用于分析靶相互作用的三元组合crispr筛选系统及其方法1.本国际专利申请要求于2020年4月16日提交的美国临时专利申请号：63/010,877的权益，其全部内容通过引用并入以用于所有目的。1.
技术领域：
：2.本文提供了用于多重基因组编辑或二元或三元组合crispr筛选的系统。还提供了对减轻疾病的基因组合的高通量筛选，以鉴定作为潜在治疗方案的二元和三元协同药物组合。还提供了慢病毒三元组合向导rna表达盒和组合向导rna文库。3.2.发明背景4.尽管联合疗法有望提高对各种疾病的治疗效果(al-lazikani等人,2012)，但迄今为止仅发现了有限数量的有效组合，尤其是包含三种或更多种药物的组合(表s1)。药物组合的效果由于预料不到的协同作用或拮抗作用而难以预测，并且并非简单地是每种药物带来的效果的总和(borisy等人,2003)。微孔板阵列与机器人系统偶联以筛选大规模药物组合。然而，由于实验的数量随着药物的数量和所研究的组合复杂性的阶呈指数增长，这种方法可能变得非常昂贵。rna干扰和基于成簇的规则间隔短回文重复(crispr)的遗传扰动系统已被应用于促进有效药物靶标对的筛选(doench,2018；wong等人,2016b)，但尚无文库组装和筛选方法已被验证可同时评估两个以上的靶标。这可以归因于表达多种rna的多顺反子系统的切割效率相对较低且易变(han等人,2017；xu等人,2017)，和/或高阶组合的表征需要大规模寡核苷酸合成和高测序成本(在设计中详细说明)。已经开发了用于预测三元和更高阶药物相互作用的数学模型(cokol等人,2017；wood等人,2012；zimmer等人,2016)，但需要高通量方法来通过实验验证潜在组合的集合。为了突破该瓶颈，本文建立并验证了可扩展的平台(名为combigem-crisprv2.0)，用于快速筛选缓解疾病的基因敲除，以研究高阶遗传相互作用，鉴定潜在的治疗靶点组合，并部署其匹配药物方案用于进一步测试。5.3.发明概述6.提供了基于crispr的多基因敲除筛选系统和新的工具包，以用于条码化高阶组合向导rna文库的通用可扩展组装。应用该系统不仅系统地鉴定成对协同治疗性靶标组合而且系统地鉴定三元协同治疗性靶标组合，并成功验证了抑制癌细胞生长和保护免受帕金森病相关毒性的双重和三重组合方案。该系统克服了对大量高阶基因和药物组合进行实验的实际挑战，适用于揭示可成药靶标之间罕见的协同相互作用。7.系统地表征多个(即两个以上)要素之间的遗传相互作用。该系统的一个应用是能够对缓解疾病的基因组合进行高通量筛选，以鉴定二元甚至三元协同药物组合作为潜在的治疗方案。药物组合的效果由于预料不到的协同作用或拮抗作用而难以预测并且并非简单地是每种药物带来的效果的总和。由于在系统地筛选大量可能的组合方面存在技术困难，因此发现用于疾病的有效药物组合一直是重大挑战。例如，将微孔板阵列与机器人系统偶联以筛选大规模药物组合。然而，由于实验的数量随着药物的数量和所研究的组合复杂性的阶呈指数增长，这种需要大量药物的方法可能变得非常昂贵。因此，尽管联合疗法有望提高对各种疾病的治疗效果，但迄今为止仅发现了有限数量的有效组合，尤其是包含两种以上药物的组合。8.本文提供了用于多重基因组编辑或二元或三元组合crispr筛选的系统，其包括：包含人u6(hu6)启动子、小鼠u6(mu6)启动子和人h1(hh1)启动子的慢病毒载体，所述慢病毒载体表达三个或多个条码化向导rna(“grna”)寡核苷酸对的阵列，所述启动子具有包含修饰的hu6、mu6和hh1启动子序列的3’末端，以用于条码化grna寡核苷酸对的配对退火。9.本文提供了用于多重基因组编辑或二元或三元组合crispr筛选的系统，其包括：包含人u6(hu6)启动子、小鼠u6(mu6)启动子和人h1(hh1)启动子的慢病毒载体，所述慢病毒载体表达三个或多个条码化向导rna(“grna”)寡核苷酸对的阵列，hu6启动子在3’末端具有未修饰的启动子序列，mu6和hh1启动子在3’末端具有修饰的启动子序列，以用于条码化grna寡核苷酸对的配对退火。10.在一个实施方案中，条码化grna寡核苷酸对的配对退火形成rna支架。11.在一个实施方案中，组合grna文库由combigem-crisprv2.0组装。12.在一个实施方案中，慢病毒载体转染人细胞，并且条码化grna被递送至人细胞。13.在一个实施方案中，该系统进一步包括在转染后的时间点使用下一代测序对条码化grna进行定量。14.在一个实施方案中，三元组合crispr筛选是高通量筛选。15.在一个实施方案中，grna形成rna支架序列，该rna支架序列包含与组合grna文库相同的修饰的hu6、mu6和hh1启动子序列的3’末端。16.在一个实施方案中，grna形成rna支架序列，该rna支架序列包含与组合grna文库相同的hu6、mu6和hh1启动子序列的3’末端。17.本文提供了筛选至少三元药物靶标组合的方法；所述方法包括：(i)提供靶向hgsoc的可成药基因的grna文库，其中每个基因包含3个grna的阵列；(ii)转染人细胞；和(iii)使用下一代测序对条码化grna进行定量。18.本文提供了筛选至少三元药物靶标组合的系统，其包括：(i)提供表达grna的慢病毒三元组合grna表达构建体；(ii)用荧光报告基因转染人细胞；(iii)在转染后一段时间内测量荧光阳性的细胞群百分比。19.在一个实施方案中，使用流式细胞术测量荧光并且其中荧光是gfp、rfp和bfp荧光。20.在一个实施方案中，grna靶向绿色(gfp)、红色(rfp)和蓝色(bfp)荧光蛋白报告基因的外显子区域。21.在一个实施方案中，人细胞是卵巢癌细胞。22.在一个实施方案中，卵巢癌细胞是高级别浆液性卵巢癌(“hgsoc”)细胞。23.在一个实施方案中，卵巢癌细胞是ovcar8-adr和ovcar8-adr-cas9。24.本文提供了筛选至少三元药物靶标组合的方法，其包括以下步骤：(i)提供表达grna的慢病毒三元组合grna表达构建体；(ii)用荧光报告基因转染人细胞；(iii)在转染后一段时间内测量荧光阳性的细胞群百分比。25.在一个实施方案中，该方法进一步包括通过将药物与药物靶标匹配来验证三元药物靶标组合。26.在一个实施方案中，三元药物靶标组合为疾病提供了三药方案。27.在一个实施方案中，荧光是gfp、rfp或bfp。28.在一个实施方案中，至少三元药物靶标组合是协同组合。29.在一个实施方案中，疾病是癌症或帕金森病。30.本文提供了治疗hgsoc的方法，其包括施用靶向parp1、dnmt1、cdk2、fkbp1a或其组合的药物。31.在一个实施方案中，该药物包含奥拉帕尼(ola)、阿扎胞苷(aza)、塞利西利(sel)、西罗莫司(sir)或其组合。32.在一个实施方案中，该药物包含ola和aza。33.本文提供了用于基于crispr的多基因敲除筛选的系统，该系统包括条码化grna表达盒，该条码化grna表达盒包含：(i)与第一grna可操作地连接的第一启动子；(ii)与第二grna可操作地连接的第二启动子；(iii)与第三grna可操作地连接的第三启动子；和(iv)三个条码化grna测序区域，其中grna表达盒在单个载体中。34.在一个实施方案中，启动子是人u6、小鼠u6和人h1启动子，并且三个条码化grna是修饰的grna支架变体。35.在一个实施方案中，启动子包含与修饰的grna支架变体互补的修饰的3’末端序列，所述3’末端序列与修饰的grna支架变体退火。36.在一个实施方案中，该系统进一步包括：(i)对退火的3’末端序列和grna支架变体进行合并消化和连接，以形成合并的条码化组合grna文库的组装物。37.在一个实施方案中，表达盒敲除ovacr8-adr-cas9细胞中的靶标gfp基因。38.在一个实施方案中，grna支架变体包含：(i)比野生型支架更高的中靶(on-target)活性；(ii)低脱靶(off-target)活性；(iii)高中靶至脱靶(on-to-off-target)活性。39.本文提供了用于基于crispr的多基因敲除筛选的系统，其包含条码化grna表达盒，该条码化grna表达盒包含v3.11、v.3.12或v.3.13。4.附图说明40.专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。专利局将根据请求和必要费用的支付提供本专利或专利申请出版物的彩色附图副本。41.图1.现有方法和可能的工具包用于组装用于筛选的三元grna组合的可扩展性评估42.图2.combigem-crisprv2.0概述43.工作流程始于条码化grna寡核苷酸对的合成，这些寡核苷酸对被退火并以合并形式克隆到grna表达载体中。只需要一组寡核苷酸来构建用于多重crispr筛选的更高阶grna组合文库，因为启动子的3’末端是适应退火寡核苷酸的粘性末端的序列。条码化组合grna文库使用图6中所述的一锅反应进行倍增组装，并通过慢病毒递送至人细胞中。使用下一代测序对细胞池内的条码化表示进行量化。然后，通过使用匹配的药物进行验证。预组装的文库也可以灵活地扩展到更高阶的文库，或者可以使用相同寡核苷酸的子集构建更集中的文库，用于二级筛选。44.图3.使用基于crispr-cas9的多基因敲除系统的多基因功能破坏45.组合grna表达构建体的慢病毒递送有效地破坏多个靶基因。流式细胞术用于测量ovcar8-adr和ovcar8-adr-cas9细胞在感染后第11-14天对gfp、rfp和bfp荧光呈阳性的细胞群百分比。数据为平均值±sd，n＝3个生物学重复。46.图4.基于crispr的三基因敲除筛选鉴定了抑制卵巢癌细胞生长的协同三元组合47.(a)质粒和受感染的ovcar8-adr-cas9细胞池中条形码读取的分布。在质粒和细胞池中都获得了高覆盖率的三元组合grna文库(占所有预期grna组合的99.8％；32,768中的32,705)。大多数条码化grna组合是在与每个组合的平均条形码读取相差5倍范围内检测到的(由阴影区域突出显示)。48.(b)质粒池和受感染细胞池中的条形码表示(归一化条形码计数)之间的高度相关性表明三元组合grna文库至细胞中的有效慢病毒递送。bland-altman图中的水平虚线表明95％的一致性限制。49.(c-d)使用三元组合grna文库在感染后培养15天(c)和26天(d)的细胞中两个生物学重复之间的条形码表示具有高重现性。bland-altman图中的水平虚线表明95％的一致性限制。垂直虚线表明100个原始条形码计数的阈值。50.(e)确定两个生物学重复的变异系数(cv；定义为26天与15天培养细胞的归一化条形码计数的倍数变化的sd/平均值)。超过94.8％的成对grna组合在筛选中具有《1的cv。51.(f)用条码化三元组合grna文库感染的ovcar8-adr-cas9细胞培养15天和26天。使用illuminahiseq对细胞池内的条形码表示进行量化。条码化文库载体分别在第一、第二和第三表达盒中使用hh1-grna-wt支架、hu6-grna-v1支架和mu6-grna-v2支架。52.(g)筛选数据图，其显示每个条码化grna组合在感染后第26天与第15天的丰度变化(平均log2(倍数变化)；x轴)及其遗传相互作用(gi3)评分(y轴)。命中组合dnmt1+pola1+egfr、dnmt1+pola1+erbb2、和cdk4+map2k1+pola1，以红色突出显示。数据收集自两个生物学重复。53.(h)三元grna命中组合的平均log2(倍数变化)与组成其的单个和成对grna组合的比较(详见star方法)。通过单因素方差分析和dunnett事后检验分析统计显著性。*表明p《0.05。54.(i)通过mtt测定法确定的用指定的三基因敲除和对照感染的ovcar8-adr-cas9细胞的存活率。数据显示为来自生物学重复(n＝4)的平均值±sd。通过单因素方差分析和tukey事后检验分析统计显著性。*表明p《0.05；#p《0.05表明与安全港基因座三重敲除的比较。55.图5.使用匹配的三药方案验证筛选命中56.(a)通过mtt测定法确定的用aza-、flu-和/或erl处理的ovcar8-adr细胞的存活率。数据显示为来自生物学重复(n＝3)的平均值±sd。通过单因素方差分析和dunnett事后检验分析统计学显著性，*表明p《0.05。57.(b)aza-、flu-和/或erl-处理的ovcar8-adr细胞的集落形成测定。对集落数量和面积进行量化。数据显示为来自生物学重复(n＝3)的平均值±sd。通过单因素方差分析和dunnett事后检验分析统计学显著性，*表明p《0.05。58.(c)曲面图描绘了aza+flu+erl(橙色)和aza+flu+lap(青色)的药物协同作用。透明三角形平面上的圆圈表示每种两药组合的预期ic50，三药治疗的预期ic50位于该三角形的中心。灰点是单药和双药治疗观察到的ic50。红点是三药治疗观察到的ic50。凹面或凸面彩色图分别表示协同或拮抗药物相互作用。fic3是分数抑制浓度。显示了来自两个角度的视图(左图和右图)。59.(d)通过mtt测定法(左图)确定的用rib-、tra-和/或flu处理的ovcar8-adr细胞的存活率。数据显示为来自生物学重复(n＝3)的平均值±sd。通过单因素方差分析和dunnett事后检验分析统计学显著性，*表示p《0.05。曲面图(右图)描绘了如(c)所示的rib+tra+flu的药物协同作用。60.图6.组装条码化grna文库池的策略61.(a)具有不同启动子和支架变体的grna表达盒导致ovcar8-adr-cas9细胞中的靶标gfp基因的有效敲除。使用了gfpsg1。进行流式细胞术以测量对gfp荧光呈阳性的细胞群的百分比。数据为平均值±sd，n＝3个生物学重复。通过单因素方差分析和tukey事后检验分析统计显著性。显示了grna支架v1和v2中的修饰。62.(b)文库组装程序。合成寡核苷酸对(分别为oligo-f和oligo-r)并退火以产生具有20bpgrna靶序列、两个bbsi位点、8bp条形码和位于其末端的5’突出端的双链插入片段。插入物以等摩尔比混合并克隆到三个bbsi和mfe消化的含有hh1、hu6或mu6启动子的存储载体中，通过它们的兼容末端进行一锅连接反应，以产生合并的存储载体文库。对hh1和mu6的启动子序列的3’末端进行了修饰，以便可以使用相同的grna寡核苷酸池来构建文库。随后的单锅连接反应使用bbsi消化的合并存储载体文库和含有grna支架序列(wt、v1或v2)、bamhi和ecori位点以及位于其末端的5’突出端的插入片段来进行，以组装条码化grna文库池。63.图7.ovcar8-adr-cas9细胞中靶向基因的grna活性64.(a)将每个grna的效率相对于由azimuth2.0预测的中靶效率得分进行作图。使用流式细胞术确定靶向荧光报告基因的grna的效率，内源基因的数据从公布的数据获得(wong等人,2016a)。65.(b-c)对感染了grna表达构建体的细胞的靶向等位基因进行测序。ovcar8-adr-cas9细胞用编码所示成对(b)和三元组合(c)grna表达构建体的慢病毒感染。通过pcr从基因组dna中扩增靶向等位基因并克隆到存储载体中用于sanger测序。显示了每个靶向基因座的编辑效率和正在测序的单个克隆的数量。66.图8.筛选文库中使用的grna的中靶和移码得分预测67.与成对crispr筛选中使用的相比，为三元组合crispr筛选选择的grna显示出由indelphi和forecast预测的更高的平均中靶得分和更高的平均移码得分。还评估了中靶和移码预测带来的组合效果。68.图9.通过同时靶向dnmt1+pola1+egfr/erbb2和cdk4+map2k1+pola1基因但不靶向安全港基因座诱导的生长抑制69.(a-b)ovcar8-adr-cas9细胞用靶向指定基因的三重grna组合(a)，以及单独的单和/或双grna组合(b)感染。被靶向的三个安全港基因座是ppp1r12c、thumpd3-as1和ccr5。每种组合中使用的grna列于表s5。通过mtt测定确定细胞存活率。数据是来自生物学重复(n＝4)的平均值±sd。70.图10.药物组合处理的ovcar8-adr细胞的rna-seq分析71.(a)热图显示，如相比于未处理对照在用三药方案(aza+flu+erl)处理的ovcar8-adr细胞中差异表达的，被鉴定具有fdr《0.05的3,834个基因表达的log2倍数变化。包括了用相应药物对处理细胞后这些基因表达的log2倍数变化。基于pearson相关性对基因和样品进行分层聚类。72.(b)显示差异表达基因的映射通路的矩阵，差异表达基因在用三药方案(aza+flu+erl)处理的ovcar8-adr细胞中比在未处理的对照中至少20％上调(橙色)或下调(蓝色)，而且在用三药方案处理的细胞中比在用相应的二药方案处理的所有细胞中也具有》10％、》5％或《5％的倍数变化。x轴顶部的条表示不同绿色阴影检测到的倍数变化水平。每个暗点表示基因存在于特定通路中。73.图11.aza-flu-erl/lap在不同抑制浓度下评估的ovcar-adr细胞中的协同药物相互作用74.显示了描绘aza+flu+erl(橙色)和aza+flu+lap(青色)的药物相互作用和分数抑制浓度(fic3)得分的曲面图。ic50图如图5c所示。75.图12.aza-flu-erl/lap在不同抑制浓度下评估的ovsaho细胞中的协同药物相互作用76.显示了描绘aza+flu+erl(橙色)和aza+flu+lap(青色)的药物相互作用和分数抑制浓度(fic3)得分的曲面图。77.图13.基于crispr的双基因敲除筛选鉴定了抑制卵巢癌细胞生长的药物对78.(a)质粒中条形码读取的分布和感染后9天的ovcar8-adr-cas9细胞池。在质粒和细胞池中分别获得了所有预期grna组合的99.7％(25,281中的25,201)和99.0％(25,281中的25,027)。大多数条码化grna组合是在与每个组合的平均条形码读取相差5倍范围内检测到的(由阴影区域突出显示)。79.(b)质粒池和受感染细胞池中的条形码表示(归一化条形码计数)之间的高度相关性表示成对grna文库至细胞中的有效慢病毒递送。bland-altman图中的水平虚线表示95％的一致性限制。80.(c-d)在使用成对grna文库感染后培养15天(c)和21天(d)的细胞中，两个生物学重复之间的条形码表示具有高重现性。bland-altman图中的水平虚线表示95％的一致性限制。垂直虚线表示100个原始条形码计数的阈值。81.(e)确定两个生物学重复的变异系数(cv；定义为21天与15天培养细胞的归一化条形码计数的倍数变化的sd/平均值)。超过99.2％的成对grna组合在筛选中具有《1的cv。82.(f)用条码化成对grna文库感染的ovcar8-adr-cas9细胞培养15天和21天。使用illuminahiseq对细胞池内的条形码表示进行量化。条码化文库载体分别在第一和第二表达盒中使用hh1-grna-wt支架和hu6-grna-v1支架。83.(g)用于比较每个条码化grna组合在感染后第21天与第15天的丰度变化的火山图。命中组合dnmt1+parp1和fkbp1a+cdk2分别以蓝色和红色突出显示。数据收集自两个生物学重复。84.(h-j、m-n)通过mtt测定法确定的指示grna感染的ovcar8-adr-cas9细胞(h)和药物处理的ovcar8-adr细胞(i、j、m、n)的细胞存活率。在(j和n)中，通过将每个药物处理组与未处理对照组进行比较来计算生长抑制百分比。通过blissindependent模型和hsa模型测量药物协同作用。用8μmola和1.2μmaza(j)以及5μmsel和0.5μmsir(n)处理所带来的生长抑制效果作为示例作图说明，虚线表示基于blissindependent模型的预期药物组合效果。数据显示为来自生物学重复(h中n＝3；i和j中n＝6；m和n中n＝8)的平均值±sd。85.(k、o)ola-和/或aza-(k)以及sel-和/或sir-(o)处理的ovcar8-adr细胞的集落形成测定。对集落数量和面积进行量化。数据显示为来自生物学重复(n＝3)的平均值±sd。86.(l、p)ola-和/或aza-(k)以及sel-和/或sir-(o)处理的ovcar8-adr细胞的细胞周期分析。量化每个细胞周期阶段的细胞百分比。数据显示为来自生物学重复(n＝3)的平均值±sd。87.通过单因素方差分析和tukey事后检验分析h-p的统计显著性。*p《0.05，**p《0.01和****p《0.0001；j-l和n-o中的#p《0.05表示与未处理对照的比较。88.图14.aza和ola以及sel和sir对ovsaho和kuramochi细胞带来的生长抑制作用89.(a-b)通过mtt测定法测量指示的药物处理对ovsaho(a)和kuramochi(b)细胞的生长抑制，并通过将每种药物处理与未处理的对照进行比较来计算。通过blissindependent模型和hsa模型测量药物协同作用。右图中图中的虚线表示基于blissindependent模型的预期药物组合效果。数据是来自生物学重复(n＝4)的平均值±sd。通过单因素方差分析和tukey事后检验分析统计显著性。*p《0.05；#p《0.05表示与未处理对照的比较。90.图15.基于crispr的双基因敲除筛选鉴定了增强对帕金森病毒性的保护的药物组合91.(a)质粒中条形码读取的分布和受感染的sk-n-mc-cas9细胞池。在质粒和细胞池中分别获得了所有预期grna组合的99.1％(7,569中的7,499)和98.7％(7,569中的7,467)。大多数条码化grna组合是在与每个组合的平均条形码读取相差5倍范围内检测到的(由阴影区域突出显示)。92.(b)质粒池和受感染的细胞池中的条形码表示(归一化条形码计数)之间的高度相关性表示成对grna文库至细胞中的有效慢病毒递送。93.(c)培养10天和22天的细胞池中条形码表示之间的高度相关性表示crispr介导的基因敲除不会导致严重的细胞死亡。94.(d-e)未处理的(d)和鱼藤酮处理的(e)细胞中两个生物学重复之间的条形码表示具有高重现性。(d)中的虚线表示20个原始条形码计数的阈值。r是pearson相关系数。95.(f)用条码化成对grna文库感染的sk-n-mc-cas9细胞用鱼藤酮处理或者保持未处理。使用illuminahiseq对细胞池内的条形码表示进行量化。96.(g)双grna表达构建体的慢病毒递送有效地破坏sk-n-mc-cas9细胞中的多个靶基因。流式细胞术用于测量感染后第6天对gfp和rfp荧光呈阳性的细胞群百分比。数据为平均值±sd，n＝3个生物学重复。97.(h)用于比较鱼藤酮处理的与未处理的细胞池中每个条码化grna组合的丰度变化的火山图。命中组合hsp90b1+hdac2以红色突出显示。数据收集自两个生物学重复。98.(i)在鱼藤酮存在下，通过mtt测定法确定的指示sgrna感染的sk-n-mc-cas9细胞的存活率。数据显示为来自生物学重复(n＝4)的平均值±sd，左图和右图的数据从相同的实验获得。99.(j-k)在鱼藤酮存在下，分别通过mtt测定法和dapi摄取测定法确定的指示药物处理的sk-n-mc细胞(j)和ipsc衍生的多巴胺能神经元(k)的细胞存活率。数据显示为来自生物学重复((j)中n＝9；(k)中n＝3)的平均值±sd。100.(l)在mpp+存在下，通过mtt测定法确定的指定药物处理的sk-n-mc细胞的细胞存活率。数据显示为来自生物学重复(n＝8)的平均值±sd。101.(m)对用指定药物喂养的野生型和表达α-突触核蛋白的果蝇中每个小眼的感杆数量进行量化。17-dmag和伏立诺他的组合恢复了表达α-突触核蛋白的果蝇眼睛中每个小眼的感杆数量。代表性图像显示用指定药物喂养的野生型和表达α-突触核蛋白的果蝇的感杆。数据是来自5-10只果蝇的至少100个小眼的平均值±sd。102.通过单因素方差分析和tukey事后检验分析(i-m)中的统计显著性。*p《0.05、**p《0.01和****p《0.0001表示指示样品之间存在显著差异。在(i)中，#p《0.05、##p《0.01、###p《0.001和####p《0.0001表示与相应的无grna对照的比较。虚线表示基于blissindependent模型的预期药物组合效果。103.图16.工程化grna支架变体表现出改进的中靶活性和低脱靶活性。104.(a)使用的grna支架序列的序列。105.(b-c)含有具有中靶(b)和脱靶(c)位点的报告构建体的ovcar8-adr细胞用编码野生型或opti-spcas9的慢病毒感染。grna支架变体的编辑效率测量为具有耗竭的rfp荧光的细胞的百分比。106.(d)评估grna支架变体以使用靶向内源基因座的grna进行有效中靶编辑。使用t7核酸内切酶i(t7e1)测定法测量具有插入缺失的位点百分比。确定了grna支架变体的中靶活性与支架活性的比率，并针对测试的5个基因座显示了插入缺失形成的归一化百分比的中位数和四分位数范围。每个基因座测量3次。107.(e)与指示grna配对的grna支架变体图的guide-seq全基因组特异性谱。脱靶位点的错配位置是彩色的，并且使用guide-seq读取计数作为给定位点切割效率的量度。108.5.发明详述109.靶向多个通路的联合药物治疗可以限制癌细胞中耐药表型的发展，因为细胞更难激活多种代偿性生存机制。110.本公开涉及能够实现高效、多重基因组编辑和crispr筛选的系统和组合物。本研究开发的工程化向导rna支架和启动子能够基于先前称为combigem-crispr的组装方法进行三元组合crispr筛选，并可用于提高常规实验和应用中的基因组编辑效率。来自现有技术的高通量crispr筛选只能研究向导rna之间的成对相互作用，而不能研究那些具有更高复杂性的(如三个或更多个向导rna之间的相互作用)。复杂遗传相互作用的系统性筛选通过工程化支架和启动子序列的生成来实现，这些序列可以最大限度地减少由于长同源序列导致的慢病毒载体重组，并允许使用相同的向导rna寡核苷酸池来构建高质量的组合向导rna文库。111.从技术上讲，向导rna支架序列经过工程改造以最大限度地减少由于长同源序列导致的慢病毒载体重组，并且对hh1和mu6的启动子序列的3’末端进行修饰使得相同的grna寡核苷酸池可用于构建组合向导rna文库。与野生型对应物相比，工程化的向导rna支架和修饰的启动子序列在驱动向导rna表达方面显示出更高或相当的活性。112.5.1combigem-crisprv2.0的设计113.combigem-crisprv2.0工具包包括文库载体的附加设计，使得待合成的仅一组可重复使用的寡核苷酸可用于进行高阶组合crispr筛选。申请人和其他人已经表明，可以通过使用双向导rna(grna)表达盒同时靶向两个基因来进行crispr筛选(chow等人,2019；du等人,2017；han等人,2017；najm等人,2018；shen等人,2017；wong等人,2016a)。本文评估了现有方法和其他可能的工具包用于组装用于筛选的三元组合grna文库的可扩展性(图1)。考虑使用基于寡核苷酸合成的方法来构建具有maxmbxmc组合的文库，必须首先设计和合成相同数量的含有grna前间隔序列(protospacer)的寡核苷酸(即，maxmbxmc)以包括所有组合，然后依次插入启动子和支架序列。缺点是(1)所有中间克隆步骤都需要大规模细菌转化以保持高文库覆盖率，这在技术上比仅需要在最终组装步骤时进行大规模转化的combigem-crisprv2.0方法要求更高，以及(2)刚性克隆框架不允许在组装后插入额外的grna来构建高阶文库。不灵活的工作流程也限制了寡核苷酸在构建更紧凑的二级筛选文库时的可重用性。例如，如果构建成对的grna文库用于鉴定待包括在三元grna文库中的核心效应子，则构建高阶文库需要合成一组新的寡核苷酸以完成文库的重新组装。替代文库组装策略是通过基于gibson(gibson等人,2009)或golden-gate(engler等人,2008)的方法，这需要设计相邻grna表达单元的重叠区域或互补突出端以将多个部分融合在一起。然而，这些方法也不允许将额外的部分引入到预先存在的条码化文库中。combigem-crisprv2.0策略提供了真正可扩展的方案，该方案能够对额外的条码化grna表达单元进行倍增组装，以从n扩展到n+1组合crispr文库(图2)。还可以通过从用于另一筛选或用于更高分辨率的二级筛选的存储在载体中的grna套件中选择，从选定的grna中定制和重新组装文库。此外，为每个组装组合创建唯一的条形码允许通过短测序读取对其进行快速表征，从而降低测序成本和通过长读取产生的潜在错误。因此，决定采用这种方法来构建用于筛选应用的三元组合grna文库。114.由于先前的combigem工具包不能直接适用于组装三元甚至更高阶的组合grna文库，本文进一步创建了“一刀切”的设计，以便使用总是只需要合成m(而不是nxm)对寡核苷酸的多grna表达盒来构建m个向导rna的n元组合crispr筛选文库。为了确保三个grna在单一细胞中的表达，将多个grna表达盒组装在一个载体中。在表达盒中使用了多个启动子(包括人u6、小鼠u6和人h1)(adamson等人,2016；ma等人,2014；vidigal和ventura,2015)和修饰的grna支架(adamson等人,2016；briner等人,2014；dang等人,2015；grevet等人,2018)(图6)，这最大限度地减少了由于长同源序列而导致的慢病毒载体重组。然而，使用多个启动子需要多组寡核苷酸，和/或额外的pcr和限制性内切酶消化反应，以构建用于文库组装的不同表达盒。为了允许研究人员仅合成和退火一组寡核苷酸作为组成部分，以构建用于多重crispr筛选的所有可能的grna高阶组合，通过将启动子的3’末端序列修饰为与退火寡核苷酸的粘性末端互补的序列来进行序列适应，并且这些启动子表达grna并产生有效的基因敲除(图6)。这些新的标准化载体部件可用于灵活组装高阶组合grna文库和可扩展的组合crispr筛选。115.在一些实施方案中，启动子具有如下所示的序列。116.》野生型人u6启动子:117.agagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg118.》修饰的小鼠u6启动子:119.gatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttcctagtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagctacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattattttaaaaaacagcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttcaccg120.》野生型小鼠u6启动子(genebank:x06980.1)121.gatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttcctagtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagctacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattattttaaaaaacagcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagcctt122.》修饰的人h1启动子:123.ttcgaacgctgacgtcatcaacccgctccaaggaatcgcgggcccagtgtcactaggcgggaacacccagcgcgcgtgcgccctggcaggaagatggctgtgagggacaggggagtggcgccctgcaatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccactcttcaccg124.》野生型人h1启动子(genebank:x16612.1)125.ttcgaacgctgacgtcatcaacccgctccaaggaatcgcgggcccagtgtcactaggcgggaacacccagcgcgcgtgcgccctggcaggaagatggctgtgagggacaggggagtggcgccctgcaatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccactctt126.5.2基于crispr-cas9的多基因敲除系统的建立127.构建了含有多个grna表达盒的慢病毒组合grna表达载体，以有效地同时敲除三个靶基因(图3)，并使用靶向绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)和蓝色荧光蛋白(bfp)报告基因外显子区域的grna评估其在人细胞(ovcar8-adr)中的功能。产生携带bfp报告基因和组合grna单元的慢病毒以感染稳定表达rfp和gfp报告基因的ovcar8-adr和ovcar8-adr-cas9细胞。进行流式细胞术分析以确认报告蛋白的双敲除和三敲除的有效生成(分别》81％和》74％)(图3)。当使用野生型(wt)或修饰的grna支架时，观察到类似的敲除效率。结果表明，慢病毒载体可用于递送grna以产生多基因敲除，并且该载体设计用于本研究中的组合crispr-cas9筛选。128.5.3用于协同抗癌基因组合的三元组合crispr-cas9筛选129.靶向多个通路的联合药物治疗可以限制癌细胞中耐药表型的发展，因为细胞更难激活多种代偿性生存机制(bozic等人,2013)。进行了高通量研究以寻找针对高级别浆液性卵巢癌(hgsoc)(最普遍的亚型，其贡献了所有卵巢癌死亡人数的三分之二(bowtell,2010))的有效治疗组合。使用上述基于crispr的多基因敲除系统，应用combigem-crisprv2.0组装了高覆盖率(99.8％)三元组合grna文库(其中32x32x32grna＝32,768个总组合)(图4a-e)。该文库包括15个可成药蛋白质编码基因(其中每个基因2个grna)，这些基因通常在抗癌治疗中被靶向并且其表达在ovcar8-adr(已建立的hgsoc细胞模型(baratta等人,2015))以及其他基于nci-60蛋白质组数据库的卵巢癌细胞(gholami等人,2013)中报道，以证明本方法的可行性(表s2和s3)。为了以高速率产生组合基因敲除，基于azimuth2.0模型(doench等人,2016)选择了具有预测的高中靶(和低脱靶)活性的grna。比较了grna的中靶功效评分和插入缺失生成效率，并观察到中靶功效评分在很大程度上预测了grna在ovcar8-adr细胞中的效率(图7a)。基于azimuth2.0模型选择了中靶评分》0.64的grna，并且它们中的大多数在新开发的indelphi和forecast模型下分析也具有高移码生成率(图8)(allen等人,2018；shen等人,2018)。来自geckov2文库(shalem等人,2014)的在人基因组中没有靶向基因座的两个非靶向对照grna也包括在文库中作为参考。130.表s2131.卵巢癌研究中包括的成药基因列表132.133.[0134][0135]表s3[0136]本研究所使用的grna列表[0137][0138][0139][0140]然后进行了合并筛选以分离调节ovcar8-adr生长的三元grna组合(图4f)。将第15天和第26天组之间的条形码丰度与产量log2值进行比较，以衡量细胞生长。基于遗传筛选数据，(455个中的)3个三元基因组合具有《-1的平均log2比率(基于从第26天与第15天培养的细胞相比具有至少减少50％的条形码计数的两个生物学重复获得的数据)和《-0.2的gi3评分(图4g和表s4)。这些三元组合(靶向dnmt1+pola1+egfr或erbb2，以及cdk4+map2k1+pola1)也显示出与其各自的单一和成对组合显著不同的生长调节作用(图4h和表s4)。因为它们显示出强烈的生长抑制作用和强烈的协同遗传相互作用，所以选择了这三种组合用于进一步的表征。它们的生长抑制作用(对于dnmt1+pola1+egfr或erbb2，六种测试的grna组合降低了51.4％至88.4％，对于cdk4+map2k1+pola1，两种测试的grna组合降低了50.5％和54.9％)通过单个非合并测定进一步确认，并且不是由crispr-cas9产生的过多dna双链断裂引起的假阳性(aguirre等人,2016；munoz等人,2016)，因为同时靶向三个安全港基因座不会导致强烈的生长停滞(图4i、7c和9)。此外，基于使用cellminer的分析，dnmt1、pola1、egfr、erbb2、cdk4和map2k1基因座的dna拷贝数在ovcar8-adr的基因组中没有大量扩增(reinhold等人,2012)。[0141]表s4[0142][0143][0144][0145][0146][0147][0148][0149]5.4筛选命中和匹配药物组合的验证[0150]阿扎胞苷(aza)、氟达拉滨(flu)和厄洛替尼(erl)分别用于靶向dnmt1、pola1和egfr。拉帕替尼(lap)用于抑制erbb2，同时它也作用于属于同一erb蛋白家族的egfr。aza、flu和erl/lap的三药治疗显示出比单药和双药治疗明显更强的生长抑制作用(图5a-b)，并且在将用三药方案处理的细胞与所有相应的二药组合进行比较时还导致了一组不同的扰动基因，包括涉及细胞周期调节的基因(图10)。使用diamond评分法确认了三种药物抑制卵巢癌细胞生长的协同作用(图5c)(cokol等人,2017)。在ovcar8-adr细胞中，aza+flu+erl和aza+flu+lap的分数抑制浓度(fic)评分分别为0.64和0.8。通过比较单药、双药和三药治疗时达到半数最大抑制浓度(ic50)所需的药物剂量，发现aza+flu+erl的三药配方对每种组分的需求减少了约4.5倍(对于aza+flu+lap，减少了约3.7倍)。在测量其他抑制浓度(ic30、ic40和ic60)时观察到类似的结果(图11)。在ovsaho细胞中也检测到三种药物(aza+flu+erl或lap)之间的协同作用(图12)。还证实了第三筛选命中(即cdk4+map2k1+pola1)的三种匹配药物(瑞博西尼(rib)+曲美替尼(tra)+flu)在抑制卵巢癌细胞生长方面的协同作用(图5d)。这些结果表明，该平台能够实现高通量筛选和协同三元治疗组合的鉴定。[0151]5.5针对卵巢癌的药物对的crispr-cas9筛选[0152]通过使用combigem-crisprv2.0(图6b)的一锅反应，构建了靶向52个可成药基因的配对grna文库(每个基因3个grna；表s2和s3)，其表达显示在ovcar8-adr以及基于nci-60蛋白质组数据库的其他卵巢癌细胞中(gholami等人,2013)。选择了中靶评分得分》0.63(具有》约80％的预测效率)的grna，除了其中一个具有0.60的评分。来自geckov2文库(shalem等人,2014)的在人基因组中没有靶向基因座的三个对照grna被包括在内作为参考。然后通过慢病毒将成对的grna文库池(具有159x159grna＝25,281个总组合)递送到ovcar8-adr细胞中。使用申请人建立的实验流程(wong等人,2015；wong等人,2016)，进行illuminahiseq以确认成对文库的高覆盖率(》99.0％)以及质粒和感染细胞池之间条形码表示的高度相关性(图13a-e)。使用发明人先前研究中使用的类似时间窗口，将第15天和第21天组之间的条形码丰度与产量log2值进行比较，以衡量细胞生长(图13f)。基于要求平均log2比率《-1的选择标准(基于从两个生物学重复中获得的数据，与第15天培养的细胞相比，第21天的条形码计数至少减少50％)和靶向相同基因对的检测到至少p《0.1的多个grna，两种组合(parp1+dnmt1和cdk2+fkbp1a分别以蓝色和红色在图13g中突出显示)被定义为最高筛选命中。这两个双基因敲除带来的生长抑制使用单独的非合并测定法进行了验证，并且不是由任一基因的敲除引起的(图13h；7b)。[0153]然后，通过用药物对处理ovcar8-adr细胞来评估这两种命中组合带来的生长抑制作用。奥拉帕尼(ola)、阿扎胞苷(aza)、塞利西利(sel)和西罗莫司(sir)分别用作靶向parp1、dnmt1、cdk2和fkbp1a的药物。据报道，这些药物分子对其靶标具有有效的作用(mcclue等人，2002；muvarak等人，2016；sabers等人，1995；wishart等人，2006；yang等人，2017)。我们的结果表明，ola和aza协同地抑制ovcar8-adr细胞的生长(图13i-k)并诱导g2细胞周期停滞(图13l)，而与sel和sir的联合治疗发挥了累加效应，抑制细胞生长(图13m-p)。当这些药物组合用于处理ovsaho和kuramochi(hgsoc的另外两个特征细胞模型，coscia等人，2016；domcke等人，2013)时，观察到类似的生长抑制作用(图14)。我们的结果还证实了以下观察结果：parp1抑制剂他拉唑帕尼(talazoparib)和dnmt1抑制剂地西他滨(guadecitabine)的共同施用协同地抑制peo1和peo4细胞以及ovcar4异种移植模型中的肿瘤生长(pulliam等人，2018)，进一步表明parp1+dnmt1抑制剂组合作为卵巢癌的有效治疗选择。[0154]5.6针对帕金森病毒性的药物对的crispr-cas9筛选[0155]本筛选方法还可用于寻找有效的治疗组合，以增强对其他疾病表型如帕金森病(pd)相关毒性的保护。组装了另一个靶向28个可成药基因的高覆盖率(99.1％)成对grna文库，据报道这些基因的消融或匹配的药物抑制剂可抑制神经元毒性(图15a-e；表s9)。该文库通过慢病毒递送到sk-n-mc-cas9细胞中以产生双基因敲除，然后用鱼藤酮处理细胞以诱导pd相关毒性(图15f-g)。比较鱼藤酮处理组和未处理组之间的条形码丰度，以鉴定保护细胞免受鱼藤酮诱导的毒性的富集的grna组合。基于要求平均log2倍数变化》0.378的选择标准(基于从两个生物学重复中获得的数据，鱼藤酮处理的细胞与未处理的细胞相比，条形码计数至少多30％)和靶向相同基因对的检测到p《0.05的多个grna，我们的基因筛选将hsp90b1+hdac2鉴定为最高命中(其中鉴定了六个grna组合，条形码计数具有平均51.6％的增加)，其在鱼藤酮处理后提高细胞存活率(图15h；表s8)。hsp90b1+hdac2的同时敲除带来的保护作用在非合并测定中得到验证，其比任一基因的敲除所带来的保护作用更大(图15i)。进一步证实了匹配药物(17-(二甲氨基乙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素(17-dmag)+伏立诺他)对这种鉴定的组合的保护作用。在sk-n-mc细胞(图15j)和ipsc衍生的多巴胺能神经元(图15k)中，与单药治疗相比，联合药物治疗增强了细胞对抗鱼藤酮诱导的毒性的存活率。此外，观察到这种药物组合降低了培养细胞中由mpp+处理诱导的毒性(图15l)和转基因果蝇中的α-突触核蛋白表达(图15m)(另外两种充分表征的pd模型)。我们的结果证明了我们的平台用于筛选针对不同疾病表型的治疗组合，包括用于减轻神经退行性疾病表型的治疗组合的多功能性。[0156]表s8[0157]在帕金森疾病研究中鉴定的具有平均log2比率＞0.378和p＜0.05的成对grna组合列表[0158][0159]表s9[0160]帕金森疾病研究中包括的成药基因列表[0161][0162]5.7讨论[0163]总之，已经建立了基于crispr的多基因敲除筛选平台，以解决快速鉴定有效三元治疗组合的未满足需求。通过将药物作用机制与特定基因配对，有助于加速鉴定用于指导二次筛选的有效组合，并将大量可能的组合缩小到少数表现最佳的命中以用于进一步测试。已经证明，使用基于crispr的筛选对三元组合进行的系统表征发现了具有协同相互作用的罕见组合，因为组合中的大多数显示出缓冲相互作用，并且能够验证所有三种筛选命中具有强烈的生长抑制作用和三元相互作用。combigem-crisprv2.0平台具有广泛的用途，因为其还可用于鉴定抑制癌细胞生长(图13-14)和增强对其他疾病表型(如帕金森病(pd)相关毒性)的保护(图15)的新的二药方案，以及通过使用额外的工程化启动子和支架(包括新近工程化的v3.11、v.3.12和v3.13支架(见图16))扩展到分析》3个遗传组分之间的相互作用，以用于基于crispr的多重编辑(reis等人,2019)。[0164]如图16中所述，工程化的grna支架变体表现出改进的中靶活性和低脱靶活性。a，使用的grna支架序列的序列。b、c，用编码野生型或opti-spcas9的慢病毒感染含有具有中靶(b)和脱靶(c)位点的报告构建体的ovcar8-adr细胞。grna支架变体的编辑效率测量为具有耗竭的rfp荧光的细胞的百分比。d，评估grna支架变体以使用靶向内源基因座的grna进行有效的靶向编辑。使用t7核酸内切酶i(t7e1)测定法测量具有插入缺失的位点百分比。确定了grna支架变体的中靶活性与支架活性的比率，并针对测试的5个基因座显示了插入缺失形成的归一化百分比的中位数和四分位数范围。每个基因座测量3次。e，与指示grna配对的grna支架变体组的guide-seq全基因组特异性谱。脱靶位点的错配位置是彩色的，并且使用guide-seq读取计数作为给定位点切割效率的量度。[0165]该平台还具有通用性，可与基于dcas9的crispr干扰系统(qi等人,2013)一起使用，以部分降低靶基因表达以模拟药物抑制剂的作用。该平台可以与单细胞rna-seq等其他技术相结合，以探索不同的细胞特征，并利用现有知识为可成药基因相互作用网络的生成做出贡献(adamson等人,2016；bassik等人,2013；chow等人,2019；du等人,2017；han等人,2017；shen等人,2017)。本研究中提出的平台易于实施，对于扰乱多层遗传网络以了解复杂的生物系统和设计新的联合疗法具有重要价值。6.实施例[0166]实验模型和受试者细节[0167]细胞培养和细胞系的生成[0168]hek293t(雌性)和sk-n-mc(雌性)细胞获自美国典型培养物保藏中心(atcc)。ovcar8-adr(雌性)细胞由t.ochiya(日本国立癌症中心研究所，日本)赠送。(honma等人,2008)ovcar8-adr细胞的身份通过细胞系鉴定测试(geneticadnalaboratories)确认。kuramochi(雌性)和ovsaho(雌性)细胞获自日本研究生物资源(jcrb)细胞库。ipsc衍生的多巴胺能神经元获自tgdlifecompanylimited。ovcar8-adr-cas9和sk-n-mc-cas9细胞是通过将pawp30(addgene,73857)分别转导到ovcar8-adr和sk-n-mc细胞中生成的，然后使用zeocin(lifetechnologies)进行选择以获得稳定的cas9整合细胞。本研究中使用了化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)cas9。稳定表达rfp和gfp的ovcar8-adr报告细胞是通过用pawp9转导细胞生成的，然后根据gfp和rfp信号进行分类。然后用pawp30感染报告细胞以在吉欧霉素(zeocin)选择后稳定整合cas9。hek293t和s-n-mc细胞在补充有10％fbs和1x抗生素-抗真菌剂(lifetechnologies)的dmem中在37℃和5％co2下培养。kuramochi、ovsaho和ovcar8-adr细胞在补充有10％fbs和1x抗生素抗真菌剂的rpmi1640中在37℃和5％co2条件下培养。细胞每三个月或四个月检查支原体污染并且从未检测出阳性。[0169]方法细节[0170]质粒构建[0171]本研究中使用的载体(表s5)是通过包括pcr、寡核苷酸退火、限制性内切酶消化、连接和gibson组装的标准分子克隆策略生成的。定制的寡核苷酸购自genewiz。将载体转化到大肠杆菌菌株dh5α感受态细胞中，并用氨苄青霉素(100μg/ml，usb)或羧苄青霉素(50μg/ml，teknova)选择。dna通过plasmidmini(takara和tiangen)或midi制备(qiagen)试剂盒提取和纯化。载体序列用sanger测序验证。[0172]表s5[0173][0174]为了构建具有小鼠u6(mu6)和人h1(hh1)启动子-grnawt支架序列的存储载体，分别从小鼠和人基因组dna中扩增启动子序列，并将其克隆到pawp28(addgene，73850)的载体骨架中。pawp28是具有人u6(hu6)启动子-grnawt支架序列的存储载体。通过基于pcr的诱变产生具有hu6-grnav1支架和mu6-grnav2支架的存储载体。为了驱动grna表达以靶向感兴趣的基因，将具有grna靶序列的寡核苷酸对合成、退火并通过t4dna连接酶(newenglandbiolabs)克隆到bbsi消化的存储载体中。为了生成用于表达靶向gfp、rfp和bfp基因的单个grna的慢病毒载体，通过用bglii和ecori酶(thermofisherscientific)消化从存储载体中释放的grna表达盒并使用通过用bamhi和ecori酶(thermofisherscientific)消化载体产生的相容粘性末端进行连接克隆到pawp9载体(addgene,73851)。为了构建慢病毒载体以表达多个靶向荧光蛋白的grna，通过用bglii和ecori酶消化从存储载体中释放具有hu6-grna-v1(或wt)支架的第二grna表达盒，并将其连接到含有具有hh1-grna-wt支架的第一grna表达盒的bamhi和ecori消化的存储载体。类似地，通过消化从存储载体中释放具有mu6-grna-v2(或wt)支架的第三grna表达盒，并将其连接到包含第一和第二grna表达盒的存储载体中。然后通过pcr扩增来自存储载体的成对或三元grna表达盒生成慢病毒载体，并通过gibson组装克隆到sbfi消化的pfugw载体骨架(pawp40)中。[0175]向导rna文库的设计和组装[0176]本研究中使用的grna基于gppsgrnadesigner设计(表s3)。对于成对的grna文库，基于以下标准，每个靶基因选择了三个grna：1)中靶功效评分》0.6；2)脱靶等级《100；和3)靶位点在蛋白质编码序列的5-65％范围内。排除了含有bamhi、ecori、bglii和mfei消化位点的grna序列，以避免与combigem不兼容。对于三元组合grna文库，使用相同的标准为每个靶基因选择两个grna，但它们的中靶功效评分均》0.64。应用indelphi和forecast预测grna的移码率。将grna序列输入blast以提取grna的70个核苷酸的上下文序列。pam序列索引位于70-nt序列中，并与上下文序列一起输入到从github下载的indelphi和forecast中。k562细胞系是indelphi中使用的预测模型，输出的移码评分从“移码频率”选项中提取。将forecast的输出摘要文件输入到python代码中，通过将靶标移码类别中不是三的倍数的百分比相加，然后将总和除以10计算预测的移码频率。[0177]为了组装grna文库(图6b)，将寡核苷酸对与grna靶序列、两个bbsi限制性消化位点和独特的8-bp条形码退火，以相等的摩尔比合并，并克隆到含有hh1、hu6和mu6启动子序列的存储载体骨架中(分别为pawp92、awp28和pawp100)。然后将grna支架序列(wt、v1和v2)插入载体中，以产生条码化单个grna表达盒的三个合并文库。使用combigem-crispr方法组装组合的grna文库(wong等人,2016a)。通过用bglii和mfei酶消化，从含有hh1-grna-wt支架的存储载体中释放第一组插入片段，并连接到bamhi和ecori消化的pawp12(addgene，72732)中，以在慢病毒载体中生成条码化单个grna文库。然后，通过消化从含有hu6-grna-v1支架的存储载体中释放第二组插入片段，并连接到含有第一grna表达盒的慢病毒载体中，以生成条码化成对grna文库。类似地，从含有mu6-grna-v2支架的存储载体中释放第三组插入物，并插入到含有两个grna表达盒的慢病毒载体中，以生成条码化三元组合grna文库。使用慢病毒将三元组合grna文库递送到ovcar8-adr细胞中，并对从单细胞衍生克隆中提取的基因组dna进行sanger测序分析，并确认大多数组装的条码化grna构建体(8个集落中的7个)含有预期的grna靶序列。为了构建验证实验中使用的单个组合grna载体，除了不合并退火的寡核苷酸对之外，使用相同的组装策略。[0178]慢病毒载体的生成和转导[0179]本研究使用第二代慢病毒载体系统。根据制造商的说明在6孔板中用fugenehd转染试剂(promega)转染hek293t细胞，其中每孔0.5μgpcmv-vsv-g、1μgpcmv-dr8.2-dvpr和0.5μg各自的慢病毒载体。在转染后48和72小时收集含有慢病毒的上清液，然后将其组合并通过0.45μm聚醚砜膜(pall)过滤。对于常规转导，在8μg/ml聚凝胺(sigma)存在下，将300μl过滤后的上清液加入12孔板的一个孔中，其中细胞融合度为约30％。对于文库转导，将表达cas9的细胞以约50％的融合度接种到150-mm培养皿中，其中细胞数大致等于文库大小的400倍，并由病毒以约0.3的感染复数(moi)进行转导，以确保大多数细胞只由一种病毒粒子感染。[0180]流式细胞术、细胞周期分析和细胞分选[0181]为了制备用于流式细胞术的样品，将细胞用胰蛋白酶消化并重悬浮于facs缓冲液(含2％fbs的pbs)中。bdlsrfortessa分析仪(bectondickinson)用于通过561nm黄绿色激光(610/20nm)、488nm蓝色激光(530/30nm)和405nm紫色激光(450/50nm)分别检测turborfp、egfp和mtagbfp的信号。对于细胞周期分析，用冰冷的70％乙醇在4℃下固定细胞1小时，然后在室温下通过用pbs代替乙醇15分钟再水化。为了去除rna，将rnasea(10mg/ml)添加到细胞中，并在37℃下孵育15分钟。用碘化丙啶(pi；invitrogen)在室温下对基因组dna内容物避光染色1小时。使用bdlsrfortessa分析仪通过561nm黄绿色激光(586/15nm)检测信号。flowjo软件(v10.5.3,bectondickinson)用于数据分析。对于细胞分选，除了facs缓冲液中添加了2x抗生素-抗真菌剂之外，样品的制备与facs分析类似。使用配备有100-μm喷嘴(24psi，频率为39.2khz)的bdinflux细胞分选仪(bectondickinson)。通过488nm蓝色激光(530/40nm)检测gfp阳性细胞，并使用1.0droppure模式分选。对于由筛选文库感染的细胞，没有收集具有最强gfp信号的1-2％细胞，以最大限度地减少获得由多个病毒粒子感染的细胞的机会。收集了比文库大小至少多100倍的细胞。[0182]条形码读取的样品制备[0183]对于文库转导的细胞池，使用dneasy血液和组织试剂盒(qiagen)从细胞中提取基因组dna，并通过quant-itpicogreendsdna测定试剂盒(lifetechnologies)进行定量。为了提取含有298bp条形码的片段，每50μlpcr反应中使用0.5ng文库质粒dna和800ng基因组dna，使用kapahifihotstartready-mix(kapabiosystems)进行pcr扩增。使用的正向和反向引物是5’‑ggatccgcaacggaattc-3’和5’‑ggttgcgtcagcaaacacag-3’。pcr扩增保持在指数期以最小化pcr偏差。为了确保从基因组dna中扩增出足够的文库覆盖率，分别对用于研究卵巢癌和帕金森病的成对文库进行了20次和10次pcr反应，并对三元组合文库进行了30次pcr反应。然后通过使用kapahifihotstartready-mix进行pcr，将illumina适配器和测序索引添加到扩增子中。使用的正向和反向引物是5’‑caagcagaagacggcatacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctggttgcgtcagcaaacacag-3’和5’‑aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctnnnnnnnn(n1-4)ggatccgcaacggaattc-3’，其中nnnnnnnn表示分配给每个实验样品的特定索引条形码并且(n1-4)表示为增加测序文库的多样性而添加的1至4个核苷酸。使用比例为1:0.5和1:0.95的agencourtampurexp珠(beckmancoultergenomics)，通过两轮大小选择纯化最终的扩增子。使用带有引物对5’‑aatgatacggcgaccaccga-3’和5’‑caagcagaagacggcatacga-3’的kapasybrfastqpcrmastermix(kapabiosystems)通过实时pcr测量样品的数量和质量，并使用agilent2100生物分析仪上的高灵敏度dna芯片(agilent)进行分析。[0184]条形码测序数据分析[0185]从测序数据中处理条形码读取，并归一化为每百万读取计数，以便在样品之间进行比较。将细胞池中每个grna组合的归一化条形码计数与每个样品中的虚拟对照grna组合的条形码计数进行比较，以生成log2转换的倍数变化。为了提高数据可靠性，排除了卵巢癌研究早期时间点样品中原始条形码读数《100的组合(图4c和13c)。在帕金森病研究的未处理样品中，原始条形码读数《20的组合被过滤掉，因为总读取较少(图15d)。此外，仅含有靶向不同基因的grna且变异系数(cv)《1的组合包括在分析中(图4e和13e)。总体而言，卵巢癌研究分别包括97.3％(23,556个组合中的22,921个)和79.1％(26,782个组合中的21,172个)的成对和三元组合。96.7％(7,108个组合中的6,878个)的成对组合包括在帕金森病研究中。在卵巢癌研究中，log2倍数变化《-1的grna组合列于表s6和s7。在帕金森病研究中，表s8中列出了log2倍数变化》0.378(增加约30％)和p《0.05的grna组合。为了鉴定协同的三元组合，将靶向三个非冗余基因且变异系数《1的grna组合分为总共455个独特的三基因靶向组合。rpachagedesctools用于进行dunnett检验，其中三元组合作为对照，并与双基因和单基因靶向组合进行比较(总共6次比较)。为了测量遗传相互作用，应用了类似于先前描述的评分系统(wong等人,2015)。通过减去三基因敲除的预期倍数变化来计算遗传相互作用(gi)评分，该变化是通过单独双基因和单基因敲除的倍数变化的总和、通过观察到的三基因敲除的倍数变化估计的，其中负gi评分表示本研究中的遗传协同作用。对于给定的三元组合计算的gi评分代表第三个基因与其余两个基因组合之间的相互作用。基于三个gi评分的几何平均值计算三元组合的gi3评分。通过在dunnett检验的所有6次比较中调整p值阈值《0.05、平均log2倍数变化＜-1和gi3评分＜-0.2(对于相同的三元组合在所有3种可能的排列(“a,b”+“c”、“a，c”+“b”、“b，c”+“a”)中gi评分也＜-0.14)选择潜在的协同基因组合。[0186]表s6[0187]在卵巢癌研究中鉴定的具有平均log2比率＜-1和p＜0.05的三元grna组合列表[0188][0189][0190][0191][0192][0193][0194][0195][0196][0197][0198][0199][0200][0201][0202][0203][0204][0205][0206]表s7[0207]在卵巢癌研究中鉴定的具有平均log2比率＜-1的成对靶向基因的grna组合列表[0208][0209][0210]细胞存活率测定和药物相互作用分析[0211]在药物处理前一天，将1,500个ovcar8-adr细胞接种到96孔板的一个孔中。将4,800个sk-n-mc细胞接种到96孔板的一个孔中，并用药物预处理72小时，然后加入鱼藤酮(abcam，ab143145)或mpp+(abcam，ab144783)以诱发毒性。以指定剂量施用药物。阿扎胞苷(a-5959)、奥拉帕尼(o-9201)、西罗莫司(r-5000)、塞利西利(r-1234)、拉帕替尼(l-4899)、厄洛替尼(e4007)和伏立诺他(v-8477)购自lc实验室。氟达拉滨(#14128)购自caymanchemicalcompany。17-dmag(a2213)购自apexbio。如前所述(wong等人,2015)，进行3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(mtt)测定，以评估不同时间点的细胞生长。简而言之，将细胞生长孔中的培养基替换为100μl在不含酚红的rpmi1640中的1xmtt溶液，并在37℃和5％co2下孵育3小时。然后将100μl增溶缓冲液(异丙醇中的10％tritonx-100，0.1nhcl)加入到每个孔中以溶解蓝色甲瓒晶体。通过varioskanflash酶标仪(thermoscientific)在570nm和650nm处测量吸光度。采用bliss独立模型(bliss,1939)和hsa模型(borisy等人,2003)评估药物对之间的相互作用，并使用diamond模型(cokol等人,2017；cokol-cakmak等人,2018)测量三元药物相互作用。超过bliss独立模型的过量计算为g12-(g1+g2-g1xg2/100)，其中g表示生长抑制百分比，数字表示药物组分；超过hsa模型的过量通过从组合中减去单一药剂的最高生长抑制作用来计算；diamond模型用于计算等于(o1+o2+o3)/((e1+e2+e3)/3)的分数抑制浓度(fic3)，其中o表示观察到的组合中每个组分的浓度，e表示由药物反应曲线确定的单个药物在一定抑制水平下的预期浓度。为了生成药物反应曲线，将三种药物以各自ic50的1:1:1的固定比例组合并按比例缩放。如果fic3《1，则相互作用是协同的；如果fic3＝1，则相互作用是相加的；如果fic3》1，则相互作用是拮抗的。[0212]集落形成测定[0213]在药物处理前一天，将1,000个ovcar8-adr细胞以指定剂量接种到6孔板的一个孔中。集落用冰冷的甲醇在-20℃下固定30分钟，用结晶紫染色。通过imagej软件测定集落数量和面积。[0214]假眼测定[0215]使用携带gmr-gal4和uas-α-syn的野生型和转基因果蝇品种(auluck等人，2002)。gmr-gal4雌性果蝇与w1118(对照)或uas-α-syn雄性果蝇杂交，并在21.5℃下在添加有药物或载体对照的玉米粉培养基上培养。通过将伏立诺他(lclaboratories,v-8477)和/或17-dmag(invivogen,ant-dgl-25)分别以0.5μm和96μg/ml的终浓度添加到2ml培养基中进行药物处理。羽化后，将后代转移到新的小瓶中，其中培养基中添加了新鲜药物，并在测定前每3-4天更换一次药物。如前所述(wong等人,2008)，在光学显微镜(olympuscx31)下使用60x油物镜检查7至11日龄果蝇的眼睛。检查了来自5-10只果蝇的至少100个小眼并记录了感杆的数量。[0216]rna-seq[0217]通过minibest通用rna提取试剂盒(takara)从药物处理的ovcar8-adr细胞中分离总rna。分别使用qubit测定法和在agilent2100生物分析仪上的高灵敏度dna芯片(agilent)对rna样品进行量化和分析。rna-seq实验在基因组科学中心(香港大学lks医学院)进行。配对末端原始序列读数的illumina适配器由trimmomatic0.39调整。staraligner2.7版用于将序列读数与人基因组对齐，其中基因组索引使用gencode30版发布的人基因组的初级组装构建。使用rpackagersubread提取原始计数读数。rpackagesedger、limma和htsfilter用于差异表达分析，比较每个成对和三元药物组合与未处理的样品。fdr《0.05过滤器适用于三元组合与未处理样品相比，而fdr《1过滤器适用于每种二元组合与未处理样品相比。组合和基因通过完全连锁聚类进行聚类，其中距离定义为1-pearson相关性。与未处理的对照相比，用三药方案处理的细胞中至少上调或下调20％的基因被输入到david网络工具中进行通路分析，并使用reactome通路数据库。通路映射使用p＝0.05阈值。[0218]量化和统计分析[0219]使用graphpadprism7软件(graphpadsoftware)进行数据分析。表示的数据是平均值±标准差，在图例中为每个实验指定了生物学重复。两组之间的统计比较通过学生t检验进行，而单因素方差分析后跟tukey或dunnett事后检验用于两个以上组的比较。[0220]数据和代码可用性[0221]本研究中产生或分析的所有测序数据均是可获得的。[0222]关键资源表[0223]sequence-specificcontrolofgeneexpression.cell152,1173-1183.[0255]reinhold,w.c.,sunshine,m.,liu,h.,varma,s.,kohn,k.w.,morris,j.,doroshow,j.,andpommier,y.(2012).cellminer:aweb-basedsuiteofgenomicandpharmacologictoolstoexploretranscriptanddrugpatternsinthenci-60celllineset.cancerres72,3499-3511.[0256]reis,a.c.,halper,s.m.,vezeau,g.e.,cetnar,d.p.,hossain,a.,clauer,p.r.,andsalis,h.m.(2019).simultaneousrepressionofmultiplebacterialgenesusingnonrepetitiveextra-longsgrnaarrays.natbiotechnol.[0257]shalem,o.,sanjana,n.e.,hartenian,e.,shi,x.,scott,d.a.,mikkelsen,t.s.,heckl,d.,ebert,b.l.,root,d.e.,doench,j.g.,etal.(2014).genome-scalecrispr-cas9knockoutscreeninginhumancells.science343,84-87.[0258]shen,j.p.,zhao,d.,sasik,r.,luebeck,j.,birmingham,a.,bojorquez-gomez,a.,licon,k.,klepper,k.,pekin,d.,beckett,a.n.,etal.(2017).combinatorialcrispr-cas9screensfordenovomappingofgeneticinteractions.natmethods14,573-576.[0259]shen,m.w.,arbab,m.,hsu,j.y.,worstell,d.,culbertson,s.j.,krabbe,o.,cassa,c.a.,liu,d.r.,gifford,d.k.,andsherwood,r.i.(2018).predictableandprecisetemplate-freecrispreditingofpathogenicvariants.nature563,646-651.[0260]vidigal,j.a.,andventura,a.(2015).rapidandefficientone-stepgenerationofpairedgrnacrispr-cas9libraries.natcommun6,8083.[0261]wong,a.s.,choi,g.c.,cheng,a.a.,purcell,o.,andlu,t.k.(2015).massivelyparallelhigh-ordercombinatorialgeneticsinhumancells.natbiotechnol33,952-961.[0262]wong,a.s.,choi,g.c.,cui,c.h.,pregernig,g.,milani,p.,adam,m.,perli,s.d.,kazer,s.w.,gaillard,a.,hermann,m.,etal.(2016a).multiplexedbarcodedcrispr-cas9screeningenabledbycombigem.procnatlacadsciusa113,2544-2549.[0263]wong,a.s.,choi,g.c.,andlu,t.k.(2016b).decipheringcombinatorialgenetics.ann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