在0.04mpa～0.06mpa条件下培养24h，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072二级种子液。
17.根据一个优选实施方式，所述二级种子培养基包括以下质量分数计的组分：黄豆粉1.5
‰
，蔗糖3
‰
，蛋白胨2
‰
，玉米粉3
‰
，鱼粉2
‰
，硫酸铵0.4
‰
，硫酸镁0.3
‰
，磷酸二氢钾0.3
‰
，磷酸氢二钾0.03
‰
，硫酸锰0.02
‰
，余量为水，ph为7.0～8.0。
18.根据一个优选实施方式，将枯草芽孢杆菌yws-20-2072二级种子液进行培养，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072发酵液包括如下步骤：按1％接种量，将枯草芽孢杆菌yws-20-2072二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在35℃～38℃，转速110rpm/min，通气量为13m3/h、罐压保持在0.06mpa条件下培养46h～48h，培养后的发酵液中枯草芽孢杆菌yws-20-2072的有效活菌数不小于1
×
10
10
cfu/ml时停止发酵，所得发酵液即为枯草芽孢杆菌yws-20-2072发酵液。
19.根据一个优选实施方式，所述发酵培养基包括以下质量分数计的组分：黄豆粉1.5
‰
，蔗糖3
‰
，蛋白胨2
‰
，玉米粉3
‰
，鱼粉2
‰
，硫酸铵0.4
‰
，硫酸镁0.3
‰
，磷酸二氢钾0.3
‰
，磷酸氢二钾0.03
‰
，硫酸锰0.02
‰
，余量为水，ph为7.0～8.0。
20.本发明防治烟草青枯病的生物制剂，是采用本发明中任一项技术方案所述的防治烟草青枯病的生物制剂的制备方法制得的。
21.本发明防治烟草青枯病的生物制剂在烟草种植中的应用，分别在烟草移栽期后7天和旺长期后7天，将防治烟草青枯病的生物制剂稀释后施加。
22.本发明提供的防治烟草青枯病的生物制剂、制备方法和应用至少具有如下有益技术效果：
23.本发明防治烟草青枯病的生物制剂，是以枯草芽孢杆菌yws-20-2072为菌种，经种子活化和至少三级培养后得到的枯草芽孢杆菌yws-20-2072发酵液，一方面，本发明防治烟草青枯病的生物制剂可对烟草土传病害青枯病进行有效防控，能够在很大程度上减少化学农药的施用量，减少环境污染，提高作物安全性；另一方面，本发明防治烟草青枯病的生物制剂，还可促进植株生长；第三方面，本发明防治烟草青枯病的生物制剂的制备方法简单易行，生产成本低。
24.本发明防治烟草青枯病的生物制剂的应用，在烟草种植过程中，分别在烟草移栽期后7天和旺长期后7天，将防治烟草青枯病的生物制剂稀释后施加，可防治烟草土传病害
青枯病，同时也可促进植株生长，还可大大减少化学农药的施用量，减少环境污染，提高作物安全性。
25.即本发明防治烟草青枯病的生物制剂、制备方法和应用，解决了现有技术中采用化学农药防控烟草青枯病，存在农药残留及环境污染的技术问题。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1是实施例1中筛选出的菌株对烟草青枯病病原菌的抑菌活性测试结果图；
28.图2是温度对枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂效果的影响结果图。
具体实施方式
29.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
30.下面结合实施例1～4对本发明进行详细说明。
31.实施例1
32.本实施例对本发明的枯草芽孢杆菌yws-20-2072的获得和鉴定进行说明。
33.1、本发明枯草芽孢杆菌yws-20-2072的获得方法
34.1.1、材料
35.常年种烟区，健康烟株根际土壤。
36.将lb固体培养基和na培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成平板。lb固体培养基用于分离和保存内生细菌，na培养基用于培养烟草青枯病病原菌和拮抗细菌，以检测病菌的活性。
37.1.2、分离培养
38.采用系列梯度稀释法和平板涂布法对土壤中的细菌进行分离，随机挑取形态不同的菌落进行纯化培养并保存。
39.1.3、拮抗内生细菌筛选
40.采用点接法对土壤中分离、纯化后的菌株进行初筛。将牛肉膏蛋白胨固体培养基冷却至45℃左右，将浓度为1
×
106cfu/ml的烟草青枯病病原菌菌悬液按1％的量加入后摇匀制备成平板，用接种环在每个平板上均匀点接参试菌株，并置于恒温培养箱中，35℃培养48h后观察并测定抑菌圈直径，每个处理重复3次，选取抑菌圈明显的菌株进行抑菌活性测定。测试结果如图1所示。
41.1.4、拮抗细菌对病菌的活性检测
42.采用牛津杯法检测拮抗细菌对病菌的活性。具体的：取3ml烟草青枯病病原菌菌悬液(1
×
106cfu/ml)，与60ml融化的冷却至45℃的na培养基充分混合均匀，制成含烟草青枯
病病原菌的培养基；平板边缘各距中心2.5cm处放置牛津杯(孔直径为6mm)，吸取80μl待测活性物质于牛津杯孔内，以无菌na培养基为对照。置于35℃恒温培养箱中培养，48h后用游标卡尺测定抑菌圈大小。每个处理重复3次。
43.2、枯草芽孢杆菌yws-20-2072的鉴定
44.从16srdna序列相似性比对分析结果和系统发育树可知，yws-20-2072与菌株bacillus methylotrophicus(甲基营养型芽孢杆菌)、bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽胞杆菌)亲缘关系最近，同源性最高，相似度均达99％，根据系统发育树相似性和同源性分析，菌株yws-20-2072和bacillus subtilis位于同一分支，两者进化关系和距离最近，相似度达100％，结合形态特征、培养特征和生理生化特征，鉴定此菌株为枯草芽胞杆菌。
45.实施例2
46.本实施例对本发明防治烟草青枯病的生物制剂进行说明。
47.本实施例防治烟草青枯病的生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
48.s1：以枯草芽孢杆菌yws-20-2072为菌种，将菌种进行活化。具体的，将﹣80℃保存的枯草芽孢杆菌yws-20-2072接种在液体lb培养基上，36℃培养12h，得活化的枯草芽孢杆菌yws-20-2072。
49.s2：将枯草芽孢杆菌yws-20-2072菌种进行培养，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072一级种子液。具体的，按10％接种量，将活化的枯草芽孢杆菌yws-20-2072接种到一级种子培养基，在培养温度36℃、转速160rpm/min条件下，摇床培养24h，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072一级种子液。
50.优选的，一级种子培养基为液体lb培养基，并且一级种子培养基的ph为7.0～8.0。
51.s3：将枯草芽孢杆菌yws-20-2072一级种子液进行培养，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072二级种子液。具体的，按1％接种量，将枯草芽孢杆菌yws-20-2072一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在35℃～38℃，转速100rpm/min，通气量为1500l/h，罐压保持在0.04mpa～0.06mpa条件下培养24h，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072二级种子液。
52.优选的，二级种子培养基包括以下质量分数计的组分：黄豆粉1.5
‰
，蔗糖3
‰
，蛋白胨2
‰
，玉米粉3
‰
，鱼粉2
‰
，硫酸铵0.4
‰
，硫酸镁0.3
‰
，磷酸二氢钾0.3
‰
，磷酸氢二钾0.03
‰
，硫酸锰0.02
‰
，余量为水，ph为7.0～8.0。
53.s4：将枯草芽孢杆菌yws-20-2072二级种子液进行培养，得枯草芽孢杆菌yws-20-2072发酵液，枯草芽孢杆菌yws-20-2072发酵液即为防治烟草青枯病的生物制剂。具体的，按1％接种量，将枯草芽孢杆菌yws-20-2072二级种子液接种到发酵罐内的发酵培养基，在35℃～38℃，转速110rpm/min，通气量为13m3/h、罐压保持在0.06mpa条件下培养46h～48h，培养后的发酵液中枯草芽孢杆菌yws-20-2072的有效活菌数不小于1
×
10
10
cfu/ml时停止发酵，所得发酵液即为枯草芽孢杆菌yws-20-2072发酵液。
54.优选的，发酵培养基包括以下质量分数计的组分：黄豆粉1.5
‰
，蔗糖3
‰
，蛋白胨2
‰
，玉米粉3
‰
，鱼粉2
‰
，硫酸铵0.4
‰
，硫酸镁0.3
‰
，磷酸二氢钾0.3
‰
，磷酸氢二钾0.03
‰
，硫酸锰0.02
‰
，余量为水，ph为7.0～8.0。
55.s5：枯草芽孢杆菌yws-20-2072发酵液分瓶包装。
56.实施例3
57.本实施例对采用实施例2的方法制得的防治烟草青枯病的生物制剂对烟草青枯病的防治效果进行说明。
58.通过实施例2的方法制得的防治烟草青枯病的生物制剂，以下简称枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂。
59.1、枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂对烟草青枯病的防治效果
60.1.1、材料与方法
61.室内拮抗活性检测：采用牛津杯法：取3ml烟草青枯病病原菌菌悬液(1
×
106cfu/ml)，与60ml融化的冷却至45℃的na培养基充分混合均匀，制成含烟草青枯病病原菌的培养基；平板边缘各距中心2.5cm处放置牛津杯(孔直径为6mm)，吸取0.1ml待测活性物质于牛津杯孔内，以无菌na培养基为对照。置于35℃恒温培养箱中培养，48h后用游标卡尺测定抑菌圈大小。每个处理重复3次
62.1.2、试验结果
63.试验结果如图2所示。通过拮抗活性试验发现，枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂对烟草青枯病病原菌的生长有强烈抑制作用，且枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂经过不同时间热处理仍对烟草青枯病病原菌具有良好的抗性。具体的：a为枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂未进行热处理时，枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂的抑菌圈直径为19.52mm；b为枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂50℃处理30min，抑菌圈直径为19.29mm；c为枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂﹣4℃处理30min，抑菌圈直径分别为18.75mm。由此说明，枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂具冷热稳定性。
64.实施例4
65.本实施例对枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂对烟草青枯病的田间防治效果验证
66.2021年在曲靖麒麟区进行小区试验，试验选择在2020年青枯病发病重的地块进行，烟草品种为红花大金元，分别在移栽期后7天、旺长期后7天进行2次施药，每次间隔一周，处理分别为枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂稀释200倍、以75％农用链霉素为药剂对照，以清水为空白对照，每个处理3次重复，小区随机排列，管理同一般大田。
67.处理前分别在处理区和对照区以随机10点取样，调查田间病株率。发病高峰期对发病植株进行病情调查，计算发病率药前、药后的病情指数及防治效果。按照gb-t23222-2008烟草病虫害分级及调查方法进行。
68.病情分级标准如下：
69.0级：全株无病斑；
70.1级：病斑面积占整叶面积1％以下；
71.3级：病斑面积占整叶面积2％-5％；
72.5级：病斑面积占整叶面积6％-10％；
73.7级：病斑面积占整叶面积11％-20％；
74.9级：病斑面积占整叶面积21％以上。
75.统计结果如下表1和表2所示：
76.表1植株发病率统计结果表
[0077][0078][0079]
表2不同处理对青枯病的防治效果统计结果表
[0080][0081][0082]
从表1和表2可以看出，小区试验中，枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂稀释200倍使用可降低烟草青枯病的发病率，枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂稀释200倍对烟草青枯病的防治效果分别为79.35％、71.44％、73.01％，均比常用的农用链霉素的防治效果好，远优于清水对照组，表明枯草芽孢杆菌yws-20-2072制剂对烟草青枯病具有良好的防治效果，有着较好的应用前景。
[0083]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。