复合支架材料

1.本发明涉及非哺乳动物(例如牛蛙、鱼等)皮肤来源的胶原蛋白、磷酸钙的用途，包含它们的材料，以及上述材料的用途。


背景技术：

2.在本说明书中列出或讨论先前发表的文件不一定被视为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
3.近年来，由于全球人口快速增长的需求，水产养殖一直是增长最快的食品生产部门之一。然而，食品生产的增加导致废物和副产品生成大幅增加。值得注意的是，水产养殖生产的养殖物种的生物质中仅30-50％用于直接人类消耗。被回收的水产养殖支流目前出于低价值目的而被使用，诸如动物饲料或经济价值低的堆肥材料(j.-k.kim,fish.aquat.sci.2011,14,230-233；以及i.s.arvanitoyannis等人,int.j.food sci.technol.2008,43,726-745)，而副产品诸如鳍、鳞、皮和内脏每年以超过2000万吨的数量被丢弃(m.govindharaj等人,j.clean.prod.2019,230,412-419；以及g.caruso,j.fisheriessciences.com 2015,9,80-83)。尽管已经采取了各种预防措施来减少废物的产生，但大多数废物通过填埋或焚烧处理，这对环境不友好，也不经济。
4.为了最大限度地再利用资源并最大限度地减少废物产生，需要加强增值工作以生产高价值产品。大量的水产养殖副产品实际上含有许多有价值的生物活性化合物，诸如肽、胶原蛋白、脂质和磷酸钙，这些化合物可能被用于高价值的生物医学应用(p.ideia等人,waste biomass valor.2020,11,3223-3246；以及c.bai等人,acs sustain.chem.eng.2017,5,7220-7227)。因此，近年来为生产高质量生物材料而减少和评估水产养殖相关活动产生的废物的工作获得了显著的推动力(g.k.pal等人,innov.food sci.emerg.technol.2016,37,201-215；以及c.xu等人,chem.soc.rev.2019,48,4791-4822)，并且“废物资源化”范式已成为加强废物管理工作的一种有吸引力的方法(k.l.ong等人,bioresour.technol.2018,248,100-112；以及z.wu等人,environ.sci.technol.2020,54,9681-9692)。
5.骨由两种主要成分组成，即i型胶原蛋白(有机相)和羟基磷灰石(ha)(无机相)。一般来说，理想的骨组织工程支架材料应该是：
6.(i)本质上无毒以确保良好的生物相容性；
7.(ii)与能够模拟宿主组织的生物物理和生化复杂性的加工技术兼容；
8.(iii)多孔以优化细胞浸润和营养/代谢废物的交换；
9.(iv)在生理负荷条件下具有足够的机械强度；
10.(v)机械和结构稳定以承受载荷；以及
11.(vi)骨传导性或骨诱导性以支持“整复原状”恢复。
12.参见例如t.ghassemi等人,arch.bone jt.surg.2018,6,90；k.glenske等人,int.j.mol.sci.2018,19,826；f.baino.(2017)；scaffolds in tissue engineering:
materials,technologies and clinical applications.bod
–
books on demand；以及x.zhang等人,acs sustain.chem.eng.2020,8,2106-2114。
13.一种用于生产资源节约型生物活性材料的废物资源化方法是从生物废物中收获天然ha，诸如用于骨组织工程的蛋壳、鱼鳞和贻贝壳(s.-l.bee等人,ceram.int.2020,46,17149-17175；k.ronan等人,acs sustain.chem.eng.2017,5,2237-2245；以及y.y.chun等人,macromol.biosci.2016,16,276-287)。另一著名的研究方向是将鱼废物诸如鱼皮和鱼鳞转化为用于软组织工程的胶原蛋白，包括皮肤和淋巴管再生(j.k.wang等人,acta biomater.2017,63,246-260；以及a.afifah等人,iop conf.ser.:earth environ.sci.2019,335,012031)。然而，目前的胶原蛋白提取方法收率低，处理时间长。此外，由于潜在的传染病风险，消费者经常拒绝使用由牛胶原蛋白制成的产品(c.h.theng等人,int.j.adv.sci.eng.inf.technol.2018,8,832-841)。
14.因此，需要找到将水产养殖废物转化为适用于各种应用的高价值产品的新方法。这些应用可包括例如组织工程产品等。


技术实现要素：

15.令人惊讶地发现，可以将水产养殖废物转化为适用于组织工程的高价值材料。特别是，令人惊讶地发现，可以从非哺乳动物皮来源的胶原蛋白(例如来自牛蛙皮)和磷酸钙颗粒的组合中产生具有优异性能的复合支架材料。从水产养殖废物中产生胶原蛋白和磷酸钙的相关方法使支架既环保又经济可行。
16.1.一种复合支架材料，包括：
17.由非哺乳动物胶原蛋白和交联剂形成的交联聚合物基质和由经历了自交联的非哺乳动物胶原蛋白形成的交联聚合物基质中的之一或二者；以及
18.分布在所述交联聚合物基质内的多个磷酸钙颗粒，其中所述复合支架材料是多孔的。
19.2.根据条款1所述的复合支架材料，其中所述交联剂是药学上可接受的交联剂。
20.3.根据条款1或条款2所述的复合支架材料，其中所述交联剂选自由以下组成的组中的一个或多个：京尼平和包含两个或更多个选自由氨基、羧酸、酯、醛和环氧官能团组成的组的可交联官能团的化合物(例如，所述交联剂选自包含两个或更多个选自由醛和环氧官能团组成的组的可交联官能团的化合物)。
21.4.根据前述条款中任一项所述的复合支架材料，其中所述交联剂选自包含两个可交联官能团的化合物，任选地其中所述交联剂选自由戊二醛和1,4-丁二醇二缩水甘油醚组成的组中的一种或多种(例如所述交联剂是1,4-丁二醇二缩水甘油醚)。
22.5.根据前述条款中任一项所述的复合支架材料，其中当所述交联聚合物基质由经历了自交联的非哺乳动物胶原蛋白形成时，所述非哺乳动物胶原蛋白已经由转谷氨酰胺酶交联。
23.6.根据前述条款中任一项的复合支架材料，其中当存在时，所述交联剂由3至15wt％诸如8至10wt％的由非哺乳动物胶原蛋白和交联剂形成的所述交联聚合物基质形成。
24.7.根据前述条款中任一项所述的复合支架材料，其中所述磷酸钙颗粒具有的直径
为10nm至20μm，诸如50nm至10μm，诸如500nm至3μm，任选地其中所述磷酸钙颗粒具有的直径为0.5至20μm，诸如1至10μm，诸如1.5至3μm，诸如约1.6μm。
25.8.根据前述条款中任一项所述的复合支架材料，其中所述磷酸钙颗粒是羟基磷灰石，任选地其中所述羟基磷灰石是单相羟基磷灰石。
26.9.根据条款8所述的复合支架材料，其中所述羟基磷灰石来源于鱼鳞，任选地其中所述鱼鳞来自蛇头鱼和/或来源于真骨鱼类的骨鳞(elasmoid scale)。
27.10.根据前述条款中任一项所述的复合支架材料，其中所述非哺乳动物胶原蛋白是i型胶原蛋白。
28.11.根据前述条款中任一项所述的复合支架材料，其中所述非哺乳动物胶原来源于牛蛙皮，任选地其中所述牛蛙属于蛙属(例如所述牛蛙是美国牛蛙物种(rana catesbeiana))。
29.12.根据前述条款中任一项所述的复合支架材料，其中所述复合支架材料具有的孔隙率为90至99％，诸如93至98.5％，诸如95至98％。
30.13.根据前述条款中任一项所述的复合支架材料，其中以下中的一项或多项适用：
31.(ai)所述复合支架材料具有的压缩模量为0.5至4.5kpa，诸如1.0至4.2kpa，诸如1.9至4kpa，诸如2.5至4kpa，诸如3至3.5kpa；
32.(aii)所述复合支架材料进一步涂覆有磷酸钙颗粒，任选地其中所述磷酸钙是羟基磷灰石(例如，所述羟基磷灰石是单相羟基磷灰石)；以及
33.(aiii)在经受1
×
磷酸盐缓冲盐水的8天后超过50％的所述复合支架材料降解，并且所述降解通过二喹啉甲酸(bca)蛋白质测定试剂盒测量。
34.14.根据条款1至13中任一项所述的复合支架材料在制造用于有需要的受试者的组织工程的药物中的用途。
35.15.根据条款1至13中任一项所述的复合支架材料，其用于有需要的受试者的组织工程中。
36.16.一种组织工程方法，包括向有需要的受试者提供适量的根据条款1至13中任一项所述的复合支架材料的步骤。
37.17.一种体外组织工程的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
38.(bi)供应根据条款1至13中任一项所述的复合支架材料；
39.(bii)将细胞和合适的细胞营养混合物添加至所述复合支架材料；以及
40.(biii)允许所述细胞在所述复合支架材料上生长一段时间。
41.18.根据条款14所述的用途、根据条款15所述的复合支架材料、根据条款16所述的方法和根据条款17所述的方法，其中组织工程是骨组织工程。
42.19.一种从非哺乳动物来源提供胶原蛋白前体混合物的方法，所述方法包括以下步骤：
43.(a)在酸性溶剂中提供来自非哺乳动物的预处理的皮的混合物；以及
44.(b)使所述混合物经受机械混合以提供糊状物形式的所述胶原蛋白前体混合物。
45.20.根据条款19所述的方法，其中以下中的一项或多项适用：
46.(ci)所述酸性溶剂是乙酸水溶液，任选地其中所述乙酸水溶液具有的摩尔浓度为0.1至1m，诸如0.3至0.7m，诸如约0.5m；
47.(cii)所述酸性溶剂以0.1:10至2:10，诸如1:10的重量与体积比提供，其中重量是指所述来自非哺乳动物的预处理的皮的重量以及体积是指所述酸性溶剂的体积；
48.(ciii)混合进行1至20分钟，诸如2至10分钟，诸如约5分钟的时间；以及
49.(civ)混合以20,000至50,000rpm，诸如30,000至40,000rpm，诸如约35,000rpm进行；
50.(cv)整个方法在0.1至10℃，诸如1至5℃，诸如约4℃的温度下进行；
51.(cvi)所述预处理的皮是牛蛙皮，任选地其中所述牛蛙属于蛙属(例如所述牛蛙是美国牛蛙物种)。
52.21.一种从非哺乳动物来源提供胶原蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
53.(aa)提供糊状物形式的胶原蛋白前体混合物；
54.(ab)用水稀释所述糊状物，并将得到的稀释糊状物离心以提供胶原蛋白溶液和包含颜料的团粒并收集所述胶原蛋白溶液；
55.(ac)向所述胶原蛋白溶液中添加无机盐一段时间(例如12至48小时，诸如18至24小时(例如12至18小时))以沉淀出胶原蛋白盐，然后将其离心收集；
56.(ad)将酸性溶剂添加至收集的胶原蛋白盐以提供游离胶原蛋白混合物并将所述游离胶原蛋白混合物经受透析以提供来自非哺乳动物来源的胶原蛋白的溶液。
57.22.根据条款21所述的方法，其中以下中的一项或多项适用：
58.(ba)使用根据条款19所述的方法获得所述胶原蛋白前体混合物；
59.(bb)将所述糊状物用水以1:10至1:30vol/vol，诸如1:10至1:20vol/vol，诸如约1:10vol/vol的比例稀释；
60.(bc)条款21的步骤(ab)中的离心以15,000至50,000
×
g，诸如20,000至35,000
×
g，诸如约25,000
×
g进行；
61.(bd)条款21的步骤(ab)中的离心进行5至45分钟，诸如10至30分钟，诸如约15分钟；
62.(be)条款21的步骤(ac)中的所述无机盐选自硫酸钠、硫酸铵、氯化钾和氯化钠中的一种或多种(例如所述无机盐是氯化钠)，任选地其中所述无机盐作为具有0.5至4.0m，诸如0.5至1.5m，诸如约0.9m的浓度的水溶液提供；
63.(bf)条款21的步骤(ac)中的离心以3,000至10,000
×
g，诸如4,000至6,000
×
g，诸如约5,500
×
g进行；
64.(bd)条款21的步骤(ac)中的离心进行5至45分钟，诸如10至30分钟，诸如约15分钟；
65.(bh)条款21的步骤(ad)中的所述酸性溶剂是乙酸水溶液，任选地其中所述乙酸水溶液具有的摩尔浓度为0.1至1m，诸如0.3至0.7m，诸如约0.5m；
66.(bi)条款21的步骤(ad)中的所述透析分两轮进行，其中：
67.(i)第一轮透析使用浓度为0.01至0.3m，诸如0.05至0.2m，诸如约0.1m的乙酸水溶液；以及
68.(ii)第二轮透析使用水；
69.(bj)整个方法在0.1至10℃，诸如1至5℃，诸如约4℃的温度下进行；
70.(bk)条款21的步骤(ac)仅进行一次。
71.23.根据条款21或条款22所述的方法，其中来自非哺乳动物来源的胶原蛋白的溶液是冻干的。
72.24.提供根据条款1至13中任一项所述的复合支架材料的方法，其中该方法包括以下步骤：
73.(di)提供非哺乳动物胶原蛋白的溶液；
74.(dii)将磷酸钙颗粒以及交联剂和促进自交联的剂中的之一或二者添加至非哺乳动物胶原蛋白的溶液以形成反应混合物，并允许所述反应混合物反应一段时间；以及
75.(diii)去除所述溶剂以提供所述复合支架材料。
76.25.根据条款24所述的方法，其中：
77.在所述一段时间后，将步骤(dii)的反应混合物沉积在平坦的基材上并允许干燥以提供膜形式的所述复合支架材料；或者
78.在所述一段时间后，将步骤(dii)的反应混合物沉积在模具中并冻干以提供三维结构形式的所述复合支架材料。
79.26.根据条款24或条款25所述的方法，其中以下中的一项或多项适用：
80.(ca)所述非哺乳动物胶原蛋白的溶液中的所述非哺乳动物胶原蛋白以5至20mg/ml，诸如约10mg/ml的浓度提供；
81.(cb)所述非哺乳动物胶原蛋白的溶液中的溶剂是乙酸水溶液，任选地其中所述乙酸水溶液具有的摩尔浓度为0.1至1m，诸如0.3至0.7m，诸如约0.5m；
82.(cc)以相对于胶原蛋白的重量比为0.5:1至2:1，诸如约1:1提供所述磷酸钙颗粒；
83.(cd)所述交联剂，当存在时，以相对于所述胶原蛋白干重的3至15wt％，诸如8至10wt％的量提供；
84.(ce)所述一段时间为12至48小时，诸如18至32小时，诸如约24小时。
附图说明
85.图1描绘了用于从牛蛙皮中回收胶原蛋白的提取过程的示意图。
86.图2描绘了bfcol的特征：(a)数码图片；(b)atr-ftir曲线；(c)sds-page图像；(d)bfcol和牛胶原蛋白的afm图像；(e)bfcol纳米纤维的afm图像(数码图片的比例尺＝1cm；afm图像的为500nm)。
87.图3描绘了涉及从鱼鳞中分离羟基磷灰石(ha)的过程的示意图。
88.图4描绘了鱼鳞来源的ha的特征：(a)ha的象形图。比例尺＝1cm；(b)ha的atr-ftir光谱；(c)单相ha的xrd曲线；以及(d)dls分析，其示出分离的ha的平均粒度。
89.图5描绘了bdde交联的bfcol/ha(b-bfcol/ha)杂合生物复合物的制造和特征：(a)atr-ftir光谱证实了杂合生物复合物支架中bdde交联和ha的存在，以及b-bfcol/ha杂合生物复合物的数码图片。比例尺＝1cm；(b)截面sem图像示出b-bfcol/ha杂合生物复合物的多尺度形态(即，ha的微粗糙度和bdde交联(b-bfcol)的纳米粗糙度)。比例尺＝100μm(
×
200)、1μm(
×
15,000)和1nm(
×
100,000)；(c)b-bfcol/ha杂合生物复合物的孔隙率测量；(d)杂合生物复合物支架的力学分析。*表示指定实验组之间的统计学差异，p《0.05；以及(e)降解曲线。
90.图6描绘了b-bfcol/ha杂合复合物的吸收性。
91.图7描绘了b-bfcol/ha杂合生物复合物的细胞相容性分析：(a)暴露于b-bfcol/ha杂合生物复合物的巨噬细胞中炎性mrna转录物的表达水平；(b)在培养的7天期间b-bfcol/ha杂合生物复合物中hfob 1.19生长的定量测量；(c)hfob 1.19接种的杂合生物复合物的截面显微图像。细胞核(蓝色)用dapi染料复染。比例尺＝5mm(象形图)和100μm(显微图像)。*表示指定实验组之间的统计学差异，p《0.05。
92.图8描绘了b-bfcol/ha杂合生物复合物的成骨研究：(a)hfob 1.19早期成骨细胞标志物(alpl)的表达；(b)hfob 1.19晚期成骨细胞标志物(bglap)的表达；(c)对细胞核(蓝色)和骨钙蛋白(绿色)进行复染的hfob1.19的免疫细胞化学染色图像。比例尺＝100μm；以及(d)接种细胞的杂合生物复合物的茜素红s(红色)染色。比例尺＝200μm*表示指定实验组之间的统计学差异，p《0.05。
93.图9描绘了不同胶原蛋白提取方法的时间线：(a)新的胶原蛋白提取方法；以及(b)传统的酸溶解法。
具体实施方式
94.因此，在本发明的第一方面，提供了一种复合支架材料，包括：
95.由非哺乳动物胶原蛋白和交联剂形成的交联聚合物基质和由经历了自交联的非哺乳动物胶原蛋白形成的交联聚合物基质中的之一或二者；以及
96.分布在所述交联聚合物基质内的多个磷酸钙颗粒，其中所述复合支架材料是多孔的。
97.在本文的实施方式中，词语“包括”可以被解释为需要提及的特征，但不限制其他特征的存在。可替换地，词语“包括”也可能与仅列出的组分/特征旨在存在的情况有关(例如，词语“包括”可由短语“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”替换)。明确地设想，更广泛和更狭窄的解释都可以应用于本发明的所有方面和实施方式。换言之，词语“包括”及其同义词可以由短语“由
……
组成”或短语“基本上由
……
组成”或其同义词替换，反之亦然。
98.短语，“基本上由
……
组成”以及其假名在本文中可以解释为指可能存在少量杂质的材料。例如，该材料可以大于或等于90％纯度，诸如大于95％纯度，诸如大于97％纯度，诸如大于99％纯度，诸如大于99.9％纯度，诸如大于99.99％纯度，诸如大于99.999％纯度，诸如100％纯度。
99.如将理解的，交联聚合物基质可由以下形成：
100.·
非哺乳动物胶原蛋白和交联剂；
101.·
经历了自交联的非哺乳动物胶原蛋白；或者
102.·
两者的组合。
103.在本文中，所有这些可能性都可以称为交联聚合物基质，并且除非另有说明，否则该术语应被相应地理解。
104.本文使用的术语“交联剂”是指可以与胶原蛋白形成至少两个共价键的化合物，无论是通过固有地具有至少两个可以与胶原蛋白交联的官能团或者通过与自身反应产生至少两个能够交联的官能团。可以使用任何合适的交联剂。然而，由于本文讨论的材料可用于人体或动物体中的植入物，因此交联剂可以是药学上可接受的交联剂。例如，交联剂可选自由京尼平和包含两个或多个(例如2、3、4、5、6或7个)可交联官能团的化合物组成的组中的
一种或多种，所述可交联官能团选自由氨基、羧酸、酯、醛和环氧官能团组成的组。例如，交联剂可以选自包含两个或更多个选自由醛和环氧官能团组成的组的可交联官能团的化合物。本文可提及的特定交联剂可具有两个可交联官能团。
105.合适的交联剂的实例包括但不限于戊二醛、京尼平、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(例如交联剂是1,4-丁二醇二缩水甘油醚)及其组合。具有两个可交联官能团的合适的交联剂的实例包括但不限于戊二醛和1,4-丁二醇二缩水甘油醚(例如交联剂是1,4-丁二醇二缩水甘油醚)。
106.当存在时，交联剂可以以任何合适量的交联聚合物基质使用。应当理解，交联剂将共价结合于胶原蛋白。例如，(共价键合的)交联剂可以形成由3至15wt％诸如8至10wt％的由非哺乳动物胶原蛋白和交联剂形成的交联聚合物基质形成。
107.如上所述，交联聚合物基质可能已经经历自交联。这可以通过使用由技术人员进行的单个化学反应来影响自交联来实现，或者更特别地，它可以通过使用一种或多种酶来影响交联来实现。例如，自交联可以通过使用转谷氨酰胺酶来实现。应当理解，自交联聚合物基质可能基本上不包含用于影响自交联的化学品/(一种或多种)酶。这是因为这些物质可能在交联聚合物基质的加工过程中被冲走。
108.任何合适的磷酸钙颗粒都可以用于本文公开的复合支架材料中。例如，磷酸钙颗粒可具有的直径为10nm至20μm，诸如50nm至10μm，诸如500nm至3μm。在本文可提及的更具体实施方式中，磷酸钙颗粒可具有的直径为0.5至20μm，诸如1至10μm，诸如1.5至3μm，诸如约1.6μm。不希望受理论束缚，据信与使用微米尺寸的磷酸钙颗粒相比，使用具有纳米尺寸(例如10至500nm，诸如50至100nm)的磷酸钙颗粒可以增强机械性能。例如，使用纳米尺寸的磷酸钙(例如羟基磷灰石)颗粒可以增强基质刚度(例如，相对于本文单独使用的交联胶原蛋白，压缩模量增加高达约6.2倍)。这在某些情况下可能是有益的，但在本文公开的材料可用于的所有应用中可能不是期望或必需的，因此，微米尺寸的颗粒可适用于本文提及的所有可能的应用。
109.尽管可使用任何合适形式的磷酸钙，但在本文可提及的本发明的具体实施方式中，磷酸钙颗粒可为羟基磷灰石形式。在本文可能提及的本发明的更具体的实施方式中，羟基磷灰石可以为单相羟基磷灰石形式。
110.磷酸钙，更特别地，羟基磷灰石可以从任何合适的来源获得。这可以来自矿物来源，通过来自无机起始材料的合成方式，或来自天然来源。在本文可提及的本发明的实施方式中，磷酸钙可源自鱼鳞，其可用作羟基磷灰石的来源。可以使用任何合适的鱼鳞。例如，鱼鳞可以来自蛇头鱼和/或来源于真骨鱼类的骨鳞。
111.如前所述，仅30-50％的水产养殖产品用于直接人类消耗。副产品诸如鳍、鳞、皮和内脏每年被丢弃的数量超过2000万吨，其中大部分被填埋或焚烧处理。因此，如将理解的，使用鱼鳞来生产羟基磷灰石可能有助于显著减少食物废物，并更好地经济地使用鱼副产品中发现的宝贵资源。
112.在本发明的实施方式中，复合支架材料可以使用任何合适的非哺乳动物胶原蛋白。可用于本文的特定非哺乳动物胶原蛋白是i型胶原蛋白。
113.任何合适的非哺乳动物物种可用于产生用于本文公开的复合支架材料中的胶原蛋白(例如i型胶原蛋白)。这样的物种包括脊椎动物和无脊椎动物。更具体地，非哺乳动物
胶原蛋白可来源于牛蛙皮，任选地其中牛蛙属于蛙属(例如牛蛙是美国牛蛙物种)。
114.同样，由于上述原因，值得注意的是，使用牛蛙皮生产i型胶原蛋白能够捕获原本可能被浪费的资源。此外，还应注意，使用来源于非哺乳动物的胶原蛋白可以降低或消除与哺乳动物来源疾病相关的风险(例如牛海绵状脑病(bse)、传染性海绵状脑病(tse)和口蹄疫(fmd)。因此，与来自哺乳动物物种的那些相比，非哺乳动物来源的胶原蛋白(例如牛蛙胶原蛋白)可以被视为更安全的胶原蛋白来源。
115.如本文所述，复合支架材料是多孔的。当材料用于植入物时，这种孔隙率可能是有益的，因为它允许体液、细胞等进入，以及允许复合支架材料经历比其他情况更快的降解。尽管可以使用任何合适水平的孔隙率，但在本文可能提及的本发明的具体实施方式中，复合支架材料可以具有的孔隙率为90至99％，诸如93至98.5％，诸如95至98％。如何测量本文提及的复合支架材料的孔隙率的细节在下面的实施例部分中提供。
116.复合支架材料可具有的压缩模量为0.5至4.5kpa，诸如1.0至4.2kpa，诸如1.9至4kpa，诸如2.5至4kpa，诸如3至3.5kpa。这可以指使用微米直径范围内的羟基磷灰石颗粒制成的材料。不希望受理论束缚，如果需要或期望通过掺入纳米尺寸的磷酸钙(例如羟基磷灰石)颗粒代替微米尺寸的颗粒或除了微米尺寸的颗粒之外，该压缩模量可以增加。相对于交联胶原蛋白材料的天然压缩模量，包括纳米尺寸的磷酸钙颗粒可将压缩模量值增加约6倍(例如约6.2倍)。额外地或可替换地，如果需要或期望，还可以通过用磷酸钙颗粒涂覆复合支架材料来增加压缩模量。相对于交联胶原蛋白材料的天然压缩模量，这种磷酸钙颗粒涂层可将压缩模量值增加约26倍(例如约26.2倍)。因此，可以通过使用本文提到的三种选项来调整压缩模量以匹配复合支架材料的期望应用。也就是说，微米尺寸的磷酸钙颗粒、纳米尺寸的磷酸钙颗粒以及用磷酸钙颗粒涂覆复合支架材料。为避免疑义，任何磷酸钙颗粒可用于这些实施方式中，但在本文可提及的具体实施方式中，磷酸钙可为羟基磷灰石(例如以单相羟基磷灰石的形式)。
117.复合支架材料在涉及组织工程特别是骨组织工程的应用中可能特别有用。因此，有利的是本文公开的复合支架材料能够随时间降解以允许新组织形成并占据由降解的复合支架材料腾出的空间。因此，在本文可能提及的本发明的实施方式中，复合支架材料可以是这样一种复合支架材料，其中在经受1
×
磷酸盐缓冲盐水8天后超过50％的所述复合支架材料降解，并且通过二喹啉甲酸(bca)蛋白质测定试剂盒测量降解。
118.如上所述，复合支架材料可用于组织工程。因此，在本发明的另一方面，提供了：
119.(a)如本文所述的复合支架材料在制造用于有需要的受试者的组织工程的药物中的用途；
120.(b)如本文所述的复合支架材料用于有需要的受试者的组织工程中；以及
121.(c)一种组织工程方法，包括向有需要的受试者提供适量的如本文所述的复合支架材料的步骤。
122.如将理解的，虽然复合支架材料可用于体内组织工程应用，但它也可用于体外应用。因此，本发明的另一方面提供了一种体外组织工程方法，其中该方法包括以下步骤：
123.(bi)供应如本文所述的复合支架材料；
124.(bii)将细胞和合适的细胞营养混合物添加至所述复合支架材料；以及
125.(biii)允许所述细胞在所述复合支架材料上生长一段时间。
126.此类应用的实例可能包括疾病建模或用于药物筛选目的，诸如识别用于骨癌/骨转移的药物。
127.如将理解的，上述方法可涉及复合支架材料适用的任何类型的组织工程。在本发明的具体实施方式中，上述各种用途和方法可以涉及骨组织工程。
128.如前所述的，上述复合支架材料中使用的胶原蛋白可以来源于非哺乳动物来源。令人惊讶地发现，通过改进的方法可以产生大量的胶原蛋白。因此，在本发明的另一方面，公开了一种从非哺乳动物来源提供胶原蛋白前体混合物的方法，该方法包括以下步骤：
129.(a)在酸性溶剂中提供来自非哺乳动物的预处理的皮的混合物；以及
130.(b)使所述混合物经受机械混合以提供糊状物形式的所述胶原蛋白前体混合物。
131.特别是，令人惊讶地发现，使皮经受机械混合不仅能够使胶原蛋白的产量与传统方法相比显著增加，而且显著减少所需的处理时间。也就是说，与用于胶原蛋白提取的常用酸溶解方法相比，这种新方法更简单且更快，因为它可以在大约11天内完成(图8a)。不希望受到理论的束缚，据信将皮切成极小块的混合步骤的并入有助于从皮样品中分离胶原蛋白。传统方法通常涉及重复和长时间的提取步骤，以将胶原蛋白从皮组织中完全分离出来，这可能需要大约19天的时间来提取胶原蛋白(图8b)。此外，所公开方法的提取率可为约70.0
±
7.5wt％(基于100wt％的皮)，其比传统方法(21.3
±
3.6wt％)高三倍。鉴于胶原蛋白产量的增加和时间的减少(其大部分/全部都在降低的温度(例如4℃)下度过)，新工艺既减少了废物又减少了成本。
132.在上述方法中，酸性溶剂可以是乙酸水溶液。酸在水性介质中可以具有任何合适的浓度。在本文可提及的本发明的实施方式中，乙酸水溶液可具有的摩尔浓度为0.1至1m，诸如0.3至0.7m，诸如约0.5m。酸性溶剂可以以任何合适的量使用。例如，酸性溶剂可以以0.1:10至2:10，诸如1:10的重量与体积比提供，其中重量是指来自非哺乳动物的预处理的皮的重量以及体积是指酸性溶剂的体积。
133.可以使用任何合适的混合形式，只要它将皮撕成小块，从而形成糊状物。这种混合可以在任何合适的时间段内发生。例如，混合可以进行1至20分钟，诸如2至10分钟，诸如约5分钟。混合可以使用任何合适的混合器速度。例如，混合可以以20,000至50,000rpm，诸如30,000至40,000rpm，诸如约35,000rpm进行。
134.由于非哺乳动物皮内的胶原蛋白可能是脆弱的，因此该方法可以在低于环境的环境温度的温度下进行。例如，整个方法可以在0.1至10℃，诸如1至5℃，诸如约4℃的温度下进行。
135.尽管任何合适的非哺乳动物物种都可以用于本文公开的方法中，但在本文可提及的某些实施方式中，预处理的皮可以是牛蛙皮。例如，牛蛙可能属于蛙属(例如牛蛙是美国牛蛙物种)。
136.为了转化从上述方法获得的糊状物，可以执行进一步的下游步骤。因此，还提供了一种从非哺乳动物来源提供胶原蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
137.(aa)提供糊状物形式的胶原蛋白前体混合物；
138.(ab)用水稀释所述糊状物，并将得到的稀释糊状物离心以提供胶原蛋白溶液和包含颜料的团粒并收集所述胶原蛋白溶液；
139.(ac)向所述胶原蛋白溶液中添加无机盐一段时间(例如12至18小时)以沉淀出胶
原蛋白盐，然后将其离心收集；
140.(ad)将酸性溶剂添加至收集的胶原蛋白盐以提供游离胶原蛋白混合物并将所述游离胶原蛋白混合物经受透析以提供来自非哺乳动物来源的胶原蛋白的溶液。
141.如将理解的，该下游方法可以使用从上文公开的方法获得的糊状物形式的胶原蛋白前体混合物来执行。此糊状物可以原样使用，或者更特别地，可以被稀释。例如，可将糊状物用水以1:10至1:30vol/vol，诸如1:10至1:20vol/vol，诸如约1:10vol/vol的比例稀释。可替换地，可将糊状物用水以1:2至1:10vol/vol，诸如1:3至1:7vol/vol，诸如约1:5vol/vol的比例稀释。如将理解的，本领域技术人员可以根据材料的量和所使用的设备来选择实际条件。例如，稀释因子可能高度依赖于离心瓶的体积/尺寸。如果瓶的体积大，那么颗粒在沉积在瓶底部之前可能必须通过更长的路径扩散。因此，当使用更大的离心瓶时，需要更长的离心时间和/或更多稀释。
142.为避免疑义，明确设想在本文引用与相同特征相关的多个数值范围的情况下，每个范围的端点旨在以任何顺序组合以提供进一步设想的(和隐含公开的)范围。因此，上面公开了糊状物可以用水以以下比例稀释：
143.1:2至1:3，1:2至1:5，1:2至1:7，1:2至1:10，1:2至1:20，1:2至1:30；
144.1:3至1:5，1:3至1:7，1:3至1:10，1:3至1:20，1:3至1:30；
145.1:5至1:7，1:5至1:10，1:5至1:20，1:5至1:30；
146.1:7至1:10，1:7至1:20，1:7至1:30；
147.1:10至1:20，1:10至1:30vol/vol；或者
148.1:20至1:30vol/vol。
149.上述步骤(ab)中的离心步骤可以以15,000至50,000
×
g，诸如20,000至35,000
×
g，诸如约25,000
×
g进行。此离心步骤可以进行任何合适的时间段。例如，离心可进行5至45分钟，诸如10至30分钟，诸如约15分钟。
150.在上述方法的步骤(ac)中可以使用任何合适的无机盐。合适的无机盐包括但不限于硫酸钠、硫酸铵、碱金属卤化物(例如氯化钾、氯化钠)及其组合。在本文可提及的本发明的具体实施方式中，盐可以是氯化钠。可以使用任何合适浓度的无机盐。例如，无机盐(例如氯化钠)可以作为浓度为0.5至4.0m，诸如0.5至1.5m，诸如约0.9m的水溶液提供。另外的或可替换的盐化方法可以在美国专利no.7,964,704(例如参见实施例4)和https://doi.org/10.1007/bf00548873中发现，这些方案均通过引用并入本文。
151.上述步骤(ac)中的离心步骤可以以3,000至10,000
×
g，诸如4,000至6,000
×
g，诸如约5,500
×
g进行。此离心步骤可以进行任何合适的时间段。例如，离心可进行5至45分钟，诸如10至30分钟，诸如约15分钟。在某些实施方式中，上述方法的步骤(ac)可以仅进行一次。
152.上述步骤(ad)中的酸性溶剂可以是乙酸水溶液。酸在水性介质中可以具有任何合适的浓度。在本文可提及的本发明的实施方式中，乙酸水溶液可具有的摩尔浓度为0.1至1m，诸如0.3至0.7m，诸如约0.5m。
153.上述步骤(ad)中的透析可以分两轮进行，其中：
154.(i)第一轮透析可使用浓度为0.01至0.3m，诸如0.05至0.2m，诸如约0.1m的乙酸水溶液；以及
155.(ii)第二轮透析可使用水。
156.由于非哺乳动物皮内的胶原蛋白可能是脆弱的，因此从糊状物形式的胶原蛋白前体混合物产生胶原蛋白的方法可以在低于环境的环境温度的温度下进行。例如，整个方法可以在0.1至10℃，诸如1至5℃，诸如约4℃的温度下进行。
157.在上述方法中获得的来自非哺乳动物来源的胶原蛋白溶液可以被冻干。
158.如将理解的，上述方法产生前体胶原蛋白糊状物和胶原蛋白，但不是上述所期望的复合支架材料。因此，在本发明的另一方面，公开了一种提供如上所述的复合支架材料的方法，其中该方法包括以下步骤：
159.(di)提供非哺乳动物胶原蛋白的溶液；
160.(dii)将磷酸钙颗粒以及交联剂和促进自交联的剂中的之一或二者添加至非哺乳动物胶原蛋白的溶液以形成反应混合物，并允许所述反应混合物反应一段时间；以及
161.(diii)去除所述溶剂以提供所述复合支架材料。
162.当存在时，促进自交联的剂可以是合适的酶。例如，酶可以是转谷氨酰胺酶。
163.可以使用任何合适的时间段来进行反应。如将理解的，最佳时间段足够长以确保交联剂有时间与胶原蛋白充分反应。例如，时间段可以是12至48小时，诸如18至32小时，诸如约24小时。
164.可以使用在经过一段时间后去除溶剂的任何合适方法。例如，步骤(dii)的反应混合物可以沉积在平坦的基材上并允许其干燥以提供膜形式的所述复合支架材料。可替换地，可以将步骤(dii)的反应混合物沉积在模具中并冻干以提供三维结构形式的所述复合支架材料。
165.上述步骤(di)中的非哺乳动物胶原蛋白的溶液中的非哺乳动物胶原蛋白可以以任何合适的浓度提供。例如，上述步骤(di)中的非哺乳动物胶原蛋白的溶液中的非哺乳动物胶原蛋白可以5至20mg/ml，诸如约10mg/ml的浓度提供。
166.任何合适的溶剂都可以用于非哺乳动物胶原蛋白的溶液中。例如，非哺乳动物胶原蛋白的溶液中的溶剂可以是乙酸水溶液。可以使用任何合适浓度的乙酸。例如，乙酸水溶液可具有的摩尔浓度为0.1至1m，诸如0.3至0.7m，诸如约0.5m。
167.可以以相对于胶原蛋白任何合适的重量:重量比提供磷酸钙颗粒。例如，可以以相对于胶原蛋白的重量比为0.5:1至2:1，诸如约1:1提供磷酸钙颗粒。
168.当存在时，交联剂可以以相对于胶原蛋白任何合适的量提供。例如，当存在时，交联剂可以以相对于所述胶原蛋白干重的3至15wt％，诸如8至10wt％的量提供。
169.某些优点可能与本发明相关。这些包括但不限于以下内容。
170.·
非哺乳动物胶原蛋白(例如牛蛙皮来源的胶原蛋白(bfcol)可能没有疾病，诸如牛海绵状脑病(bse)、传染性海绵状脑病(tse)和口蹄疫(fmd)。鉴于此，与来自哺乳动物物种的那些相比，非哺乳动物胶原蛋白可被视为更安全的胶原蛋白来源。
171.·
非哺乳动物胶原蛋白，尤其牛蛙皮性质柔软且纤维较少。不希望受理论束缚，据信这可以使皮相对更容易从中溶解胶原蛋白。这种特性可能有助于促进胶原蛋白提取，并且这可能有助于解释使用改进的胶原蛋白提取方法获得的提取率为～70wt％(相对于皮的重量)的能力。
172.·
某些非哺乳动物物种通常作为食物资源进行养殖(例如牛蛙)，且目前对这些物
inc.,美国)以4cm-1
的分辨率在4000-650cm-1
的范围内进行扫描。经过32次扫描捕获红外光谱，其中峰用于识别化学官能团。对获得的光谱进行进一步分析以通过测量酰胺iii和1450cm-1
之间的峰强度比来检查提取的胶原蛋白的结构(j.k.wang等人,acta biomater.2017,63,246-260；以及j.k.wang等人,j.mater.sci.:mater.med.2016,27,45)。
189.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)
190.将冻干的胶原蛋白以10mg/ml溶解在0.01m乙酸中，然后与等体积的1
×
sds加载染料混合，并在95℃下加热5min以使蛋白质变性。随后，将10μl的溶液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶上，在0.2a电流下分离蛋白质2h。此后，聚丙烯酰胺凝胶用bio-safetm coomassie brilliant blue r-250染色1h，然后用脱色溶液再洗涤1h。最后，捕获考马斯亮蓝染色聚丙烯酰胺凝胶的象形图以使得各种蛋白质带可视。
191.原子力显微镜(afm)
192.通过afm检查胶原蛋白的形貌。胶原蛋白溶液(100μg/ml)在云母表面上风干，然后使用cypher s原子力显微镜(asylum research，美国)在轻敲模式下以500mv扫描，扫描速率为1.0hz，扫描尺寸为1.30
×
1.30μm2方区。
193.能量弥散x射线(edx)光谱法
194.使用fine coater jfc-1200(jeol公司，日本)对样品进行溅射镀铂薄层，其中使用jsm-7600f肖特基场发射扫描电子显微镜(fesem；jeol公司，日本)通过10kv的面积映射和
×
100的放大率收集元素光谱。然后基于从元素光谱获得的成分分析计算钙磷比。
195.x射线粉末衍射(xrd)分析
196.ha的xrd曲线是通过使用shimadzu xrd-6000(shimadzu公司，日本)在20《2θ《60范围内以1
°
/min的扫描速度和0.05
°
的步长大小在θ/2θ模式下扫描样品获得的。然后将xrd曲线与粉末衍射数据库(国际衍射数据中心)进行比较，以确定ha中存在的化学相。
197.动态光散射(dls)粒度测量
198.使用高性能纳米粒度仪(malvern zetasizer
–
nano zs；malvern instruments,英国)分析ha的粒度分布。将一毫克所得粉末与100ml的蒸馏水混合，然后进行超声处理。随后，将1ml的溶液转移到一次性塑料比色皿中，并放置在样品固持器内侧进行粒度测量。
199.统计分析
200.除非另有说明，所有实验一式三份(n＝3)进行，并表示为平均值
±
标准偏差。使用kruskal-wallis非参数单向方差分析和mann-whitney u检验分析统计显著水平，其中数据在p《0.05的情况下被认为具有统计学意义。
201.实施例1
202.使用内部开发的机械化学方法从美国牛蛙(美国牛蛙(rana catesbeiana))皮中提取i型原胶原，如下所述和图1所示。
203.所有提取步骤均在4℃下进行，所有涉及的溶液在使用前均冷却至4℃。简而言之，用蒸馏水洗涤牛蛙皮以去除任何血液和杂质。随后，清洁的牛蛙皮在4℃下用0.5m naoh以1:10的重量/体积比(wt/vol)进一步处理48h，每24h更换一次naoh溶液以去除不需要的蛋白质和黑色颜料。然后用蒸馏水彻底洗涤经naoh处理的牛蛙皮，并用hcl中和以去除残留的naoh。接下来，将清洁的牛蛙皮以1:10的重量体积比(wt/vol)浸泡在0.5m乙酸中24h以消化皮，然后用philips搅拌机以35,000r.p.m.进行5min以产生浓稠的胶原蛋白糊状物。随后，
将胶原蛋白糊状物进一步用蒸馏水稀释5倍，并在25,000
×
g下离心15min以将色素与胶原蛋白溶液分离。然后将澄清的胶原蛋白上清液转移到烧杯中并与nacl(0.9m，基于胶原蛋白上清液的体积)混合以诱导胶原蛋白盐化24h。在盐沉淀过程结束时，通过以5,500
×
g离心15min的过程收集胶原蛋白盐。最后，胶原蛋白盐在0.5m乙酸中重新溶解，并使用透析管(10k mwco)对0.1m乙酸透析48h(中间更换溶液)，然后在蒸馏水中进行另一轮透析48h(中间更换溶液)。随后将最终溶液冻干并储存在4℃直至进一步使用。
204.特征
205.bfcol以70.0
±
7.5％w/w的提取率成功被提取，据我们所知，这是迄今为止报道的青蛙皮胶原蛋白提取率最高的一次(y.zhao等人,3biotech 2018,8,181；j.zhang等人,int.j.biol.macromol.2017,101,638-642；以及h.li等人,food chem.2004,84,65-69)。如图2a所示，最终冻干的bfcol呈现白色外观，表明成功去除了皮色素。提取的bfcol的atr-ftir光谱揭示了胶原蛋白的典型特征酰胺峰。bfcol的atr-ftir光谱显示了为酰胺a(～3300cm-1
)、酰胺b(～2920cm-1
)、酰胺i(～1630cm-1
)、酰胺ii(～1530cm-1
)和酰胺iii(～1200cm-1
)的特征的吸收峰(图2b)(j.k.wang等人,acta biomater.2017,63,246-260)。此外，发现酰胺iii带与1450cm-1
的吸收峰强度比为约1，这表明bfcol中的三螺旋构象(j.k.wang等人,acta biomater.2017,63,246-260)。
206.进行了sds-page分析，并示出从牛蛙皮中成功提取出i型胶原蛋白。sds-page分析显示在250、139和129kda附近有若干个不同的带(图2c)，分别对应于β-链、α1-链和α2-链。此外，发现α1-链和α2-链的带宽比为2:1(图2c)，类似于i型胶原蛋白的(j.k.wang等人,j.mater.sci.:mater.med.2016,27,45)。与市售的牛胶原蛋白相比，提取的bfcol的纤维状结构显著更小。afm图像(图2d)示出了bfcol的胶原蛋白原纤维直径为约38nm，其与牛胶原蛋白原纤维(～374nm)相比薄10倍。值得注意的是，bfcol的酸溶部分作为纳米纤维存在，直径为约20-25nm，长度为200-400nm，这可能对应于原胶原的小聚集体(图2e)(h.jawad等人,5.05-mesoscale engineering of collagen as a functional biomaterial,in:m.moo-young(ed.),comprehensive biotechnology(second edition),academic press,burlington,2011,pp.37-49；以及b.d.walterset等人,acta biomater.2014,10,1488-1501)。通常，细胞粘附位点在5-200nm的范围内。因此，与典型的微米级胶原蛋白原纤维相比，纳米级bfcol可以为基本细胞过程诸如细胞粘附和增殖提供更好的支持，这有利于组织工程应用(c.y.tay等人,small2011,7,1416-1421；以及c.y.tay等人,small 2011,7,1361-1378)。
207.实施例2
208.ha是通过先前报道的煅烧方法(图3)从废弃的蛇头(小盾鳢(channa micropeltes))鱼鳞中收获和加工的(y.y.chun等人,macromol.biosci.2016,16,276-287)并在下文进行描述。
209.用蒸馏水彻底洗涤新鲜获得的小盾鳢(channa micropeltes)鳞以去除任何血液和杂质。简言之，将鳞在n7/h马弗炉(nabertherm gmbh，德国)中在850℃下以10℃/min的恒定加热速率煅烧1h以去除鱼鳞内的有机物。随后，将热处理的鱼鳞与1
×
pbs以1:10的固溶比(wt/vol)混合，然后使用5mm氧化锆球以ha与氧化锆球的10％重量比进行球磨24h，然后再风干24h。之后，将风干的粉末通过孔径为20μm的金属网筛分，并储存在干燥柜中以备后
用。
210.特征
211.所得煅烧产物的提取率为41.9
±
5.3％w/w，钙磷比为1.66
±
0.22，其接近～1.67的人骨骼的化学计量比(图4a)。atr-ftir光谱(图4b)在1100至960cm-1
的区域内示出了特征性磷酸盐吸收峰，而有机峰的出现明显不存在，表明样品不含有机残余物。此外，蛇头鳞来源的ha的xrd图案与来自powder diffraction file
tm
数据库的单相ha非常匹配(图4c)。最后，dls分析显示ha样品具有的平均流体动力学直径为～1.6μm(图4d)，其落入报告的有利于骨细胞相互作用和骨组织整合的最佳尺寸范围(即，1-10μm)内(c.hallgren等人,biomaterials 2003,24,701-710)。
212.实施例3
213.为了规避海产胶原蛋白的变性温度低和理化性质差(x.liu等人,acs sustain.chem.eng.2018,6,17142-17151)，使用bdde对bfcol和bfcol/ha杂合网络进行结构稳定以生产bdde交联的bfcol(b-bfcol)和bdde交联的bfcol/ha(b-bfcol/ha)。从机理上讲，bdde的两个环氧末端可以与胶原蛋白分子中存在的游离基团反应以形成醚键，而bdde主链充当相邻胶原蛋白链之间的连接。使用实施例1和2中合成的材料，采用一锅合成法制备b-bfcol和b-bfcol/ha杂合生物复合物。
214.b-bfcol的制造
215.简言之，将冻干胶原蛋白(10mg/ml)溶解在0.5m乙酸中，然后添加10％w/w bdde交联剂(基于胶原蛋白的干重)。将反应混合物在4℃以300rpm搅拌24h。此后，将反应混合物风干在用食人鱼溶液清洁的盖玻片上以产生2d涂层或转移到模具中并冻干以产生3d多孔b-bfcol样品。
216.b-bfcol/ha杂合生物复合物
217.简言之，将冻干胶原蛋白(12mg/ml)溶解在0.5m乙酸中，然后以1:1的胶原蛋白与ha重量比掺入ha糊状物以及10％w/w bdde交联剂(基于胶原蛋白的干重)，最终胶原蛋白浓度为10mg/ml。将反应混合物在4℃以300rpm搅拌24h。此后，将反应混合物风干在用食人鱼溶液清洁的盖玻片上以产生2d涂层或转移到模具中并冻干以产生3d多孔b-bfcol/ha样品。
218.特征
219.通过冻干工艺成功制造了b-bfcol和b-bfcol/ha复合支架。样品的成功交联首先通过atr-ftir得到证实，在交联过程后，在1050和1250cm-1
的范围内观察到额外的醚峰(c-o-c)(图5a)。b-bfcol/ha杂合生物复合物中ha的存在是通过1040和1100cm-1
之间的峰强度增加来检测的，这与磷酸根(po
43-)官能团有关。图5b所示的fesem图像进一步证实了这一点。
220.虽然b-bfcol和b-bfcol/ha样品都显示出高度互连和多孔结构，但微粒化ha的出现仅限于b-bfcol/ha组。发现b-bfcol/ha杂合生物复合物的平均孔径为～54.6
±
26.3μm，并且在组织工程应用的合适孔径范围(即20-1,500μm)内(c.m.murphy等人,cell adh migr.2010,4,377-381)。在更高的放大倍率下，针对b-bfcol纳米纤维网络的ha微团粒的存在非常明显。这种分层和/或多尺度表面形貌可以有利于细胞-材料相互作用和形貌诱导的成骨分化。如实例，zheng等人最近的研究已经表明，微纳米形貌通过整合素α2-pi3k-akt信号轴促进细胞粘附、成熟粘附斑的形成和成骨细胞分化(h.zheng等人,
front.bioeng.biotechnol.2020,8,4630)。
221.实施例4
222.对实施例3中制备的b-bfcol/ha生物复合物样品的孔隙率和力学性能进行了评估，实验程序和结果如下所示。
223.孔隙率测量
224.使用液体置换法测量3d杂合生物复合物的孔隙率。简言之，将单个样品浸入含有已知体积的无水乙醇(v1)的玻璃瓶中5min。随后，将乙醇浸渍样品的无水乙醇的总体积记录为v2。然后将乙醇浸渍的样品从玻璃瓶中去除，其中残余的乙醇体积记为v3。然后根据方程1估计支架的孔隙率。
[0225][0226]
压缩模量
[0227]
通过测量样品的压缩模量来确定3d杂合生物复合物的机械性能。将样品加载到instron 5567型万能试验机(instron公司，美国)上，并以2mm/min的速率用10kn测力传感器压缩至其原始高度的50％以获得应力-应变曲线。然后测量应力-应变曲线的初始梯度以给出压缩模量。
[0228]
体外降解研究
[0229]
通过使用bca蛋白质测定试剂盒在不同时间点量化降解胶原蛋白的量来研究3d杂合生物复合物的降解行为。简言之，将样品浸入1
×
pbs中并在37℃下孵育21天。在不同的时间点，收集1
×
pbs并用等量的新鲜1
×
pbs代替。使用bca蛋白质测定法对降解的胶原蛋白的量进行量化，并将累积降解与时间作图以获得降解曲线。
[0230]
b-bfcol/ha的吸水性
[0231]
b-bfcol/ha的吸水性能力通过逐滴添加200μl的细胞培养基(即dmem/f-12)来评估，其中记录水被完全吸收的时间。
[0232]
结果与讨论
[0233]
b-bfcol和b-bfcol/ha样品的孔隙率均超过90％(图5c)。特别地，b-bfcol/ha复合支架的孔隙率为约95.7
±
2.0％。从组织工程的角度来看，高度多孔的支架很有吸引力，因为它们有助于细胞穿透、营养物质和代谢废物交换、血管化以及骨形成(a.autissier等人,acta biomater.2010,6,3640-3648；以及s.yunoki等人,mater.lett.2006,60,999-1002)。
[0234]
支架的机械性能对于确保长期的结构和功能活力很重要(j.chen等人,biophys.j.2012,103,1188-1197)。值得注意的是，与b-bfcol对照组相比，b-bfcol/ha支架的压缩模量硬大约6倍(图5d)。因此，ha的掺入成功地提高了b-bfcol支架的压缩模量。尽管由于ha的脆化效应，ha掺入的复合支架观察到更高的降解曲线(图5e)，但从组织工程的角度来看，它实际上是有利的，因为这意味着支架是可吸收的并且可以被新的最终形成组织替代。
[0235]
然而，添加微粒化鱼鳞来源的ha以及bdde交联显著增加了b-bfcol/ha杂合生物复合物的整体稳定性和压缩刚度。特别地，测量的b-bfcol/ha的体积压缩刚度估计约为3.32
±
0.35kpa。尽管形成成骨细胞基质的支架模量在30kpa的范围内(n.huebsch等人,nat.mater.2010,9,518-526)，生物活性成分的存在可以对成骨产生更大的生化作用，其中
软基质可修改以支持干细胞成骨分化(k.vuornos等人,j.biomed.mater.res.,part b 2020,108,1332-1342)。此外，杂合生物复合物的基质刚度可以通过掺入纳米尺寸的ha(压缩模量增加～6.2倍)而不是微米尺寸的ha(压缩模量增加约～2.2倍)或用ha沉淀物(压缩模量增加～26.2倍)涂覆多孔支架以进一步微调物理特性来容易地增强(a.j.ryan等人,j.anat.2015,227,732-745)。此外，b-bfcol/ha杂合生物复合物表现出优异的吸收性，其能够在几秒钟内吸收添加的溶液，使其成为吸收体液和维持支持组织修复的湿润微环境的理想选择(图6)。总的来说，高多孔结构保真度，加上改进的机械性能，使b-bfcol/ha杂合生物复合物成为组织工程应用的理想平台。
[0236]
实施例5
[0237]
为确保实施例1和2中的提取方案以及实施例3中b-bfcol/ha杂合生物复合物的一锅合成适用于骨植入物的制备，首先使用pma诱导的来自人thp-1单核细胞的分化巨噬细胞对b-bfcol/ha杂合生物复合物的免疫反应性进行了检查。下面提供了细胞培养和实时聚合酶链反应(rt-pcr)程序和实验结果。
[0238]
细胞培养
[0239]
thp-1单核细胞在补充有10％ fbs、1.6g/l碳酸氢钠和1％青霉素-链霉素的rpmi-1640培养基中在37℃、5％ co2环境和饱和湿度下培养并扩增。使用来自人thp-1单核细胞的pma分化巨噬细胞检查杂合生物复合物的免疫反应性，其中使用实时聚合酶链反应(rt-pcr)检查thp-1巨噬细胞表达的促炎基因(j.k.wang等人,macromol.rapid commun.2020,41,2000275)。
[0240]
rt-pcr
[0241]
使用purelink rna迷你试剂盒从thp-1巨噬细胞中提取总rna。使用nanodrop
tm 2000(thermo scientific,美国)测定总rna的浓度和质量。此后，使用iscript cdna合成试剂盒根据制造商方案对提取的rna进行cdna的合成，其中反应使用t100热循环仪(bio-rad，美国)进行：在25℃引发5min，在46℃逆转录20min，在95℃逆转录酶失活1min。对于rt-pcr实验，使用kapa sybr fast，其中使用cfx connect rt-pcr检测系统(bio-rad，美国)使用以下方案测定靶标mrna转录物的表达水平：酶激活和dna在95℃下变性30s，然后扩增40个循环，每个循环包括15s的在95℃下的变性步骤以及30s的在60℃下的退火/延伸和板读数。记录每个转录物的阈值循环(c
t
)值并归一化为内部管家对照。使用如早前所述的比较c
t
方法对每个mrna进行相对定量(h.yang等人,adv.healthc.mater.2019,8,1900929)。列出的引物序列(表1)获自引物库(https//pga.mgh.harvard.edu/primerbank)。对于免疫原性反应研究，1μg/ml lps用作阳性对照以诱导静息巨噬细胞(m0)极化为促炎m1表型。
[0242]
表1.用于rt-pcr研究的引物和管家基因的序列。
[0243][0244][0245]
结果与讨论
[0246]
与lps阳性对照相比，b-bfcol/ha杂合生物复合物暴露巨噬细胞的炎性mrna转录物诸如il-6、il-23和tnf-α的表达水平仍然相对适中，表明废物来源的生物材料杂合物引发过度急性炎症响应的风险很低(图6a)。
[0247]
实施例6
[0248]
以hfob 1.19成骨细胞作为体外细胞模型，评估了b-bfcol/ha支架用于骨修复的生物学性能。下面提供了细胞培养和细胞增殖测定方案以及实验结果。
[0249]
细胞培养
[0250]
使用补充有10％ fbs、1
×
抗生素抗真菌剂、1.6g/l碳酸氢钠和2.5mm l-谷氨酰胺的dmem/f-12培养基在34℃、5％ co2环境和饱和湿度下培养和扩增hfob 1.19细胞。对于细胞培养研究，使用eogas 4灭菌器(andersen products,inc.,美国)通过环氧乙烷(eto)气体处理对样品进行过夜灭菌。
[0251]
细胞增殖测定
[0252]
根据制造商推荐的方案，在不同的预定时间点使用prestoblue
tm
细胞活力试剂测定hfob 1.19细胞的增殖。简言之，将细胞接种到2d和3db-bfcol和b-bfcol/ha样品上，接种密度分别为30k细胞/cm2和600k细胞/ml。在预定时间点，通过将细胞接种样品与10％v/v prestoblue
tm
试剂在37℃下孵育1h来测量细胞数。在孵育期结束时，转移200μl的溶液放入96孔板中，使用spectramax m2酶标仪(molecular devices，美国)测量荧光强度(ex 560/em 590nm)。使用将荧光强度与已知细胞数相关的标准曲线确定细胞数。根据方程2，进行了进一步分析以比较在不同样品上培养的hfob 1.19细胞的群体倍增率。
[0253][0254]
其中nf是在各个时间点获得的细胞计数，以及ni表示从前一时间点获得的细胞计数。
[0255]
dapi染色
[0256]
细胞接种的支架在4℃下用4％ pfa固定过夜，然后在-20℃冷冻前浸泡在fsc 22冰冻切片介质中。此后，使用切片机(leica biosystems，美国)将样品冷冻切片成15μm厚切片，并使用聚-l-赖氨酸处理的载玻片收集。最后，在使用zeiss axio observer.z1倒置显
微镜(carl zeiss，德国)成像之前，样品在室温下在黑暗中用1μg/ml的dapi染色5min。
[0257]
结果与讨论
[0258]
如图6b所示，接种在b-bfcol/ha 3d多孔支架中的hfob 1.19细胞表现出阳性增殖曲线，在培养7天后观察到细胞数量增加，而b-bfcol样品未观察到这种情况。有趣的是，不仅细胞增殖的速率明显更快(b-bfcol/ha的特定倍增率为每天～0.18，而b-bfcol为每天-0.05)，定殖b-bfcol/ha支架的细胞总数明显更高(b-bfcol/ha的～169k，而b-bfcol的～98k)。细胞数量的显著增加可归因于改善的细胞-材料相互作用与ha功能化支架(p.kazimierczak等人,int.j.nanomed.2019,14,6615)或增加的细胞外基质(ecm)机制，其可以助长细胞增殖促进信号转导，诸如丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mapk/erk)路径(c.y.tay等人,nanomedicine 2013,8,623-638)。
[0259]
培养7天后，将细胞接种的3d支架用4％ pfa固定并冷冻切片。截面图像(图6c)示出了，由于杂合生物复合物的高吸水性能力，hfob 1.19细胞的覆盖在b-bfcol/ha支架内明显广泛且均匀分布(dapi染色的细胞核)。因此，b-bfcol/ha支架可以促进适当的细胞活动，并最终导致在再生过程期间形成同质组织。
[0260]
实施例7
[0261]
为评估实施例3中制备的b-bfcol/ha生物复合物的骨诱导潜力，如实施例6中所述，将hfob 1.19成骨细胞接种到2d b-bfcol和b-bfcol/ha杂合生物复合物上。通过实施例5中描述的rt-pcr测定成骨mrna转录物(alpl和bglap)的表达水平，而免疫细胞化学染色的方案提供如下。
[0262]
免疫细胞化学染色
[0263]
将接种在2d杂合生物复合物样品上的hfob 1.19细胞在预定时间点用4％pfa在4℃下固定12h。随后，细胞在室温下用0.2％triton x-100透化10min。然后用1
×
pbs洗涤样品三次，然后在室温下用2％ bsa溶液封闭样品1h。将稀释因子为1:500的兔抗oc抗体添加到样品中，并在4℃下孵育12h。随后，将样品用1
×
pbs洗涤三次，并以1:500的稀释因子与alexa fluor 488山羊抗兔igg孵育(h+l)，与0.2μg/ml的hoechst 33342溶液在室温下避光进行2h。使用配备有axiocam hrm相机的zeiss axio imager z1(carl zeiss，德国)倒置落射荧光显微镜观察和成像免疫染色图像。为了有助于样品的交叉比较，成像条件诸如曝光持续时间、信号放大等保持不变。使用imagej免费软件(https://imagej.nih.gov/ij/)处理和测量靶标蛋白的表达水平。
[0264]
结果与讨论
[0265]
alpl基因编码同工酶碱性磷酸酶，这是成骨的早期和瞬时标志物(m.mizerska-kowalska等人,molecules 2019,24,2637)。另一方面，由bglap基因编码的骨钙蛋白是一种重要的非胶原蛋白分泌因子，其参与骨基质矿化和骨形成的晚期标志物(a.rutkovskiy等人,med.sci.monit.basic res.2016,22,95)。在b-bfcol/ha组的情况下，我们观察到相对于b-bfcol组，alp的表达水平在实验开始14天时显著增加(～9.4倍)(图7a)。此后，alp的上调状态在培养21天后略微降低(～2.1倍)。类似地，与b-bfcol组相比，对于b-bfcol/ha，在第14天或第21天bglap mrna转录物(图7b)和oc的免疫细胞化学染色(图7c)以更高的水平2至3倍的因子始终表达。这些结果表明，b-bfcol/ha支持的hfob 1.19分化为成熟的成骨细胞，并且包含ha组分可以显著增强支架诱导骨分化事件的能力。
[0266]
实施例8
[0267]
为了评估b-bfcol/ha的细胞介导矿化潜力，将hfob 1.19成骨细胞接种到3d b-bfcol(在实施例1中制备)和3d b-bfcol/ha杂合生物复合物(在实施例3中制备)上，如实施例6中所述。取样用于茜素红s染色定量测定，测定方案和实验结果提供如下。
[0268]
茜素红s染色
[0269]
将细胞接种的3d杂合生物复合物样品冷冻切片并用茜素红s染色。简言之，将细胞接种的样品在4℃下使用4％ pfa固定12h。随后，固定的样品用1
×
pbs洗涤三次，然后浸入fsc 22冰冻切片介质中并在-20℃下冷冻。然后使用切片机将样品冷冻切片成10μm切片，其中收集样品并粘附在聚-l-赖氨酸处理的载玻片上。然后将样品用1
×
pbs洗涤三次，然后用40mm茜素红s溶液孵育24h。茜素红s溶液是通过将茜素红s粉末溶解在蒸馏水中制备的，并具有的最终ph值为4.1，使用溶解在水中的氢氧化铵进行调节。在该过程结束时，用蒸馏水彻底洗涤样品，直到洗涤液几乎透明。最后，使用光学显微镜对清洁的样品进行成像，以可视化切片中的钙。
[0270]
结果与讨论
[0271]
经过21天的培养期后，仅b-bfcol支架示出适度水平的茜素红s阳性矿化沉积物，而b-bfcol/ha样品清楚地显示出更广泛的覆盖范围和更深的矿化染色。与仅b-bfcol组相比，茜素红s染色定量示出了b-bfcol/ha组的染色显著增加(～1.5倍)(图7d)。这与其他人的报告相似，其中ha的存在诱导成骨细胞矿化，这是通过在生物复合物支架上培养10-15天后茜素红s染色的增加来确定的(j.venugopal等人,j.mater.sci.:mater.med.2008,19,2039-2046；以及j.r.venugopal等人,cell biol.int.2011,35,73-80)。这些结果令人鼓舞，因为它强烈表明b-bfcol/ha支架能够支持骨组织发育中细胞介导的矿化过程。