可用于治疗CDKL5缺乏症（CDD）的组合物

可用于治疗cdkl5缺乏症(cdd)的组合物


背景技术：

1.cdkl5缺乏症(cdd)是一种影响幼儿的严重神经发育病症。根本原因是由于x连锁细胞周期蛋白依赖性激酶样5基因cdkl5(人类孟德尔遗传(mendelian inheritance in man)，mim:300203；先前称为stk9)中的突变导致缺乏cdkl5蛋白质表达，从而引起一系列表型，包含eiee2(mim:300672)，一种早期婴儿癫痫性脑病的形式[bahi-buisson,n.等人鉴别患有cdkl5突变的女孩的关键临床特征(key clinical features to identify girls with cdkl5 mutations).《脑(brain)》131,2647-2661,doi:10.1093/brain/awn197(2008)]和婴儿痉挛症[fehr,s.等人《欧洲人类遗传学杂志(eur j hum genet)》21,266-273,doi:10.1038/ejhg.2012.156(2013)；kalscheuer,v.m.等人,《美国人类遗传学杂志(american journal of human genetics)》,72,1401-1411,doi:10.1086/375538(2003)；tao,j.等人《美国人类遗传学杂志》75,1149-1154,doi:10.1086/426460(2004).weaving,l.s.等人《美国人类遗传学杂志》75,1079-1093,doi:10.1086/426462(2004)]。除特征性早发性癫痫发作外，所述表型还可能包含多个其它特征，如刻板手部运动、严重精神运动性迟缓和全身肌张力低下。出生后早期症状的发作表明cdkl5在大脑发育中起着至关重要的作用。cdkl5还会在成熟的成人神经系统内表达。cdkl5在整个细胞中表达，包含胞体和树突的细胞核和细胞质。
[0002]
cdkl5基因突变是大多数cdd(一种进行性神经发育病症)病例的原因并且是女性认知障碍的最常见原因之一。具有引起cdd的基因突变的男性会受到毁灭性的影响。他们中的大多数在出生前或婴儿早期死亡。参见例如ninds.nih.gov/disorders/patient-caregiver-education/fact-sheets/rett-syndrome-fact-sheet和omim.org/entry/312750。
[0003]
目前，无法治愈cdd，并且治疗的重点是减轻疾病症状。在许多情况下，癫痫发作难以控制，因此医疗上迫切需要寻找新的治疗方法。


技术实现要素：

[0004]
本文提供了一种重组腺相关病毒(raav),其可用于治疗有需要的受试者的cdkl5缺乏症(cdd)。所述raav携带载体基因组，所述载体基因组包括反向末端重复序列(itr)和新型核酸序列，所述新型核酸序列在指导人cdkl5在靶细胞中表达的调控序列的控制下编码功能性hcdkl5蛋白。
[0005]
在某些实施例中，提供了可用于治疗cdd的重组腺相关病毒(raav)。所述raav包括：(a)aav衣壳；以及(b)载体基因组，所述载体基因组包装在(a)的所述aav衣壳中，其中所述载体基因组包括反向末端重复序列(itr)和编码功能性人cdkl5(hcdklk5)的核酸序列，所述核酸序列处于指导hcdkl5在中枢神经系统细胞中表达的调控序列的控制下，并且其中所述hcdkl5编码序列是seq id no:3的nt 699至3581(或seq id no:22)或与seq id no:3的nt 699至3581(或seq id no:22)至少约95％相同的序列。在某些实施例中，功能性hcdkl5具有seq id no:2的氨基酸序列。在某些实施例中，所述调控序列包括泛素c(ubc)启
动子。在一些实施例中，所述调控序列包括wpre元件。
[0006]
在某些实施例中，提供了可用于治疗cdd的重组腺相关病毒(raav)，其中所述功能性人cdkl5(hcdklk5)是hcdkl5同种型2。在某些实施例中，提供了可用于治疗cdd的重组腺相关病毒(raav)，其中所述功能性人cdkl5(hcdklk5)是hcdkl5同种型3。在某些实施例中，提供了可用于治疗cdd的重组腺相关病毒(raav)，其中所述功能性人cdkl5(hcdklk5)是hcdkl5同种型4。
[0007]
在某些实施例中，可用于治疗cdd的所述raav包括aav9衣壳。在一些实施例中，可用于治疗cdd的所述raav包括aavhu68衣壳。在其它实施例中，可用于治疗cdd的所述raav包括aavrh91衣壳。
[0008]
在某些实施例中，所述cdkl5-2gs编码序列是seq id no:24或与其至少95％相同的编码seq id no:6的序列。在某些实施例中，所述cdkl5-3gs编码序列是seq id no:25或与其至少95％相同的编码seq id no:8的序列。在某些实施例中，所述cdkl5-4gs编码序列是seq id no:26或与其至少95％相同的编码seq id no:10的序列。
[0009]
在某些实施例中，所述载体基因组包括hcdkl5的3'非翻译区中的背根神经节(drg)特异性mirna靶序列的至少两个串联重复序列，其中所述至少两个串联重复序列包括可以相同或不同的至少一个第一mirna靶序列和至少一个第二mirna靶序列，并且靶向mir183或mir182。
[0010]
在某些实施例中，除raav之外的载体用于递送如本文所描述的表达盒。所述载体可以是重组细小病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺病毒；或是选自裸dna、裸rna、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体或基于壳聚糖的调配物的非病毒载体。
[0011]
在某些实施例中，提供了一种包括如本文所描述的raav或其它病毒载体的原液以及水性悬浮介质的组合物。
[0012]
在某些实施例中，提供了一种治疗cdd的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所描述的raav或其它载体。
[0013]
在某些实施例中，提供了一种可用于产生如本文所描述的载体的raav产生系统。
[0014]
在某些实施例中，提供了一种载体，其包括表达盒，其中所述表达盒包括编码功能性人cdkl5-co1(hcdkl5)的核酸序列，所述核酸序列处于指导hcdkl5表达的调控序列的控制下，并且其中所述hcdkl5编码序列是seq id no:22或与seq id no:22至少约95％相同的序列。在某些实施例中，提供了一种载体，其包括表达盒，其中所述表达盒包括编码功能性人cdkl5-2gs(hcdkl5-2gs)的核酸序列，所述核酸序列处于指导hcdkl5-2gs表达的调控序列的控制下，并且其中所述hcdkl5-2gs编码序列是seq id no:24或与seq id no:24至少约95％相同的序列。在某些实施例中，提供了一种载体，其包括表达盒，其中所述表达盒包括编码功能性人cdkl5-3gs(hcdkl5-3gs)的核酸序列，所述核酸序列处于指导hcdkl5-3gs表达的调控序列的控制下，并且其中所述hcdkl5-3gs编码序列是seq id no:25或与seq id no:25至少约95％相同的序列。在某些实施例中，一种载体，其包括表达盒，其中所述表达盒包括编码功能性人cdkl5-4gs(hcdkl5-4gs)的核酸序列，所述核酸序列处于指导hcdkl5-4gs表达的调控序列的控制下，并且其中所述hcdkl5-4gs编码序列是seq id no:26或与seq id no:26至少约95％相同的序列。
[0015]
在某些实施例中，所述载体基因组进一步包括背根神经节(drg)特异性mirna靶序
列的至少两个串联重复序列。在某些实施例中，所述raav或包括所述raav的组合物可施用于有需要的受试者以改善cdd的症状和/或延迟cdd的进展。
[0016]
在另外的方面，本文提供了一种包括如本文所描述的raav或载体和水性悬浮介质的组合物。
[0017]
在另一方面，提供了一种治疗患有cdd的受试者或改善cdd的症状或延迟cdd的进展的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所描述的raav或载体。在某些实施例中，所述载体或raav可通过小脑延髓池内注射(icm)施用于患者。
[0018]
通过以下对本发明的详细描述，本发明的这些和其它方面变得显而易见。
附图说明
[0019]
图1a示出了用于aav cdkl5载体基因组和表达盒的aav载体设计，所述aav cdkl5载体基因组包括5'aav反向末端重复序列(itr)，所述表达盒包括：神经元启动子、工程化的人cdkl5 dna编码序列、增强子和polya，以及aav 3'itr。图1b示出了用于aav cdkl5载体基因组和表达盒的aav载体设计，所述aav cdkl5载体基因组包括5'aav itr，所述表达盒包括泛素c(ubc)启动子、工程化的人cdkl5dna编码序列、drg-脱靶mirna、polya和aav 3'itr。图1c示出了用于aav cdkl5载体基因组和表达盒的aav载体设计，所述aav cdkl5载体基因组包括5'aav itr，所述表达盒包括：鸡β-肌动蛋白杂合启动子(cbh)、工程化的人cdkl5 dna编码序列、drg-脱靶mirna、polya和aav 3'itr。
[0020]
图2a和2b示出了如用抗cdkl5抗体(s957d，英国邓迪大学(university of dundee,uk))评估的小鼠海马体的分析。通过新生侧脑室注射用5
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gc aav-hsyn-cdkl5-1co.wpre对小鼠进行处理。图2a示出了通过蛋白质印迹的cdkl5表达，绘制了注射pbs的野生型小鼠、注射pbs的ko小鼠和经处理的ko小鼠中的cdkl5/微管蛋白水平。图2b示出了如使用注射pbs的野生型小鼠、注射pbs的ko小鼠和经处理的ko小鼠中的ps222eb2(baltussen等人,2018)水平确定的cdkl5活性。
[0021]
图3提供了在cdd小鼠模型中注射aav-hsyn-hcdkl5-1co.wpre后小鼠成熟和存活的图。所有注射的小鼠都在治疗后存活，体重增加。这些小鼠未表现出任何不良后果的明显体征。
[0022]
图4提供了接受aav-hsyn-cdkl5-1co.wpre的cdd小鼠的行为评估结果。此图表来自高架零迷宫(elevated zero maze)，其评估了冒险、好奇心与焦虑之间的平衡。第一个条形表示接受pbs的wt小鼠。wt小鼠好奇但谨慎，并且在户外度过的时间有限。中间的条形示出了只接受pbs的cdkl5-ko小鼠，所述小鼠示出了焦虑减少并且在户外度过更多时间，所述小鼠更频繁地进入开放区域。在aav-cdkl5处理后，cdkl5-ko小鼠的行为恢复到wt行为(就位于开放区域中的时间和从封闭区域进入开放区域的次数而言)。
[0023]
图5a和5b提供了接受aav-hsyn-cdkl5-1co.wpre的cdd小鼠的行为评估结果。图5a示出了小鼠在旷场竞技场地中的探索活动，其被绘制为光束阻断次数/箱对时间(分钟)。虚线表示wt小鼠，所述小鼠很好奇，但在10分钟内探索了竞技场并平静下来。具有长横杠的线表示cdkl5-ko花了更长时间探索，但最终平静下来。具有横杠和圆点的线表示在aav-cdkl5处理后，cdkl5-ko小鼠的活动减少，并且所述小鼠的总体活动水平类似于wt小鼠的活动水平。图5b示出了小鼠获得的总光束阻断次数的累积活动数据，这证实了图5a中的结果。
[0024]
图6示出了连续三天在小鼠的运动活动和敏捷性评估(转棒仪)中测量的跌落延迟时间(秒)的图。随着时间的推移，观察到野生型小鼠在学习的同时表现增加。与wt小鼠相比，cdkl5-ko小鼠表现出改善的表现，这可能是由于先前观察到的初始过度活动导致。经aav-hsyn-cdkl5-1co.wpre处理之后，cdkl5-ko小鼠的行为不会恢复到wt行为。
[0025]
图7a和7b示出了海马学习和记忆(y迷宫)的结果。图7a示出了测试组和两个对照组的自发改变的百分比。图7b示出了测试组和两个对照组移动的距离(m)。wt小鼠表现出探索所述小鼠最近没有去过的迷宫臂的强烈倾向(自发改变行为)。
[0026]
图8a至8d展示了针对表达同种型1、同种型2、同种型3或同种型4的aav.cdlk5载体构建体的cdkl5表达水平或活动水平。图8a示出了与注射了媒剂的野生型小鼠和注射了媒剂的敲除小鼠相比，注射了aav载体(5
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gc，新生icv)的敲除小鼠中cdkl5同种型1、2、3和4的定量表达水平。图8b示出了通过对经处理的野生型小鼠(注射有媒剂(pbs))、敲除小鼠(注射有媒剂或aav.cdkl5-1co)的组织的蛋白质印迹分析如由ps222eb2的定量信号确定的cdkl5活性。图8c示出了通过对经处理的野生型小鼠(注射有媒剂(pbs))、敲除小鼠(注射有媒剂或aav.cdkl5-同种型1、2、3或4(来自图8a))的组织的蛋白质印迹分析如由ps222eb2的定量信号确定的cdkl5活性。图8d示出了ko小鼠中同种型1的定量cdkl5表达水平(来自图8b)。
[0027]
图9a至9f示出了aav.cdkl5基因疗法在对不同载体剂量(5
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gc、2.5
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gc、1
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gc和6
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109gc)进行比较的小鼠研究中在敲除小鼠和野生型小鼠中的治疗功效。图9a示出了用剂量为5
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gc的aav.cdkl5或pbs的处理的小鼠在10周的时间段内的体重增加(g)。图9b示出了用剂量为2.5
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gc的aav.cdkl5或pbs处理的小鼠在10周的时间段内的体重增加(g)。图9c示出了与未处理的cdkl5-ko小鼠相比aav.cdkl5处理组在5
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gc的剂量下的后肢扣紧测试的剂量依赖性结果。图9d示出了与未处理的cdkl5-ko小鼠相比aav.cdkl5处理组在2.5
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gc的剂量下的后肢扣紧测试的剂量依赖性结果。图9e示出了与未处理的cdkl5-ko小鼠相比aav.cdkl5处理组在1
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gc的剂量下的后肢扣紧测试的剂量依赖性结果。图9f示出了与未处理的cdkl5-ko小鼠相比aav.cdkl5处理组在6
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109gc的剂量下的后肢扣紧测试的剂量依赖性结果。wt小鼠没有表现出扣紧，而ko小鼠表现出明显的扣紧。经处理后，ko小鼠的扣紧次数明显减少。注射wt小鼠不受影响。
[0028]
图10a至10e示出了cdd ko小鼠研究中aav.cdl5基因疗法的治疗功效。图10a示出了与未处理的cdkl5-ko小鼠相比aav.cdkl5处理组在5
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gc的剂量下的筑巢结果(巢质量/评分)。图10b示出了与wt小鼠和cdkl5-ko小鼠相比在5
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gc的剂量下在aav.cdlk5处理组中具有归一化趋向的埋珠任务的结果。图10c示出了与未处理的cdkl5-ko小鼠相比aav.cdkl5处理组在2.5
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gc的剂量下的筑巢结果(巢质量/评分)。图10d示出了与wt小鼠和cdkl5-ko小鼠相比在2.5
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gc的剂量下在aav.cdlk5处理组中具有归一化趋向的埋珠任务的结果。图10e示出了与未处理的cdkl5-ko小鼠相比aav.cdkl5处理组在1
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gc的剂量下的筑巢结果(巢质量/评分)。
[0029]
图11a至11f示出了如在旷场活动测试中所评估的对接受aav.cdkl5处理的ko小鼠活动过度的纠正。图11a示出了aav.cdkl5处理的ko小鼠在5
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gc的剂量下的步行活动/箱对时间(5分钟间隔至30分钟间隔)。图11b示出了aav.cdkl5处理的ko小鼠在5
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gc的剂量下进行的全部活动。图11c示出了aav.cdkl5处理的ko小鼠在2.5
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gc的剂量下的步
行活动/箱对时间(5分钟间隔至30分钟间隔)。图11d示出了aav.cdkl5处理的ko小鼠在2.5
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gc的剂量下的全部活动。图11e示出了aav.cdkl5处理的ko小鼠在6
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109gc的剂量下的步行活动/箱对时间(5分钟间隔至30分钟间隔)。图11f示出了aav.cdkl5处理的ko小鼠在6
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109gc的剂量下的全部活动。在高架零迷宫中观察到风险增加的归一化，并且在aav.cdkl5处理的ko小鼠的y迷宫中可见海马学习缺陷的归一化。
[0030]
图12展示了当在ko小鼠中在5x 10
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gc的剂量下进行评估时，cdkl5同种型2-4的表达对后肢扣紧表型提供显著校正。
[0031]
图13a至13d展示了用aav.cdkl5-同种型1处理的ko小鼠中的强校正趋势。图13a示出了在5
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gc的剂量下用aav.cdkl5-同种型1处理的ko小鼠活动增加。图13b示出了在2.5
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gc的剂量下用aav.cdkl5-同种型1处理的ko小鼠活动增加。图13c示出了在5
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gc的剂量下用aav.cdkl5-同种型1处理的ko小鼠中y迷宫中的活动。图13d示出了在2.5
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gc的剂量下用aav.cdkl5-同种型1处理的ko小鼠中y迷宫中的活动。
[0032]
图14a至14c示出了用aav.cdkl5-同种型1处理敲除小鼠后后肢扣紧的性别特异性结果。图14a示出了用aav.cdkl5-同种型1处理雄性敲除小鼠后的后肢扣紧。图14b示出了用aav.cdkl5-同种型1治疗雌性敲除小鼠后的后肢扣紧。在cdkl5-ko小鼠中，半合子雄性和杂合子雌性两者都表现出后肢扣紧，这在治疗后显著减少。wt组无一表现出扣紧。图14c示出了在高剂量(5
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gc，新生icv)下雌性杂合子小鼠的步行活动显著改善。
[0033]
图15a和15b示出了旷场评估中旷场-步行活动的性别特异结果。图15a示出了用aav.cdkl5-同种型1处理的雄性(ko)小鼠在旷场评估中的步行活动的结果，其被绘制为随时间推移的x轴、y轴光束阻断次数。图15b示出了用aav.cdkl5-同种型1处理的雌性(ht)小鼠在旷场评估中的步行活动的结果，其被绘制为随时间推移的x轴、y轴光束阻断次数。在用aav.cdkl5-同种型1处理的雄性(ko)和雌性(ht)两种小鼠中，在多个时间点观察到对野生型的完全校正。
[0034]
图16a和16b示出了用aav.cdkl5-同种型1载体处理的ko小鼠的性别差异。图16a示出了用aav.cdkl5-同种型1处理的雄性(ko)小鼠在高架零迷宫评估中的旷场-步行活动的结果，其被绘制为在开放区域中度过的时间(秒)。图16b示出了用aav.cdkl5-同种型1处理的雌性(ht)小鼠在高架零迷宫评估中的旷场-步行活动的结果，其被绘制为在开放区域中度过的时间(秒)。有风险倾向的行为得到校正，其中体型效应在雄性中更为明显。
[0035]
图17提供了来自nhp研究的各种组织样品中的载体分布(表示1
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gc剂量)。所述图提供了各种非神经元组织、脊髓束和脑组织的gc/二倍体基因组中的raav.cdkl5。观察到背根神经节(drg)的强转导。观察到中度到低度的脑组织转导，有一些泄露到非神经元组织中。
[0036]
图18提供了在小脑、额叶皮层、枕叶皮层、顶叶皮层和颞叶皮层中示出的nhp研究中定量的hcdkl5表达(通过rt-qpcr测量)的结果。
[0037]
图19a和19b示出了剂量递增研究的结果，所述研究测量了向wt小鼠施用cdkl5基因疗法后的行为变化。图19a示出了与用pbs处理的对照小鼠相比，在注射了7.5
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gc和1
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gc aav的wt小鼠中，后肢扣紧严重程度评分没有显著变化。图19b示出了与用pbs处理的对照小鼠相比，在注射了7.5
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gc和1
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gc aav的wt小鼠中，没有显著的步行活动变化。
具体实施方式
[0038]
本文提供了用于治疗cdd的组合物和方法。将有效量的具有aav衣壳(例如，aavhu68或aav-php.b)并在所述aav衣壳中包装有载体基因组的重组腺相关病毒(raav)递送到有需要的受试者，所述载体基因组编码功能性人细胞周期蛋白依赖性激酶样5(hcdkl5)。
[0039]
i.人cdkl5
[0040]
细胞周期蛋白依赖性激酶样5(cdkl5，也称为cfap247、丝氨酸/苏氨酸激酶9、stk9；uniprot#076039)基因天然位于位置22.13处x染色体的短(p)臂上。cdlk5蛋白的n末端充当激酶，这是一种改变其它蛋白质活性的酶。已经鉴定了cdkl5的几种直接底物(baltussen等人,2018；munoz斯等人,2018)。cdkl5 c末端的功能未知。
[0041]
如本文所使用的，功能性hcdkl5蛋白是指ckdl5蛋白的同种型、天然变体、变体、多形体或截短体，其与cdd无关和/或其递送或表达可以在动物模型或患者中改善cdd的症状或延迟cdd的进展。参见omim#300203，所述网页中的每个网页通过引用整体并入本文。在某些实施例中，功能性hcdkl5具有seq id no:2(同种型1)的氨基酸序列或与其至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hcdkl5蛋白具有seq id no:19(同种型2)的氨基酸序列或与其至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hcdkl5蛋白具有seq id no:20(同种型3)的氨基酸序列或与其至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hcdkl5蛋白具有seq id no:21(同种型4)的氨基酸序列或与其至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hcdkl5是截短的hcdkl5，其包括具有所述序列的甲基-cpg结合结构域(mbd)和ncor/smrt相互作用结构域(nid)。参见wo2018172795a1，其通过引用整体并入本文。
[0042]
在某些实施例中，功能性hcdkl5蛋白在动物模型中改善cdd的症状或延迟cdd的进展。一个例示的动物模型是cdkl5-ko小鼠。本文描述了其它合适的模型。
[0043]
可以使用各种测定/方法来评估cdd症状或进展，包含但不限于存活率曲线(例如，卡普兰-迈耶存活率曲线(kaplan-meier survival plot))、监测体重和观察行为变化(例如，通过后肢扣紧、旷场测定(运动功能)、高架区迷宫(焦虑/风险对探索)、y迷宫(学习和记忆/海马)、埋珠测定(先天行为和运动)、筑巢(先天社会行为)和转棒仪测定(运动功能、协调))。在某些实施例中，功能性hcdkl5蛋白在动物模型中的施用或表达引起cdd症状的改善或cdd进展的延迟，所述改善或所述延迟通过测定结果为在对应的野生型动物中获得的测定结果的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或超过100％得到证明。在某些实施例中，功能性hcdkl5蛋白在cdd动物模型中的施用或表达引起cdd症状的改善或cdd进展的延迟，所述改善或所述延迟通过改善的测定结果得到证明，所述测定结果为从对应的未经处理的cdd动物获得的测定结果的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或超过100％。
[0044]
本文提供了编码功能性hcdkl5蛋白的核酸序列，称为hcdkl5编码序列或cdkl5编
码序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是seq id no:3或与seq id no:3至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列选自seq id no:2(称为cdkl5或cdkl5co或cdkl5-1或cdkl5-1co)或编码氨基酸序列np_001032420.1(seq id no:19)的ncbi参考序列nm_001037343.1(称为cdkl5或cdkl5e1；seq id no:16)；编码氨基酸序列np_001310218.1(seq id no:20)的nm_001323289.2(seq id no:17)；以及编码氨基酸序列np_003150.1(seq id no:21)的nm_003159.2(seq id no:18)；或与其至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的核酸序列。ncbi参考序列中的每个ncbi参考序列通过引用整体并入本文。在某些实施例中，hcdkl5编码序列是经修饰或工程化的(hcdkl5或hcdkl5co或cdkl5-1或cdkl5-1co)。经修饰或工程化的编码序列与ncbi参考序列具有小于约70％(例如，约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)的同一性。
[0045]
在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是seq id no:22或与其至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)相同的核酸序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是seq id no:24或与其至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)相同的核酸序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是seq id no:25或与其至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)相同的核酸序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是seq id no:26或与其至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)相同的核酸序列。
[0046]
在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:37的序列或与seq id no:37至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:38的序列或与seq id no:38至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:39的序列或与seq id no:39至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:40的序列或与seq id no:40至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:41的序列或与seq id no:41至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:42的序列或与seq id no:42至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:43的序列或与seq id no:43至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:44的序列或与seq id no:44至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:45的序列或与seq id no:45至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:46的序列或与seq id no:46至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:47的序列或与seq id no:47至少约95％相同的序列。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是工程化的seq id no:48的序
列或与seq id no:48至少约95％相同的序列。
[0047]
如本文所描述的，“核酸”可以是rna、dna或其修饰，并且可以是单链或双链的，并且可以选自例如包含以下的组：编码所关注蛋白质的核酸、寡核苷酸、核酸类似物，例如肽-核酸(pna)、假互补pna(pc-pna)、锁核酸(lna)等。此类核酸序列包含例如但不限于编码例如充当转录阻遏物的蛋白质的核酸序列、反义分子、核酶、小的抑制性核酸序列，例如但不限于rnai、shrnai、sirna、微rnai(mrnai)、反义寡核苷酸等。
[0048]
在核酸序列的上下文中，术语“百分比(％)同一性”、“序列同一性”、“百分比序列同一性”或“百分比相同的”是指两个序列中的残基在比对以获得对应性时是相同的。期望序列同一性比较的长度可以超过基因组的全长、基因编码序列的全长或至少约500至5000个核苷酸的片段。然而，也可能期望较小片段之间的同一性，例如，至少约九个核苷酸，通常至少约20至24个核苷酸、至少约28至32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸。
[0049]
可以容易地确定蛋白质全长、多肽、约32个氨基酸、约330个氨基酸或其肽片段或对应核酸序列编码序列上的氨基酸序列的百分比同一性。合适的氨基酸片段可以是至少约8个氨基酸长度，并且可以是至多约700个氨基酸。通常，当提及两个不同序列之间的“一致性”、“同源性”或“类似性”时，参考“比对”序列来确定“一致性”、“同源性”或“类似性”。“比对”序列或“比对”是指与参考序列相比，通常含有对丢失的或另外的碱基或氨基酸的校正的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列。
[0050]
使用多种公开或可商购获得的多序列比对程序中的任一种进行比对。序列比对程序可供用于氨基酸序列，所述程序例如“clustal x”、“clustal omega”、“map”、“pima”、“msa”、“blockmaker”、“meme”以及“match-box”程序。通常，以默认设置使用这些程序中的任何程序，尽管本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。可替代地，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，所述算法或程序提供至少与通过参考算法和程序所提供的一样水平的同一性或比对。参见例如j.d.thomson等人,《核酸研究(nucl.acids.res.)》,“多个序列比对的全面比较(a comprehensive comparison of multiple sequence alignments)”,27(13):2682-2690(1999)。
[0051]
多个序列比对程序也可用于核酸序列。此类程序的实例包含“clustal w”、“clustal omega”、“cap序列组装”、“blast”、“map”和“meme”，所述程序可通过因特网上的web服务器进行访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。可替代地，也使用了载体nti实用程序。本领域已知的许多算法可以用于测量核苷酸序列同一性，包含上述程序中包含的那些。作为另一个实例，可以使用gcg 6.1版本的程序fasta
tm
比较多核苷酸序列。fasta
tm
提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可以是使用如gcg 6.1版本中所提供的采用其默认参数(字号6和评分矩阵的nopam系数)的fasta
tm
所确定的，所述程序通过引用并入本文中。
[0052]
ii.表达盒
[0053]
本文提供了也称为表达盒的核酸序列，所述核酸序列包括在调控序列的控制下的hcdkl5编码序列，所述调控序列指导hcdkl5在靶细胞中表达。如本文所使用的，“表达盒”是指包括编码序列(例如，cdkl5编码序列)和与其可操作地连接的调控序列的核酸分子。在某些实施例中，载体基因组含有两个或更多个表达盒。术语“转基因”指插入靶细胞的外源dna序列；通常，转基因编码一种产物(例如，cdkl5)。通常，被装入病毒载体的此类表达盒含有
本文所描述的基因产物的编码序列，所述编码序列侧接病毒基因组的包装信号和其它表达控制序列，如本文描述的序列。所需的调控序列以允许hcdkl5编码序列在靶细胞中转录、翻译和/或表达的方式与所述编码序列可操作地连接。如本文所使用的，“可操作地连接的”序列包含与hcdkl5编码序列邻接的调节转录、翻译和/或表达的序列和以反式或在远处起作用以控制hcdkl5编码序列的调控序列。表达盒可以含有基因序列上游(5'处)的调控序列，例如启动子、增强子、内含子等中的一者或多者以及增强子中的一个或多个，或基因序列下游(3'处)的调控序列，例如包括多腺苷酸化位点的3'非翻译区(3'utr)，以及其它元件。此类调控序列通常包含例如启动子、增强子、内含子、kozak序列、聚腺苷酸化序列和tata信号中的一种或多种。在某些实施例中，启动子是组织特异性启动子，例如，cns特异性或神经元特异性启动子。在某些实施例中，启动子是人突触蛋白启动子(seq id no:23)。在某些实施例中，另外的或替代性的神经元特异性启动子序列可以选自神经元特异性烯醇酶(nse)启动子(andersen等人,(1993)《细胞与分子神经生物学(cell.mol.neurobiol.,13:503 15)、神经丝轻链基因启动子(piccioli et等人,(1991)《美国科学院院刊(proc.natl.sci.usa)》,88:5611 5)、神经元特异性vgf基因启动子(piccioli等人,(1995)《神经元(neuron)》,15:373-84)和/或其它。
[0054]
在某些实施例中，人突触蛋白启动子具有序列(例如seq id no:1、3、5、7、9的nt 213至nt 678或seq id no:23)，本文还称为hsyn或syn。
[0055]
在其它实施例中，启动子是组成型启动子，例如具有巨细胞病毒增强子(cb7)启动子的鸡β肌动蛋白启动子、人延伸起始因子1α启动子(ef1a)启动子、人泛素c(ubc)启动子。在某些实施例中，调控序列指导hcdkl5在中枢神经系统(cns)细胞中表达。
[0056]
在某些实施例中，靶细胞可以是中枢神经系统细胞。在某些实施例中，靶细胞是兴奋性神经元、抑制性神经元、神经胶质细胞、皮层细胞、前额皮层细胞、大脑皮层细胞、脊髓细胞中的一种或多种。在某些实施例中，靶细胞是外周神经系统(pns)细胞，例如视网膜细胞。也可以选择除来自神经系统的细胞外的其它细胞作为靶细胞，如单核细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞、nk细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、骨髓间充质细胞、干细胞、骨髓干细胞、心脏细胞、上皮细胞、食道细胞、胃细胞、胎儿切割细胞、结肠细胞、直肠细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、肺细胞、唾液腺细胞、甲状腺细胞、肾上腺细胞、乳腺细胞、胰腺细胞、胰岛细胞、胆囊细胞、前列腺细胞、膀胱细胞、皮肤细胞、子宫细胞、子宫颈细胞、睾丸细胞或未患有cdd的受试者的表达功能性cdkl5蛋白的任何其它细胞。
[0057]
在某些实施例中，另外的或替代性的启动子序列可以作为表达控制序列(调控序列)的一部分包含在内，例如定位在所选5'itr序列与编码序列之间。可以在本文所描述的载体中利用组成型启动子、可调控启动子[参见例如wo 2011/126808和wo 2013/04943]、组织特异性启动子或对生理学线索有应答的启动子。一种或多种启动子可以选自不同的来源，例如人巨细胞病毒(cmv)立即早期增强子/启动子、sv40早期增强子/启动子、jc多瘤病毒启动子、髓鞘碱性蛋白(mbp)或神经胶质原纤维酸性蛋白(gfap)启动子、单纯疱疹病毒(hsv-1)潜伏期相关启动子(lap)、劳氏肉瘤病毒(rsv)长末端重复(ltr)启动子、神经元特异性启动子(nse)、血小板源性生长因子(pdgf)启动子、hsyn、黑色素浓缩激素(mch)启动子、cba、基质金属蛋白启动子(mpp)和鸡β-肌动蛋白启动子。
[0058]
除启动子之外，载体还可以含有一个或多个其它合适的转录起始序列、转录终止
序列、增强子序列、有效的rna加工信号如剪接和聚腺苷酸化(polya)信号；稳定胞质mrna的序列，例如，wpre；增强转译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在期望时，增强经过编码的产物的分泌的序列。合适的增强子的实例是cmv增强子。其它合适的增强子包含适合于所期望的靶组织适应症的增强子。在一个实施例中，调控序列包括一种或多种表达增强子。在一个实施例中，调控序列含有两种或更多种表达增强子。这些增强子可以相同或彼此不同。例如，增强子可以包含cmv立即早期增强子。这种增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。可替代地，增强子的双拷贝可以被一个或多个序列分开。在仍另一个实施例中，表达盒进一步含有内含子，例如，鸡β-肌动蛋白内含子。在某些实施例中，内含子是嵌合内含子(ci)-由人β-珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白g(igg)剪接受体元件组成的杂交内含子。其它合适的内含子包含本领域已知的内含子，例如，如wo 2011/126808中描述的内含子。合适的polya序列的实例包含例如，兔珠蛋白polya、sv40、sv50、牛生长激素(bgh)、人生长激素和合成polya。任选地，可以选择一个或多个序列来稳定mrna。此类序列的实例是经修饰的wpre序列，其可以在polya序列的上游和编码序列的下游被工程化(参见例如ma zanta-boussif等人,《基因疗法(gene therapy)》(2009)16:605-619)。在某些实施例中，不存在wpre序列。
[0059]
在某些实施例中，表达盒是指具有编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型1；seq id no:2)的seq id no:1的nt 213-4439的序列的核酸分子。在某些实施例中，表达盒是指具有编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型2或2gs；seq id no:6)的seq id no:5的nt 213-4562的序列的核酸分子。在某些实施例中，表达盒是指具有编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型3或3gs；seq id no:8)的seq id no:7的nt 213-4388的序列的核酸分子。在某些实施例中，表达盒是指具有编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型4或4gs；seq id no:10)的seq id no:9的nt 213-4511的序列的核酸分子。在某些实施例中，表达盒包括工程化的核酸序列，所述工程化的核酸序列选自seq id no:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48并编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型1或seq id no:2)。在某些实施例中，表达盒是指具有编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型1；seq id no:4)并且包括mirna183(seq id no:11)的seq id no:3的nt 213-4555的序列的核酸分子。在某些实施例中，这些表达盒进一步包括一个、两个、三个、四个或更多个drg-脱靶序列(即mirna)。参见例如2019年12月20日提交的并且现在公布为wo 2020/132455的pct/us19/67872。
[0060]
iii.raav
[0061]
本文提供了可用于治疗cdd的重组腺相关病毒(raav)。所述raav包括：(a)aav衣壳；以及(b)包装在(a)的aav衣壳中的载体基因组。合适地，所选aav衣壳靶向待处理的细胞。在某些实施例中，衣壳来自进化枝f。然而，在某些实施例中，可以选择另一种aav衣壳源。载体基因组包括反向末端重复序列(itr)和编码功能性人细胞周期蛋白依赖性激酶样5(hcdkl5)的核酸序列，所述核酸序列处于指导hcdkl5表达的调控序列的控制下。在某些实施例中，cdkl5可以是指cdkl5或hcdkl5、cdkl5-2gs或hcdkl5-2gs、cdkl5-3gs或hcdkl5-3gs以及cdkl5-4gs或hcdkl5-4gs。在某些实施例中，hcdkl5编码序列与seq id no:22(编码cdkl5-1或hcdkl5-1的氨基酸序列；seq id no:2)至少约95％相同。在某些实施例中，hcdkl5编码序列与seq id no:24(编码cdkl5-2gs或hcdkl5-2gs；seq id no:6的氨基酸序列)至少约95％相同。在某些实施例中，hcdkl5编码序列与seq id no:25(编码cdkl5-3gs或
hcdkl5-3gs；seq id no:8的氨基酸序列)至少约95％相同。在某些实施例中，hcdkl5编码序列与seq id no:26(编码cdkl5-4gs或hcdkl5-4gs；seq id no:10的氨基酸序列)至少约95％相同。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列与hcdkl5转录变体1至3(nm_001037343.1：具有seq id no:16并且编码具有seq id no:19的氨基酸序列np_001032420.1；nm_001323289.2：具有seq id no:17并且编码具有seq id no:20的氨基酸序列np_001310218.1；nm_003159.2：具有seq id no:18并且编码具有seq id no:21的氨基酸序列np_003150.1)中的任何一个hcdkl5变体的相同度小于80％。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列是seq id no:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46和47或与其(编码cdkl5-1或hcdkl5-1；seq id no:2的氨基酸序列)至少约95％相同。在某些实施例中，功能性hcdkl5具有seq id no:2(cdkl5-1或hcdkl5-1)的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hcdkl5具有seq id no:6(cdkl5-2gs或hcdkl5-2gs)的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hcdkl5具有seq id no:8(cdkl5-3gs或hcdkl5-3gs)的氨基酸序列。在某些实施例中，功能性hcdkl5具有seq id no:10(cdkl5-4gs或hcdkl5-4gs)的氨基酸序列。在某些实施例中，调控序列指导hcdkl5在中枢神经系统细胞中表达。在某些实施例中，所述调控序列包括人突触蛋白启动子(hsyn)或cb7启动子。在某些实施例中，调控元件包括kozak序列、聚腺苷酸化序列、内含子、增强子和tata信号中的一种或多种。在某些实施例中，所述载体基因组进一步包括背根神经节(drg)特异性mirna靶序列的至少两个串联重复序列，其中所述至少两个串联重复序列包括可以相同或不同的至少一个第一mirna靶序列和至少一个第二mirna靶序列。在某些实施例中，所述载体基因组是seq id no:1的nt 1至nt 4634、或seq id no:3的nt 1至nt 4750、或seq id no:5的nt 1至nt 4757、或seq id no:7的nt 1至nt 4583、或seq id no:9的nt 1至nt 4706、或与其至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)相同的核酸序列。
[0062]
在某些实施例中，载体基因组是指包括编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型1；seq id no:2)的seq id no:1的核酸分子。在某些实施例中，载体基因组是指包括编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型2或2gs；seq id no:6)的seq id no:5的核酸分子。在某些实施例中，载体基因组是指包括编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型3或3gs；seq id no:8)的seq id no:7的核酸分子。在某些实施例中，载体基因组是指包括编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型4或4gs；seq id no:10)的seq id no:9的核酸分子。在某些实施例中，载体基因组是指包括编码hcdkl5的氨基酸序列(同种型1；seq id no:4)并且包括mirna183(seq id no:11)的seq id no:3的核酸分子。
[0063]
在某些实施例中，除hcdkl5编码序列之外，另一种非aav编码序列可以包含在内，例如，肽、多肽、蛋白质、功能性rna分子(例如，mirna、mirna抑制剂)或所关注的其它基因产物。有用的基因产物可以包含mirna。mirna和其它小干扰核酸通过靶信使rna(mrna)的靶rna转录物裂解/降解或转译抑制来调节基因表达。mirna是天然表达的，通常作为最终的19-25种非转译的rna产物。mirna通过与靶mrna的3'非转译区(utr)的序列特异性相互作用展现出其活性。这些内源表达的mirna形成发夹前体，所述发夹前体随后被加工成mirna双链体，并且被进一步加工成“成熟的”单链mirna分子。这种成熟的mirna引导多蛋白复合物mirisc，所述多蛋白复合物基于与成熟的mirna的互补性来鉴定靶mrna的靶位点，例如在3
′
utr区中。
[0064]
如本文所使用的，“mirna靶序列”是定位在dna正链(5'处到3'处)上的序列，并且至少部分地与mirna序列互补，所述mirna序列包含mirna种子序列。mirna靶序列对于经过编码的转基因产物的非翻译区是外源的，并且被设计成在期望抑制转基因表达的细胞中被mirna特异性地靶向。术语“mir183簇靶序列”是指对mir183簇(可替代地称为家族)的一个或多个成员有应答的靶序列，包含mir-183、mir-96和mir-182(如dambal,s.等人,《核酸研究》43:7173-7188,2015所描述的，所述文献通过引用并入本文中)。
[0065]
通常，mirna靶序列的长度为至少7个核苷酸到约28个核苷酸、长度为至少8个核苷酸到约28个核苷酸、7个核苷酸到28个核苷酸、8个核苷酸到18个核苷酸、长度为12个核苷酸到28个核苷酸、约20个到约26个核苷酸、约22个核苷酸、约24个核苷酸或约26个核苷酸，并且所述mirna靶序列含有至少一个与mirna种子序列互补的连续区(例如，7或8个核苷酸)。在某些实施例中，靶序列包括与mirna种子序列具有精确互补性(100％)或部分互补性且具有一些错配的序列。在某些实施例中，靶序列包括与mirna种子序列100％互补的至少7个到8个核苷酸。在某些实施例中，靶序列由与mirna种子序列100％互补的序列组成。在某些实施例中，靶序列含有与种子序列100％互补的序列的多个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，100％互补性区包括靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，靶序列的剩余部分与mirna具有至少约80％到约99％的互补性。在某些实施例中，在含有dna正链的表达盒中，mirna靶序列是mirna的反向补体。
[0066]
如本文所使用的，“mirna靶序列”是定位在dna正链(5'处到3'处)上的序列，并且至少部分地与mirna序列互补，所述mirna序列包含mirna种子序列。mirna靶序列对于经过编码的转基因产物的非翻译区是外源的，并且被设计成在期望抑制转基因表达的细胞中被mirna特异性地靶向。术语“mir183簇靶序列”是指对mir183簇(可替代地称为家族)的一个或多个成员有应答的靶序列，包含mir-183、mir-96和mir-182(如dambal,s.等人,《核酸研究》43:7173-7188,2015所描述的，所述文献通过引用并入本文中)。不希望受理论束缚，用于转基因(对基因产物进行编码)的信使rna(mrna)存在于递送有含有mirna的表达盒的细胞类型中，使得mirna与3'utr mirna靶序列的特异性结合导致mrna沉默和切割，由此减少或消除仅在表达mirna的细胞中的转基因表达。
[0067]
通常，mirna靶序列的长度为至少7个核苷酸到约28个核苷酸、长度为至少8个核苷酸到约28个核苷酸、7个核苷酸到28个核苷酸、8个核苷酸到18个核苷酸、长度为12个核苷酸到28个核苷酸、约20个到约26个核苷酸、约22个核苷酸、约24个核苷酸或约26个核苷酸，并且所述mirna靶序列含有至少一个与mirna种子序列互补的连续区(例如，7或8个核苷酸)。在某些实施例中，靶序列包括与mirna种子序列具有精确互补性(100％)或部分互补性且具有一些错配的序列。在某些实施例中，靶序列包括与mirna种子序列100％互补的至少7个到8个核苷酸。在某些实施例中，靶序列由与mirna种子序列100％互补的序列组成。在某些实施例中，靶序列含有与种子序列100％互补的序列的多个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，100％互补性区包括靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，靶序列的剩余部分与mirna具有至少约80％到约99％的互补性。在某些实施例中，在含有dna正链的表达盒中，mirna靶序列是mirna的反向补体。
[0068]
在某些实施例中，表达盒mrna或dna正链的至少第一和/或至少第二mirna靶序列的mirna靶序列选自：(i)agtgaattctaccagtgccata(mir183，seq id no:11)；(ii)
agcaaaaatgtgctagtgccaaa(mir-96，seq id no:12)；(ii)agtgtgagttctaccattgccaaa(mir182，seq id no:13)。在其它实施例中，选择agggattcctgggaaaactggac(seq id no:14)。
[0069]
在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有作为mir-183靶序列的至少一个mirna靶序列。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有mir-183靶序列，其包含agtgaattctaccagtgccata(seq id no:11)，其中与mir-183种子序列互补的序列是gtgccat。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有与mir-183种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，mir-183靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包含与mir-183种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，mir-183靶序列含有与seq id no:11部分互补的序列，且因此当与seq id no:11比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与seq id no:11比对时，mir-183靶序列包括具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配的序列，其中所述错配可以是不连续的。在某些实施例中，mir-183靶序列包含具有100％互补性的区，所述区还包括mir-183靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区域包含与mir-183种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，mir-183靶序列的其余部分与mir-183具有至少约80％至约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含mir-183靶序列，所述靶序列包括截短的seq id no:11，即在seq id no:1的5'端或3'端中的任一端或两端处缺乏至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括转基因和一个mir-183靶序列。在又其它实施例中，表达盒或载体基因组包括至少两个、三个或四个mir-183靶序列。(i)agtgaattctaccagtgccata(mir183，seq id no:11)；(ii)agcaaaaatgtgctagtgccaaa(mir-96，seq id no:12)。
[0070]
在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有作为mir-182靶序列的至少一个mirna靶序列。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有mir-182靶序列，其包含agtgtgagttctaccattgccaaa(seq id no:13)。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有与mir-182种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，mir-182靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包含与mir-182种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，mir-182靶序列含有与seq id no:13部分互补的序列，且因此当与seq id no:13比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与seq id no:13比对时，mir-183靶序列包括具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配的序列，其中所述错配可以是不连续的。在某些实施例中，mir-182靶序列包含具有100％互补性的区，所述区还包括mir-182靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区域包含与mir-182种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，mir-182靶序列的其余部分与mir-182具有至少约80％至约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含mir-182靶序列，所述靶序列包括截短的seq id no:13，即在seq id no:13的5'端或3'端中的任一端或两个端处缺乏至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括转基因和一个mir-182靶序列。在其它实施例中，表达盒或载体基因组包括至少两个、三个或四个mir-182靶序列。
[0071]
本文所使用的术语“串联重复序列”是指存在两个或更多个连续的mirna靶序列。这些mirna靶序列可以是连续的，即一个接一个地直接定位，使得一个靶序列的3'端直接位
于下一个靶序列的5'端的上游，没有中间序列，或者反之亦然。在另一个实施例中，mirna靶序列中的两个或更多个mirna靶序列由短间隔子序列隔开。
[0072]
如本文所使用的，“间隔子”是任何所选核酸序列，例如，长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的定位在两个或更多个连续mirna靶序列之间的核酸序列。在某些实施例中，间隔子的长度为1个到8个核苷酸、长度为2个到7个核苷酸、长度为3个到6个核苷酸、长度为四个核苷酸、4个到9个核苷酸、3个到7个核苷酸或更大的值。合适地，间隔子是非编码序列。在某些实施例中，间隔子可以具有四(4)个核苷酸。在某些实施例中，间隔子是ggat。在某些实施例中，间隔子是六(6)个核苷酸。在某些实施例中，间隔子是cacgtg或gcatgc。
[0073]
在某些实施例中，串联重复序列含有相同的mirna靶序列中的两个、三个、四个或更多个mirna靶序列。在某些实施例中，串联重复序列含有至少两个不同mirna靶序列、至少三个不同mirna靶序列或至少四个不同mirna靶序列等。在某些实施例中，串联重复序列可含有相同mirna靶序列中的两个或三个和不同的第四mirna靶序列。
[0074]
在某些实施例中，表达盒中可以有至少两组不同的串联重复序列。例如，3'utr可含有紧接在转基因下游的串联重复序列、utr序列和两个或更多个更接近utr的3'端的串联重复序列。在另一实例中，5'utr可含有一个、两个或更多个mirna靶序列。在另一实例中，3'处可含有串联重复序列，并且5'utr可含有至少一个mirna靶序列。
[0075]
在某些实施例中，表达盒含有两个、三个、四个或更多个串联重复序列，所述串联重复序列在转基因的终止密码子的约0个到20个核苷酸内开始。在其它实施例中，表达盒含有距转基因的终止密码子至少100个至约4000个核苷酸的mirna串联重复序列。
[0076]
在某些实施例中，所述mirna靶序列之间的所述间隔子是相同的。如本文所使用的，除非另有规定，否则cdkl5或hcdkl5是指同种型1。同种型2-4可以被指定为：cdkl5-2gs或hcdkl5-2gs、cdkl5-3gs或hcdkl5-3gs、以及cdkl5-4gs或hcdkl5-4gs。具有这些同种型的表达盒和载体基因组可以如同种型1所描述的进行构建。
[0077]
参见于2019年12月20日提交的pct/us19/67872，现在的wo 2020/132455，所述申请通过引用整体并入本文，以及于2020年5月12日提交的美国临时专利申请第63/023,593号；于2020年6月12日提交的美国临时专利申请第63/038,488号；于2020年6月24日提交的美国临时专利申请第63/043,562号；以及于2020年9月16日提交的美国临时专利申请第63/079,299号、于2011年2月22日提交的美国临时专利申请第63/152,042号，以上均通过引用特此并入。
[0078]
在某些实施例中，进化枝f aav衣壳选自aavhu68衣壳、aav9衣壳、aavhu31衣壳、aavhu32衣壳、或这些衣壳中的一种衣壳的工程化变体(例如，aav-php.b)。编码aavhu68衣壳蛋白的核酸序列用于以下实例以产生携带所述载体基因组的aav.hcdkl5重组aav(raav)。在wo 2018/160582和us 2015/0079038中提供了与aavhu68或aav-php.b相关的另外的细节，所述文献中的每个文献通过引用整体并入本文。本文所述的进化枝f载体非常适合将包括hcdkl5编码序列的载体基因组递送到中枢神经系统内的细胞，所述中枢神经系统包含脑、海马体、运动皮层、小脑和运动神经元。这些载体可以用于靶向中枢神经系统(cns)内的其它细胞以及cns外的某些其它组织和细胞。
[0079]
在某些实施例中，用于本文描述的组合物和方法的aav衣壳是基于靶细胞来选择
的。在某些实施例中，aav衣壳转导cns细胞和/或pns细胞。在某些实施例中，aav衣壳选自cy02衣壳、rh43衣壳、aav8衣壳、rh01衣壳、aav9衣壳、rh8衣壳、rh10衣壳、bb01衣壳、hu37衣壳、rh02衣壳、rh20衣壳、rh39衣壳、rh64衣壳、aav6衣壳、aav1衣壳、hu44衣壳、hu48衣壳、cy05衣壳、hu11衣壳、hu32衣壳、pi2衣壳或其变体。在某些实施例中，aav衣壳是进化枝f衣壳，如aav9衣壳、aavhu68衣壳、hu31衣壳、hu32衣壳或其变体。参见例如于2015年4月14日公布的wo 2005/033321、wo 2018/160582和us 2015/0079038，所述文献中的每个文献通过引用整体并入本文。在某些实施例中，aav衣壳是非进化枝f衣壳，例如进化枝a、b、c、d或e衣壳。在某些实施例中，非进化枝f衣壳是aav1或其变体。在某些实施例中，aav衣壳转导神经系统细胞以外的靶细胞。在某些实施例中，aav衣壳是进化枝a衣壳(例如，aav1、aav6、aavrh91)、进化枝b衣壳(例如，aav2)、进化枝c衣壳(例如，hu53)、进化枝d衣壳(例如，aav7)或进化枝e衣壳(例如，rh10)。在某些实施例中，aav衣壳是进化枝a衣壳，如aavrh91衣壳(seq id no:33和seq id no:35的核酸序列)。参见2020年4月29日提交的pct/us20/030266，现在公布的wo2020/223231，其通过引用并入本文以及于2019年4月29日提交的美国临时专利申请第63/065,616号，所述申请通过引用特此并入。另参见于2020年8月14日提交的美国临时申请第63/065,616号和于2020年11月4日提交的美国临时专利申请第63/109,734号，所述申请通过引用并入本文。仍然可以选择其它aav衣壳。
[0080]
如本文所使用的，与aav的组有关的术语“进化枝”是指如基于对aav vp1氨基酸序列进行的比对，通过(至少1000个复制品的)至少75％的自举值(bootstrap value)和不大于0.05的泊松校正距离测量结果(poisson correction distance measurement)使用邻接算法(neighbor-joining algorithm)确定的一组在系统发育上彼此相t关的aav。在文献中已经描述了邻接算法。参见例如m.nei和s.kumar,《分子进化和系统发育学(molecular evolution and phylogenetics)》(牛津大学出版社(oxford university press),纽约(2000))。提供了可以用于实施此算法的可用计算机程序。例如，mega v2.1程序实施了经修改的nei-gojobori方法。使用这些技术和计算机程序以及aav vp1衣壳蛋白的序列，本领域技术人员可以容易地确定所选aav是含在本文所鉴定的进化枝之一中，还是在这些进化枝之外的另一个进化枝中。参见例如g gao等人,《病毒学杂志(jvirol)》,2004年6月；78(10):6381-6388，所述文献鉴定进化枝a、b、c、d、e和f，并提供新颖aav的核酸序列，genbank登录号ay530553到ay530629。还参见wo2005/033321。
[0081]
raav由aav衣壳和载体基因组构成。aav衣壳是vp1的异质群体、vp2的异质群体和vp3蛋白的异质群体的组装。如本文所使用的，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异质”或其任何语法变型是指由不相同的元件组成的群体，例如具有带有不同的经修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白质)。
[0082]
如本文所使用的，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异质”或其任何语法变型是指由不相同的元件组成的群体，例如具有带有不同的经修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白质)。与vp1、vp2和vp3蛋白(可替代地被称为同种型)结合使用的术语“异质群体”是指衣壳内的vp1、vp2和vp3蛋白的氨基酸序列中的差异。aav衣壳含有具有来自预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群。这些亚群体至少包含某些脱酰胺化的天冬酰胺(n或asn)残基。例如，某些亚群包括天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺的天冬酰胺(n)位置，并且任选地进一步包括其它脱酰胺的氨基酸，
hcdkl5编码序列-polya-3'itr的载体基因组。在某些实施例中，构建了包括5'aav itr-启动子-任选的增强子-任选的内含子-hcdkl5编码序列-任选地重复mir脱靶序列-polya-3'itr的载体基因组。在某些实施例中，构建了包括5'aav itr-启动子-任选的内含子-hcdkl5编码序列-任选的增强子-polya-3'itr的载体基因组。在某些实施例中，构建了包括5'aav itr-启动子-任选的增强子-任选的内含子-hcdkl5编码序列-任选的增强子-任选地重复mir脱靶序列-polya-3'itr的载体基因组。在某些实施例中，itr来自aav2。在某些实施例中，存在多于一种启动子。在某些实施例中，增强子存在于载体基因组中。在某些实施例中，存在多于一种增强子。在某些实施例中，内含子存在于载体基因组中。在某些实施例中，存在增强子和内含子。在某些实施例中，polya是sv40polya(即，源自猿猴病毒40(sv40)晚期基因的聚腺苷酸化(polya)信号)。在某些实施例中，polya是兔β-珠蛋白(rbg)polya。在某些实施例中，载体基因组至少包括：5'aav itr-hsyn启动子-hcdkl5编码序列-polya-3'itr。在某些实施例中，载体基因组至少包括5'aav itr-cb7启动子
–
hcdkl5编码序列-rbg polya-3'itr。在某些实施例中，drg脱靶序列是如本文所描述的一个、两个、三个、四个或更多个mir183序列，并且包含在表达盒中。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列针对cdkl5。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列针对cdkl5-2gs。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列针对cdkl5-3gs。在某些实施例中，所述hcdkl5编码序列针对cdkl5-4gs。任选地，这些载体基因组中的一个或多个载体基因组包含wpre元件。
[0090]
如本文所使用的，载体基因组或包括载体基因组的raav在本文中被展示为aav-启动子(任选)-kozak(任选)-内含子(任选)-cdkl5编码序列(例如，hcdkl5、hcdkl5co、cdkl5、cdkl5co)-mirna(任选)-polya(任选)-填充片段(任选)。在某些实施例中，raav在本文中被展示为aav衣壳-启动子(任选)-kozak(任选)-内含子(任选)-cdkl5编码序列-mirna(任选)-polya(任选)-填充片段(任选)。任选地，这些载体基因组中的一个或多个载体基因组包含wpre元件。
[0091]
在某些实施例中，载体基因组至少包括5'aav itr-泛素c启动子
–
hcdkl5编码序列-一个、两个、三个、四个或更多个mir183序列-rbg polya-3'itr。在某些实施例中，载体基因组至少包括5'aav itr-鸡β肌动蛋白启动子
–
hcdkl5编码序列-一个、两个、三个、四个或更多个mir183序列-rbg polya-3'itr。任选地，这些载体基因组中的一个或多个载体基因组包含wpre元件。
[0092]
另外，本文提供了一种可用于产生如本文所述的raav的raav产生系统。所述产生系统包括细胞培养物，所述细胞培养物包括(a)编码aav衣壳蛋白的核酸序列；(b)载体基因组；和(c)足够的aav rep功能和辅助功能，以允许将所述载体基因组包装到aav衣壳中。在某些实施例中，载体基因组是seq id no:1、3、5、7、9、29或31。在某些实施例中，细胞培养物是人胚肾293细胞培养物。在某些实施例中，aav rep来自不同的aav。在某些实施例中，其中aav rep来自aav2。在某些实施例中，aav rep编码序列和cap基因在同一核酸分子上，其中rep序列与cap基因之间任选地存在间隔子。在某些实施例中，间隔子是atgacttaaaccaggt(seq id no:15)。
[0093]
供产生aav病毒载体(例如，重组(r)aav)之用，载体基因组可以携带在递送到包装宿主细胞的任何合适的载体(例如，质粒)上。可在本发明使用的质粒可以被工程化，使得其适合于在原核细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及其它细胞中进行体外复制和包装。合适的
转染技术和包装宿主细胞是已知的和/或可以由本领域的技术人员容易地设计。
[0094]
用于产生和分离适合于用作载体的aav的方法是本领域已知的。通常参见例如grieger和samulski,2005,腺相关病毒作为基因疗法载体：载体研发、产生及临床应用(adeno-associated virus as a gene therapy vector:vector development,production and clinical applications),《生化工程/生物技术进展(adv.biochem.engin/biotechnol.)》99:119-145；buning等人,2008,腺相关病毒载体技术的最新进展(recent developments in adeno-associated virus vector technology),《基因医学杂志(j.gene med.)》10:717-733；以及下文引用的参考文献，这些参考文献中的每个参考文献通过引用整体并入本文中。如本文所使用的，基因疗法载体是指如本文所描述的适于治疗患者的raav。为了将基因包装到病毒粒子中，itr是在与含有基因的核酸分子相同的构建体中需要的顺式的唯一aav组分。cap和rep基因可以反式供应。
[0095]
在一个实施例中，所选基因元件可以通过任何合适的方法递送到aav包装细胞，所述方法包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速dna包被的粒料、病毒感染和原生质体融合。也可以制备稳定的aav包装细胞。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如《分子克隆：实验室手册》,由green和sambrook编辑,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(2012)。
[0096]
术语“aav中间体”或“aav载体中间体”是指缺少包装在其中的所期望的基因组序列的组装的raav衣壳。这些也可以被称为“空”衣壳。此类衣壳可以不含有表达盒的可检测基因组序列，或者含有不足以实现基因产物的表达的仅部分包装的基因组序列。这些空衣壳是非功能性的以将所关注的基因转移到宿主细胞。
[0097]
可以使用已知的技术产生本文所描述的重组腺相关病毒(aav)。参见例如wo 2003/042397、wo 2005/033321、wo 2006/110689、us 7588772 b2。此类方法涉及培养含有对aav衣壳蛋白进行编码的核酸序列的宿主细胞；功能性rep基因；至少由aav反向末端重复序列(itr)和转基因构成的表达盒；以及足够的辅助功能以允许将表达盒包装到aav衣壳蛋白中。已经描述了产生衣壳的方法、其编码序列以及产生raav病毒载体的方法。参见例如gao等人,《美国科学院院刊》,100(10),6081-6086(2003)和us2013/0045186a1。
[0098]
在一个实施例中，提供了一种可用于产生重组aavhu68或aavrh91的产生细胞培养物。此类细胞培养物含有在宿主细胞中表达aavhu68衣壳蛋白的核酸；适合包装到aavhu68衣壳中的核酸分子，例如含有aav itr和对与调控序列可操作地连接的基因进行编码的非aav核酸序列的载体基因组，所述调控序列指导所述基因在宿主细胞中表达；以及足以允许将载体基因组包装到重组aavhu68或aavrh91衣壳中的aav rep功能和腺病毒辅助功能。在一个实施例中，细胞培养物由哺乳动物细胞(例如，人胚肾293细胞以及其它细胞)或昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)(sf9)细胞)构成。在某些实施例中，杆状病毒提供了将载体基因组包装到重组aavhu68衣壳或aavrh91衣壳中所必需的辅助功能。
[0099]
任选地，rep功能由除了hu68或aav-php.b之外的aav提供。在某些实施例中，rep功能的至少一部分来自aavhu68或aavrh91。在另一个实施例中，rep蛋白是aavhu68rep以外的异源rep蛋白，例如但不限于aav1 rep蛋白、aav2 rep蛋白、aav3 rep蛋白、aav4 rep蛋白、aav5 rep蛋白、aav6 rep蛋白、aav7 rep蛋白、aav8 rep蛋白；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep 68/78和rep 40/52；或其片段；或者其它来源。这些aavhu68或突变aav衣壳序
列中的任一种都可以处于指导其在宿主细胞中表达的外源性调控序列的控制下。
[0100]
在一个实施例中，在合适的细胞培养物(例如，hek 293或sf9)或悬浮液中制造细胞。用于制造本文所描述的基因疗法载体的方法包含本领域众所周知的方法，如产生用于产生基因疗法载体的质粒dna、产生载体以及纯化载体。在一些实施例中，基因疗法载体是aav载体，并且所产生的质粒是对aav载体基因组和所关注的基因进行编码的aav顺式质粒、含有aav rep和cap基因的aav反式质粒以及腺病毒辅助质粒。载体产生过程可以包含方法步骤，如开始细胞培养、进行细胞传代、接种细胞、用质粒dna转染细胞、将转染后培养基交换为无血清培养基以及采集含载体的细胞和培养基。所采集的含载体的细胞和培养基在本文中被称为粗细胞采集物。在又另一个系统中，通过用基于杆状病毒的载体进行感染来将基因疗法载体引入到昆虫细胞中。关于这些产生系统的综述，通常参见例如zhang等人,2009,用于大规模重组腺相关病毒产生的腺病毒-腺相关病毒杂合体(adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production),《人类基因疗法(human gene therapy)》20:922-929，这些参考文献中的每个参考文献的内容以全文引用的方式并入本文中。在以下美国专利中也描述了制备和使用这些及其它aav产生系统的方法，所述美国专利中的每个美国专利的内容通过引用整体并入本文中：美国专利第5,139,941号、第5,741,683号、第6,057,152号、第6,204,059号、第6,268,213号、第6,491,907号、第6,660,514号、第6,951,753号、第7,094,604号、第7,172,893号、第7,201,898号、第7,229,823号和第7,439,065号。
[0101]
此后，粗细胞采集物可以是本主题的方法步骤，如浓缩载体采集物、渗滤载体采集物、微流化载体采集物、核酸酶消化载体采集物、过滤经微流化的中间体、通过色谱粗纯化、通过超速离心法粗纯化、通过切向流过滤进行缓冲液交换和/或调配和过滤以制备大量载体。
[0102]
在高盐浓度下进行两步亲和色谱纯化，然后使用阴离子交换树脂色谱来纯化载体药物产物并去除空衣壳。这些方法在于2016年12月9日提交的wo 2017/160360及其优先权文档、于2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,071号以及于2015年12月11日提交并题为“aav9的可分级纯化方法(scalable purification method for aav9)”的第62/226,357号中更详细地描述，这些申请通过引用并入本文中。在某些实施例中，载体药物产品(例如aavrh91)的纯化包含于2016年12月9日提交的wo2017/100674及其优先权文档、于2015年12月9日提交的美国临时专利申请第62/266,351号以及于2016年4月13日提交并题为“aav1的可分级纯化方法(scalable purification method for aav1)”的第62/322,083号中描述的载体药物产品的纯化，这些申请通过引用并入本文中。
[0103]
为了计算空颗粒和满颗粒的含量，将所选样品(例如，在本文的实例中经过碘克沙醇(iodixanol)梯度纯化的制剂，其中基因组拷贝(gc)数＝颗粒数)的vp3带体积相对于加载的gc颗粒进行作图。所得线性等式(y＝mx+c)用于计算测试品峰的带状体积中的颗粒的数量。然后将加载的每20μl颗粒数量(pt)乘以50，以得到颗粒(pt)/ml。将pt/ml除以gc/ml得到颗粒与基因组拷贝的比率(pt/gc)。pt/ml-gc/ml得到空pt/ml。空pt/ml除以pt/ml并且
×
100得到空颗粒的百分比。
[0104]
通常，用于测定具有包装的基因组的空衣壳和aav载体颗粒的方法是本领域已知的。参见例如grimm等人,《基因疗法》(1999)6:1322-1330；sommer等人,《分子疗法
(molec.ther.)》(2003)7:122-128。为了测试变性的衣壳，所述方法包含使经处理的aav原液经受sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如在缓冲液中含有3-8％三乙酸盐的梯度凝胶)，然后运行凝胶直到分离出样品材料，并且将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜(优选地是尼龙)上。然后，将抗aav衣壳抗体用作与变性的衣壳蛋白结合的初级抗体，优选地抗aav衣壳单克隆抗体，最优选地b1抗aav-2单克隆抗体(wobus等人,《病毒学杂志》(2000)74:9281-9293)。然后使用次级抗体，所述次级抗体与初级抗体结合并且含有一种用于检测与初级抗体的结合的装置，更优选地是含有与其共价结合的检测分子的抗igg抗体，最优选地是与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠igg抗体。一种用于检测结合的方法用于半定量地确定初级抗体与次级抗体之间的结合，优选地是能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选地是化学发光检测试剂盒。例如，对于sds-page，可以从柱级分中提取样品并在含有还原剂(例如，dtt)的sds-page上样缓冲液中加热，并且在预制的梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如，novex)上解析衣壳蛋白。可以根据制造商的说明使用silverxpress(加利福尼亚州英杰公司(invitrogen,ca))或其它合适的染色方法(即，sypro红宝石色或考马斯染色)进行银染色。在一个实施例中，可以通过定量实时pcr(q-pcr)测量柱级分中的aav载体基因组(vg)的浓度。将样品稀释并用dnase i(或另一种合适的核酸酶)消化以去除外源性dna。在核酸酶失活后，使用引物和对引物之间的dna序列具有特异性的taqman
tm
荧光探针进一步稀释和扩增样品。在applied biosystems prism 7700序列检测系统上测量每种样品达到定义的荧光水平所需的周期的数量(阈值周期，ct)。含有与aav载体中所含序列相同的序列的质粒dna用于在q-pcr反应中产生标准曲线。从样品获得的周期阈值(ct)的值用于通过相对于质粒标准曲线的ct值对其进行归一化来确定载体基因组效价。也可以使用基于数字pcr的端点测定。
[0105]
一方面，使用了经优化的q-pcr方法，所述方法利用了广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶k(如可从凯杰公司(qiagen)商购获得)。更具体地，经过优化的qpcr基因组效价测定与标准测定类似，不同之处在于在dnase i消化之后，将样品用蛋白酶k缓冲液稀释并用蛋白酶k处理，然后进行热失活。合适地，以等于样品大小的量用蛋白酶k缓冲液稀释样品。蛋白酶k缓冲液可以浓缩2倍或更多倍。通常，蛋白酶k处理为约0.2mg/ml，但是可以在0.1g/ml到约1mg/ml之间变化。处理步骤通常在约55℃下进行持续约15分钟，但是可以在较低温度(例如，约37℃到约50℃)下进行持续较长的时间段(例如，约20分钟到约30分钟)，或者在较高的温度(例如，至多约60℃)下进行持续较短的时间段(例如，约5到10分钟)。类似地，热失活通常在约95℃下持续约15分钟，但是温度可以降低(例如，约70℃到约90℃)并且时间延长(例如，约20分钟到约30分钟)。然后将样品稀释(例如，1000倍)，并如标准测定中所描述的进行taqman分析。
[0106]
另外地或可替代地，可以使用液滴数字pcr(ddpcr)。例如，已经描述了用于通过ddpcr确定单链和自身互补aav载体基因组效价的方法。参见例如m.lock等人,《人类基因疗法方法(hu gene therapy methods)》《人类基因疗法方法》.2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.电子出版2014年2月14日。
[0107]
简而言之，用于从基因组缺陷型aavhu68(或aavrh91)中间体中分离具有包装的基因组序列的raavhu68(或aavrh91)颗粒的方法涉及使包括重组aavhu68(或rh91)病毒颗粒和aavhu68(或aavrh91)衣壳中间体的悬浮液经受高效液相色谱，其中aavhu68(或aavrh91)
病毒颗粒和aavhu68中间体与在约10.2的ph下(或针对aavrh91约9.8)平衡的强阴离子交换树脂结合，并经受盐梯度，同时监测洗脱液在约260纳米(nm)和约280nm下的紫外线吸光度。尽管对于raavhu68和aavrh91不是最佳的，但是ph的范围可以为约10到10.4。在此方法中，当a260/a280的比率达到拐点时，从洗脱的级分中收集aav完整衣壳。在一个实例中，对于亲和色谱步骤，可以将经渗滤的产物应用于有效捕获aavhu68或aavrh91血清型的亲和树脂(生命科技公司(life technologies))。在这些离子条件下，显著百分比的残留的细胞dna和蛋白质流过柱，而aav颗粒则被有效捕获。
[0108]
将raav.hcdkl5悬浮在合适的生理相容性组合物(例如，缓冲盐水)中。可以将此组合物冷冻储存，随后解冻，并任选地用合适的稀释剂稀释。可替代地，可以将载体制备为适于递送到患者而无需进行冷冻和解冻步骤的组合物。
[0109]
如本文所使用的，术语“nab效价”是产生多少中和抗体(例如，抗aav nab)的量度，所述中和抗体中和其靶向的表位(例如，aav)的生理作用。抗aav nab效价可以如在例如calcedo,r等人,针对腺相关病毒的中和抗体的世界范围的流行病(worldwide epidemiology of neutralizing antibodies to adeno-associated viruses).《传染病杂志(journal of infectious diseases)》,2009.199(3):第381-390页中所描述的那样进行测量，其通过引用并入本文中。
[0110]
缩写“sc”是指自身互补的。“自身互补aav”是指其中由重组aav核酸序列所携带的编码区已经被设计成形成分子内双链dna模板的构建体。感染后，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scaav将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链dna(dsdna)。参见例如d m mccarty等人,“自身互补重组腺相关病毒(scaav)载体独立于dna合成而促进高效转导(self-complementary recombinant adeno-associated virus(scaav)vectors promote efficient transduction independently of dna synthesis)”,《基因疗法》,(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。自补aav在例如美国专利第6,596,535号、第7,125,717号和第7,456,683号中都有描述，这些专利各自通过引用以其全部内容并入本文。
[0111]“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有所关注的基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，所述合成或人工病毒颗粒不能生成子代病毒但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)
”‑
仅含有所关注的基因，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。
[0112]
在许多情况下，raav颗粒被称为dnase抗性的。然而，除此核酸内切酶(dnase)之外，其它核酸内切酶和核酸外切酶也可以用于本文所描述的纯化步骤中，以去除污染性核酸。可以选择此类核酸酶以降解单链dna和/或双链dna以及rna。此类步骤可以含有单个核酸酶或针对不同靶标的核酸酶的混合物，并且可以是核酸内切酶或核酸外切酶。
[0113]
术语“核酸酶抗性”表示aav衣壳已经在表达盒周围完全组装，所述表达盒被设计成将基因递送到宿主细胞并保护这些包装的基因组序列在被设计成去除产生过程中可能
存在的污染性核酸的核酸酶温育步骤期间免于降解(消化)。
[0114]
iv.其它载体
[0115]
本文提供包括如本文所述的表达盒的载体。在某些实施例中，表达盒包括编码功能性人细胞周期蛋白依赖性激酶样5(hcdkl5)的核酸序列，所述核酸序列处于指导hcdkl5表达的调控序列的控制下。在某些实施例中，hcdkl5编码序列编码hcdkl5蛋白，所述hcdkl5蛋白包括
[0116]
[mkipnignvmnkfeilgvvgegaygvvlkcrhketheivaikkfkdseeneevkettlrelkmlrtlkqenivelkeafrrrgklylvfeyveknmlelleempngvppekvksyiyqlikaihwchkndivhrdikpenllishndvlklcdfgfarnlsegnnanyteyvatrwyrspelllgapygksvdmwsvgcilgelsdgqplfpgeseidqlftiqkvlgplpseqmklfysnprfhglrfpavnhpqslerrylgilnsvlldlmknllkldpadrylteqclnhptfqtqrlldrspsrsakrkpyhvesstlsnrnqagkstalqshhrsnskdiqnlsvglpradeglpanesflngnlagaslsplhtktyqassqpgstskdltnnniphllspkeaksktefdfnidpkpsegpgtkylksnsrsqqnrhsfmessqskagtlqpnekqsrhsyidtipqssrspsyrtkakshgalsdsksvsnlsearaqiaepstsryfpsscldlnsptsptptrhsdtrtllspsgrnnrnegtldsrrtttrhsktmeelklpehmdsshshslsaphesfsyglgytspfssqqrphrhsmyvtrdkvrakgldgslsigqgmaaranslqllspqpgeqlppemtvarssvketsregtssfhtrqkseggvyhdphsddgtapkenrhlyndpvprrvgsfyrvpsprpdnsfhennvstrvsslpsesssgtnhskrqpafdpwkspenishseqlkekekqgffrsmkkkkkksqtvpnsdspdlltlqksihsastpssrpkewrpekisdlqtqsqplkslrkllhlssasnhpassdprfqpltaqqtknsfseirihplsqasggssnirqepapkgrpalqlpgqmdpgwhvssvtrsategpsyseqlgaksgpnghpynrtnrsrmpnlndlketal]的氨基酸序列(seq id no:2)，其中所述hcdkl5编码序列是seq id no:22的核酸序列或具有与seq id no:22至少约95％相同的序列并且编码seq id no:2的蛋白质。在某些实施例中，hcdkl5编码序列编码hcdkl5-2gs蛋白，所述hcdkl5-2gs蛋白包括
[0117]
[mkipnignvmnkfeilgvvgegaygvvlkcrhketheivaikkfkdseeneevkettlrelkmlrtlkqenivelkeafrrrgklylvfeyveknmlelleempngvppekvksyiyqlikaihwchkndivhrdikpenllishndvlklcdfgfarnlsegnnanyteyvatrwyrspelllgapygksvdmwsvgcilgelsdgqplfpgeseidqlftiqkvlgplpseqmklfysnprfhglrfpavnhpqslerrylgilnsvlldlmknllkldpadrylteqclnhptfqtqrlldrspsrsakrkpyhvesstlsnrnqagkstalqshhrsnskdiqnlsvglpradeglpanesflngnlagaslsplhtktyqassqpgstskdltnnniphllspkeaksktefdfnidpkpsegpgtkylksnsrsqqnrhsfmessqskagtlqpnekqsrhsyidtipqssrspsyrtkakshgalsdsksvsnlsearaqiaepstsryfpsscldlnsptsptptrhsdtrtllspsgrnnrnegtldsrrtttrhsktmeelklpehmdsshshslsaphesfsyglgytspfssqqrphrhsmyvtrdkvrakgldgslsigqgmaaranslqllspqpgeqlppemtvarssvketsregtssfhtrqkseggvyhdphsddgtapkenrhlyndpvprrvgsfyrvpsprpdnsfhennvstrvsslpsesssgtnhskrqpafdpwkspenishseqlkekekqgffrsmkkkkkksqttdstngenpsikkslfplfnsknhlkhssslkklpvvtppmvpnsdspdlltlqksihsastpssrpkewrpekisdlqtqsqplkslrkllhlssasnhpassdprfqpltaqqtknsfseirihplsqasggssnirqepapkgrpalqlpgqmdpgwhvssvtrsategpsyseqlgaksgpnghpynrtnrsrmpnlndlketal]的氨基酸序列(seq id no:6)，其中所述hcdkl5编码序列包括seq id no:24的核酸序列或与seq id no:24至少约95％相同的序列并且编码seq id no:6的蛋白质。在某些实施例中，hcdkl5编码序列编码hcdkl5-3gs蛋白，所述hcdkl5-3gs蛋白包括
[0118]
[mkipnignvmnkfeilgvvgegaygvvlkcrhketheivaikkfkdseeneevkettlrelkmlrtlkqenivelkeafrrrgklylvfeyveknmlelleempngvppekvksyiyqlikaihwchkndivhrdikpenllishndvlklcdfgfarnlsegnnanyteyvatrwyrspelllgapygksvdmwsvgcilgelsdgqplfpgeseidqlftiqkvlgplpseqmklfysnprfhglrfpavnhpqslerrylgilnsvlldlmknllkldpadrylteqclnhptfqtqrlldrspsrnqagkstalqshhrsnskdiqnlsvglpradeglpanesflngnlagaslsplhtktyqassqpgstskdltnnniphllspkeaksktefdfnidpkpsegpgtkylksnsrsqqnrhsfmessqskagtlqpnekqsrhsyidtipqssrspsyrtkakshgalsdsksvsnlsearaqiaepstsryfpsscldlnsptsptptrhsdtrtllspsgrnnrnegtldsrrtttrhsktmeelklpehmdsshshslsaphesfsyglgytspfssqqrphrhsmyvtrdkvrakgldgslsigqgmaaranslqllspqpgeqlppemtvarssvketsregtssfhtrqkseggvyhdphsddgtapkenrhlyndpvprrvgsfyrvpsprpdnsfhennvstrvsslpsesssgtnhskrqpafdpwkspenishseqlkekekqgffrsmkkkkkksqtvpnsdspdlltlqksihsastpssrpkewrpekisdlqtqsqplkslrkllhlssasnhpassdprfqpltaqqtknsfseirihplsqasggssnirqepapkgrpalqlpgqmdpgwhvssvtrsategpsyseqlgaksgpnghpynrtnrsrmpnlndlketal]的氨基酸序列(seq id no:8)，其中所述hcdkl5编码序列包括seq id no:25的核酸序列或与seq id no:25至少约95％相同的序列并且编码seq id no:8的蛋白质。在某些实施例中，hcdkl5编码序列编码hcdkl5-4gs蛋白，所述hcdkl5-4gs包括
[0119]
[mkipnignvmnkfeilgvvgegaygvvlkcrhketheivaikkfkdseeneevkettlrelkmlrtlkqenivelkeafrrrgklylvfeyveknmlelleempngvppekvksyiyqlikaihwchkndivhrdikpenllishndvlklcdfgfarnlsegnnanyteyvatrwyrspelllgapygksvdmwsvgcilgelsdgqplfpgeseidqlftiqkvlgplpseqmklfysnprfhglrfpavnhpqslerrylgilnsvlldlmknllkldpadrylteqclnhptfqtqrlldrspsrnqagkstalqshhrsnskdiqnlsvglpradeglpanesflngnlagaslsplhtktyqassqpgstskdltnnniphllspkeaksktefdfnidpkpsegpgtkylksnsrsqqnrhsfmessqskagtlqpnekqsrhsyidtipqssrspsyrtkakshgalsdsksvsnlsearaqiaepstsryfpsscldlnsptsptptrhsdtrtllspsgrnnrnegtldsrrtttrhsktmeelklpehmdsshshslsaphesfsyglgytspfssqqrphrhsmyvtrdkvrakgldgslsigqgmaaranslqllspqpgeqlppemtvarssvketsregtssfhtrqkseggvyhdphsddgtapkenrhlyndpvprrvgsfyrvpsprpdnsfhennvstrvsslpsesssgtnhskrqpafdpwkspenishseqlkekekqgffrsmkkkkkksqttdstngenpsikkslfplfnsknhlkhssslkklpvvtppmvpnsdspdlltlqksihsastpssrpkewrpekisdlqtqsqplkslrkllhlssasnhpassdprfqpltaqqtknsfseirihplsqasggssnirqepapkgrpalqlpgqmdpgwhvssvtrsategpsyseqlgaksgpnghpynrtnrsrmpnlndlketal]的氨基酸序列(seq id no:10)，其中所述hcdkl5编码序列包括seq id no:26的核酸序列或与seq id no:26至少约95％相同的序列并且编码seq id no:10的蛋白质。
[0120]
在某些实施例中，载体是选自重组细小病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺病毒的病毒载体；或是选自裸dna、裸rna、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体或基于壳聚糖的调配物的非病毒载体。所选择的载体可以通过任何合适的方法递送，所述方法包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速dna包被的粒料、病毒感染和原生质体融合。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如sambrook等人,《分子克隆实验指南(molecular cloning:a laboratory manual)》,纽约冷泉港的冷泉港实验室。
[0121]“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有所关注的基因的表达盒包装在病
毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，所述合成或人工病毒颗粒不能生成子代病毒但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)
”‑
仅含有所关注的转基因，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。此类复制缺陷型病毒可以是腺相关病毒(aav)、腺病毒、慢病毒(整合或非整合)或其它合适的病毒来源。
[0122]
v.组合物
[0123]
本文提供了一种包括如本文所述的raav或载体和水性悬浮介质的组合物。在某些实施例中，悬浮液被调配用于静脉内递送、鞘内施用或脑室内施用。
[0124]
本文提供了组合物，所述组合物含有至少一种raav原液以及任选的载体、赋形剂和/或防腐剂。如本文所使用的，raav的“原液”是指raav的群体。尽管由于脱酰胺作用，raav的衣壳蛋白具有异质性，但是原液中的raav被期望共用相同的载体基因组。原液可以包含具有衣壳的raav，所述衣壳具有例如所选aav衣壳蛋白和所选产生系统的特有的异质脱酰胺模式。原液可以从单个产生系统中产生，或者从产生系统的多次运行中汇集。可以选择各种产生系统，包含但不限于本文所描述的产生系统。
[0125]
如本文所使用的，“载剂”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶质物等。将此类培养基和药剂用于药物活性物质在本领域中是众所周知的。还可以将补充性活性成分并入到组合物中。短语“药学上可接受的”是指当向宿主施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。递送媒剂(如脂质体、纳米胶囊、微颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等)可以用于将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞中。具体地，raav载体递送的载体基因组可以被调配成用于递送或包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。
[0126]
在一个实施例中，组合物包含适合于递送到受试者的最终调配物，所述组合物是例如缓冲到生理上相容的ph和盐浓度的水性液体悬浮液。任选地，调配物中存在一种或多种表面活性剂。在另一个实施例中，可以将组合物作为稀释以施用于受试者的浓缩物运输。在其它实施例中，可以在施用时将组合物冻干并重构。
[0127]
可以从无毒的非离子表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如f68[basf]，也被称为泊洛沙姆(poloxamer)188，其具有中性ph，平均分子量为8400。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、solutol hs 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、labrasol(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油醚、tween(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“p”(对于泊洛沙姆)命名，后跟三个数字：前两位数字
×
100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字
×
10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。在一个实施例中，表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％(基于重量比，w/w％)的量存在。在另一个实施例中，表面活性
剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％(基于体积比，w/w％)的量存在。在又另一个实施例中，表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％的量存在，其中n％表示每100ml悬浮液n克。
[0128]
在另一个实施例中，组合物包含载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。鉴于转移病毒所针对的适应症，本领域的技术人员可以容易地选择合适的载剂。例如，一种合适的载体包含盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)一起调配。其它示例性载体包含无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。缓冲液/载体应包含防止raav粘附到输液管道上但不干扰raav体内结合活性的组分。可以从无毒的非离子表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如泊洛沙姆188(也以商品名f68[basf]、f68、f68、p188已知)，其具有中性ph，平均分子量为8400。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、solutol hs 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、labrasol(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧油醚、tween(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“p”(对于泊洛沙姆)命名，后跟三个数字：前两位数字
×
100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字
×
10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％的量存在。
[0129]
在某些实施例中，含有raav.hcdkl5的组合物以在6.8到8、或7.2到7.8、或7.5到8的范围内的ph递送。对于鞘内递送，可能期望ph高于7.5，例如，7.5到8、或7.8。
[0130]
在某些实施例中，调配物可以含有不包括碳酸氢钠的缓冲盐水溶液。此类调配物可以含有缓冲盐水溶液，所述缓冲盐水溶液包括水中的磷酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁以及其混合物中的一种或多种，如哈佛缓冲液(harvard's buffer)。水溶液可以进一步含有p188，即可从basf商购获得的泊洛沙姆，其先前以商品名f68出售。水性溶液的ph可以为7.2。
[0131]
在另一个实施例中，调配物可以含有缓冲盐水溶液，所述缓冲盐水溶液包括1mm磷酸钠(na3po4)、150mm氯化钠(nacl)、3mm氯化钾(kcl)、1.4mm氯化钙(cacl2)、0.8mm氯化镁(mgcl2)和ph为7.2的0.001％泊洛沙姆(例如，)188。参见例如harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html。在某些实施例中，哈佛缓冲液是优选的，因为在使用哈佛缓冲液的情况下观察到更好的ph稳定性。
[0132]
在某些实施例中，调配物缓冲液是具有pluronic f68的人工csf。在其它实施例中，调配物可以含有一种或多种渗透增强剂。合适的渗透增强剂的实例可以包含例如甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或edta。
[0133]
任选地，本发明的组合物除raav和一种或多种载剂之外还可以含有其它常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。适合的示例性防腐剂包含氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚以及对氯苯酚。适合的化学稳
定剂包含明胶和白蛋白。
[0134]
根据本发明的组合物可以包括药学上可接受的载剂，如上文所定义的。合适地，本文所描述的组合物包括有效量的一种或多种aav，所述一种或多种aav悬浮于药学上合适的载剂中和/或与合适的赋形剂混合，所述合适的赋形剂被设计成通过注射、渗透泵、鞘内导管递送到受试者或通过另一种装置或途径递送。在一个实例中，组合物被调配用于鞘内递送。在一个实例中，组合物被调配用于静脉内(iv)递送。
[0135]
vi.用途
[0136]
本文提供了一种治疗cdd的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所描述的raav或载体。
[0137]
在某些实施例中，本文的“有效量”是实现cdd症状改善和/或cdd进展延迟的量。
[0138]
以足够的量施用载体以转染细胞并提供足够水平的基因转移和表达，以便提供治疗益处，而不会产生过度的副作用或具有医学上可接受的生理作用，这可以由医学领域的技术人员确定。常规和药学上可接受的施用途径包含但不限于直接递送到所期望的器官(例如，脑、csf、肝(任选地通过肝动脉)、肺、心脏、眼睛、肾)、口服、吸入、鼻内、鞘内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、实质内、脑室内、鞘内、icm、腰椎穿刺和其它肠胃外施用途径。如果需要，可以组合施用途径。
[0139]
病毒载体(例如，raav)的剂量将主要取决于如所治疗的病状、患者的年龄、体重和健康状况等因素，并且因此在患者之间可能有所不同。例如，病毒载体的治疗有效人剂量通常在约25到约1000微升到约100ml溶液范围内，所述溶液含有的浓度为约1
×
109个到1
×
10
16
个载体基因组拷贝。在某些实施例中，递送体积为约1ml到约15ml、或约2.5ml到约10ml或约5ml的悬浮液。在某些实施例中，递送体积为约1ml、约2ml、约3ml、约4ml、约5ml、约6ml、约7ml、约8ml、约9ml、约10ml、约11ml、约12ml、约13ml、约14ml或约15ml的悬浮液。在某些实施例中，以此体积施用总计约8.9
×
10
12
到2.7
×
10
14
gc的剂量。在某些实施例中，以此体积施用约1.1
×
10
10
gc/g脑质量到约3.3
×
10
11
gc/g脑质量的剂量。在某些实施例中，以此体积施用以下剂量：约3.0
×
109、约4.0
×
109、约5.0
×
109、约6.0
×
109、约7.0
×
109、约8.0
×
109、约9.0
×
109、约1.0
×
10
10
、约1.1
×
10
10
、约1.5
×
10
10
、约2.0
×
10
10
、约2.5
×
10
10
、约3.0
×
10
10
、约3.3
×
10
10
、约3.5
×
10
10
、约4.0
×
10
10
、约4.5
×
10
10
、约5.0
×
10
10
、约5.5
×
10
10
、约6.0
×
10
10
、约6.5
×
10
10
、约7.0
×
10
10
、约7.5
×
10
10
、约8.0
×
10
10
、约8.5
×
10
10
、约9.0
×
10
10
、约9.5
×
10
10
、约1.0
×
10
11
、约1.1
×
10
11
、约1.5
×
10
11
、约2.0
×
10
11
、约2.5
×
10
11
、约3.0
×
10
11
、约3.3
×
10
11
、约3.5
×
10
11
、约4.0
×
10
11
、约4.5
×
10
11
、约5.0
×
10
11
、约5.5
×
10
11
、约6.0
×
10
11
、约6.5
×
10
11
、约7.0
×
10
11
、约7.5
×
10
11
、约8.0
×
10
11
、约8.5
×
10
11
、约9.0
×
10
11
gc每脑质量。
[0140]
调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。可以监测转基因产物的表达水平以确定所得病毒载体的剂量频率，优选地含有迷你基因的aav载体。任选地，与出于治疗目的描述的剂量方案类似的剂量方案可以用于使用本发明的组合物进行免疫。
[0141]
可以以剂量单位调配复制缺陷型病毒组合物，以使含有的复制缺陷型病毒的量在约1.0
×
109gc到约1.0
×
10
16
gc的范围内(以治疗受试者)，包含所述范围内的所有整数或分数量，并且对于人类患者而言，优选地为1.0
×
10
12
gc到1.0
×
10
14
gc。在一个实施例中，将组
合物调配成每剂量含有至少1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109或9
×
109gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
或9
×
10
10
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
11
、2
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、8
×
10
11
或9
×
10
11
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
12
、2
×
10
12
、3
×
10
12
、4
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
或9
×
10
12
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
13
、2
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
或9
×
10
13
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
或9
×
10
14
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
或9
×
10
15
gc，包含所述范围内的所有整数或分数量。
[0142]
在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为1
×
10
10
到约1
×
10
15
gc每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，载体的有效量为约1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109或9
×
109gc每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
或9
×
10
10
gc每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
11
、2
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、8
×
10
11
或9
×
10
11
gc每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
12
、2
×
10
12
、3
×
10
12
、4
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
或9
×
10
12
gc每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
13
、2
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5
×
10
13
、6
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
或9
×
10
13
gc每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
或9
×
10
14
gc每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
或9
×
10
15
gc每kg体重，包含所述范围内的所有整数或分数量。
[0143]
在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为1
×
10
10
到约1
×
10
15
gc每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，载体的有效量为约1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109或9
×
109gc每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
10
、2
×
10
10
、3
×
10
10
、4
×
10
10
、5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
或9
×
10
10
gc每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
11
、2
×
10
11
、3
×
10
11
、4
×
10
11
、5
×
10
11
、6
×
10
11
、7
×
10
11
、8
×
10
11
或9
×
10
11
gc每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
12
、2
×
10
12
、3
×
10
12
、4
×
10
12
、5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
或9
×
10
12
gc每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
13
、2
×
10
13
、3
×
10
13
、4
×
10
13
、5×
10
13
、6
×
10
13
、7
×
10
13
、8
×
10
13
或9
×
10
13
gc每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
14
、2
×
10
14
、3
×
10
14
、4
×
10
14
、5
×
10
14
、6
×
10
14
、7
×
10
14
、8
×
10
14
或9
×
10
14
gc每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，载体的有效量为约1
×
10
15
、2
×
10
15
、3
×
10
15
、4
×
10
15
、5
×
10
15
、6
×
10
15
、7
×
10
15
、8
×
10
15
或9
×
10
15
gc每克(g)脑质量，包含所述范围内的所有整数或分数量。
[0144]
这些上述剂量可以以各种体积的载剂、赋形剂或缓冲剂调配物施用，范围为约25到约1000微升或更大的体积，包含所述范围内的所有数字，这取决于待治疗区域的大小、所使用的病毒效价、施用途径以及所述方法的所期望的效果。在一个实施例中，载剂、赋形剂或缓冲液的体积为至少约25μl。在一个实施例中，体积为约50μl。在另一个实施例中，体积为约75μl。在另一个实施例中，体积为约100μl。在另一个实施例中，体积为约125μl。在另一个实施例中，体积为约150μl。在另一个实施例中，体积为约175μl。在又另一个实施例中，体积为约200μl。在另一个实施例中，体积为约225μl。在又另一个实施例中，体积为约250μl。在又另一个实施例中，体积为约275μl。在又另一个实施例中，体积为约300μl。在又另一个实施例中，体积为约325μl。在另一个实施例中，体积为约350μl。在另一个实施例中，体积为约375μl。在另一个实施例中，体积为约400μl。在另一个实施例中，体积为约450μl。在另一个实施例中，体积为约500μl。在另一个实施例中，体积为约550μl。在另一个实施例中，体积为约600μl。在另一个实施例中，体积为约650μl。在另一个实施例中，体积为约700μl。在另一个实施例中，体积介于约700与约1000μl之间。
[0145]
在某些实施例中，剂量可以在约1
×
109gc/g脑质量到约1
×
10
12
gc/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约1
×
10
10
gc/g脑质量到约3
×
10
11
gc/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约1
×
10
10
gc/g脑质量到约2.5
×
10
11
gc/g脑质量的范围内。在某些实施例中，剂量可以在约5
×
10
10
gc/g脑质量的范围内。
[0146]
在一个实施例中，病毒构建体可以以至少约1
×
109gc到约1
×
10
15
或约1
×
10
11
到5
×
10
13
gc的剂量递送。可以由本领域的技术人员确定用于递送这些剂量和浓度的合适的体积。例如，可以选择约1μl到150ml的体积，其中对于成人而言，选择更大的体积。通常，对于新生婴儿，合适的体积为约0.5ml到约10ml，对于年龄较大的婴儿，可以选择约0.5ml到约15ml。对于幼儿，可以选择约0.5ml到约20ml的体积。对于儿童，可以选择至多约30ml的体积。对于青春期前的少年和青少年，可以选择最大约50ml的体积。在仍其它实施例中，患者可以接受鞘内施用的体积选择为约5ml到约15ml或约7.5ml到约10ml。可以确定其它合适的体积和剂量。可以调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且这种剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。
[0147]
可以根据所公开的方法将上文描述的重组载体递送到宿主细胞。可以将优选地悬浮于生理上相容的载剂中的raav施用于人或非人哺乳动物患者。在某些实施例中，为了施用于人类患者，将raav适当地悬浮于含有盐水、表面活性剂和生理上相容的盐或盐的混合物的水溶液中。合适地，将调配物调整到生理上可接受的ph，例如，在ph 6到9、或ph 6.5到7.5、ph 7.0到7.7或ph 7.2到7.8的范围内。由于脑脊液的ph为约7.28到约7.32，对于鞘内递送，可能期望在此范围内的ph；而对于静脉内递送，可能期望的ph为约6.8到约7.2。然而，可以选择最宽范围和这些子范围内的其它ph用于其它递送途径。
[0148]
如本文所使用的，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指通过注射到椎管中，更具体地注射到蛛网膜下腔中使得其到达脑脊液(csf)的药物施用途径。鞘内递送可以包含腰椎穿刺、心室内(包含脑室内(icv))、枕骨下/脑池内和/或c1-2穿刺。例如，可以通过腰椎穿刺引入材料以在整个蛛网膜下腔扩散。在另一个实例中，可以向小脑延髓池中注射。在某些实施例中，如本文所述的raav、载体或组合物通过鞘内施用而施用于有需要的受试者。在某些实施例中，鞘内施用如于2019年11月29日公布的美国专利公开第2018-0339065a1号中所述的那样进行，所述美国专利公开通过引用整体并入本文。
[0149]
如本文所使用的，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指药物直接进入到小脑延髓池(cisterna magna cerebellomedularis)的脑脊液中，更具体地是通过枕骨下穿刺或通过直接注射到小脑延髓池(cisterna magna)中或通过永久定位的管的施用途径。
[0150]
在某些实施例中，本文所描述的组合物的治疗在动物和/或人类患者中引起最小到轻度的drg感觉神经元的无症状退化，并且在感觉神经毒性和亚临床感觉神经元病变方面具有良好的耐受性。
[0151]
vii.用于将药物组合物递送到脑脊液中的设备和方法
[0152]
一方面，本文中提供的载体可以通过此部分中提供并在wo 2018/160582中描述的方法和/或装置鞘内施用，所述文献通过引用并入本文中。可替代地，可以选择其它装置和方法。在某些实施例中，方法包括通过脊柱针通过ct引导的枕骨下注射到患者的小脑延髓池中的步骤。如本文中所使用的，术语计算机断层摄影(ct)是指放射线照相术，其中通过计算机由沿着轴线制成的一系列平面横截面图像构建身体结构的三维图像。在某些实施例中，所述设备在2019年11月29日公布的美国专利公开第2018-0339065 a1号中进行了描述，所述美国专利公开通过引用整体并入本文。
[0153]
viii.cdd
[0154]
在本文中可互换使用的“患者”或“受试者”意指雄性或雌性哺乳动物，包含人、兽医或农场动物、家畜或宠物以及通常用于临床研究的动物。在一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是人类患者。在一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是男性或女性人类。在某些实施例中，这些方法和组合物的受试者被诊断为患有cdd和/或具有cdd的症状。
[0155]
所述方法和组合物可以用于治疗以下cdd阶段中的任何一个。在某些实施例中，患者约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月大，或约1岁、1.5岁、2岁、2.5岁、3岁、3.5岁、4岁、4.5岁、5岁、5.5岁、6岁、6.5岁、7岁、7.5岁、8岁、8.5岁、9岁、9.5岁、10岁、10.5岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16岁、17岁、18岁。在某些实施例中，患者为幼儿，例如，18个月大到3岁。在某些实施例中，患者为3岁到6岁、3岁到12岁、3岁到18岁、3岁到30岁。在某些实施例中，患者为18岁以上。
[0156]
cdd的症状包含通常在出生后前3个月内开始的癫痫发作，并且最早可能在出生后第一周出现。癫痫发作的类型随年龄而变化，并且可能遵循可预测的模式。最常见的类型是全身强直阵挛性癫痫发作，其涉及意识丧失、肌肉僵硬和抽搐；以异常肌肉收缩为特征的强直性癫痫发作；和癫痫性痉挛，其涉及短暂的肌肉抽搐发作。大多数患有cdkl5缺乏症的人每天都会发生癫痫发作，但这些人可能会有癫痫不发作的时期。cdkl5缺乏症中的癫痫发作通常对治疗具有抗性。
[0157]
患有cdkl5缺乏症的儿童的发育受损。大多数人有严重的智力残疾，并且很少或没
有言语能力。大运动技能的发育，如坐、站和走，被推迟或无法实现。约三分之一的受影响个体能够独立行走。精细运动技能(如用手指拿起小物体)也受到损害；约一半受影响个体有目的地使用他们的手。大多数患有这种病状的人都有视力问题(皮层视觉损伤)。
[0158]
cdkl5缺乏症的其它常见特征包含重复性手部动作(刻板症)，如拍手、舔手和吸手；磨牙(磨牙症)；睡眠中断；喂养困难；和胃肠问题，所述胃肠问题包含便秘和酸性胃内容物回流到食道(胃食管反流)。一些受影响个体有不规则呼吸的发作。一些患有cdkl5缺乏症的人的独特面部特征包含高而宽的前额、大而深陷的眼睛、鼻子与上唇(人中)之间轮廓分明的空间、丰满的嘴唇、宽间距的牙齿和较高的口腔顶部(腭)。也可能出现其它身体差异，如异常小的头部大小(小头畸形)、脊柱左右弯曲(脊柱侧弯)和锥形手指。
[0159]
如以上所描述的，除非另外指明，否则术语“增加”、“减少”、“降低”、“减轻”、“改善”、“延迟”或其任何语法变体或指示变化的任何类似术语意指与对应的参考(例如，未经治疗的对照或未患有cdd的处于正常状况的受试者)相比约5倍、约2倍、约1倍、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％的变化。
[0160]
在某些实施例中，患者接受控制与cdd相关的一些体征和症状的药物，所述体征和症状如癫痫发作、肌肉僵硬或呼吸、睡眠、胃肠道或心脏问题。
[0161]
在某些实施例中，利尿剂可以用于有需要的受试者的共疗法。使用的利尿剂可以是乙酰唑胺(丹木斯(diamox))或其它合适的利尿剂。在一些实施例中，利尿剂在基因疗法施用时施用。在一些实施例中，利尿剂在基因疗法施用前施用。在一些实施例中，利尿剂在注射体积为3ml的情况下施用。
[0162]
在某些实施例中，可以利用共疗法，所述共疗法包括联合施用cdkl5-同种型1、同种型2、同种型3和/或同种型4表达载体或其各种双向或三向组合。任选地，共疗法可以进一步包括施用另一种活性剂。在某些实施例中，共疗法可以包括酶替代疗法。
[0163]
任选地，可以对有需要的受试者使用免疫抑制共疗法。用于此类共疗法的免疫抑制剂包含但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢药、t细胞抑制剂、大环内酯类(例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物)以及细胞生长抑制剂，包含烷化剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、抗体或对免疫亲和素具有活性的药剂。免疫抑制剂可以包含氮芥(nitrogen mustard)、亚硝基脲(nitrosourea)、铂化合物、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、更生霉素(dactinomycin)、蒽环霉素(anthracycline)、丝裂霉素c(mitomycin c)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、il-2受体(cd25)或cd3定向抗体、抗il-2抗体、环孢素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、ifn-β、ifn-γ、阿片类或tnf-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在某些实施例中，可以在施用基因疗法之前或之后的第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天或更多天开始免疫抑制疗法。此类免疫抑制疗法可以涉及施用一种、两种或更多种药物(例如，糖皮质激素、强的松(prednelisone)、霉酚酸酯(mmf)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))。可以以相同的剂量或经过调整的剂量向有需要的受试者施用此类免疫抑制药物一次、两次或多次。此类疗法可以涉及在同一天内共施用两种或更多种药物(例如，强的松、霉酚酸酯(mmf)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))。可以在基因疗法施用之后以相同的剂量或经过调整的剂量继续使用这些药物中的一种或多种药物。根据需要，此类疗法可以持续约1周(7天)、约60天或更长时间。在某些实施例中，选择无他克莫司的方
案。
[0164]
词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被解释为是包含性而非排他性的。词语“由
…
组成(consist)”、“由
…
组成(consisting)”及其变体将被解释为是排他性而非包含性的。虽然说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的，但是在其它情况下，也意图使用“由
…
组成”或“基本上由
…
组成”的语言来解释和描述相关的实施例。
[0165]
术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并且包括rna或rna和蛋白质的产生。关于rna，术语“表达”或“翻译”尤其涉及肽或蛋白质的产生。表达可以是暂时的或可以是稳定的。
[0166]
应当注意，术语“一个/一种(a或an)”是指一种或多种，例如，“一种增强子”应被理解为表示一种或多种增强子。如此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换地使用。
[0167]
在整个说明书中，使用术语“e”后跟数值(n)来指代指数。应当理解，这里指的是
“×
10
n”。例如，“3e9”与3
×
109相同，并且“1e13”与1
×
10
13
相同。
[0168]
如上文所描述的，除非另有说明，否则术语“约”在用于修改数值时意指
±
10％的变化。
[0169]
除非在本说明书中另有定义，否则本文所使用的技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员和参照公开文本所通常理解的相同含义，这为本领域的技术人员提供了本技术中使用的许多术语的通用指南。
[0170]
ix.实例
[0171]
以下实例仅是说明性的，并且不旨在限制本发明。
[0172]
已经开发了几种cdd模型，并且可以选择用于评估治疗效果。以下这些模型对cdkl5表达无效：例如，外显子6中存在缺失(δ外显子6)的cdkl5-ko小鼠，wang等人,《美国国家科学院院刊》2012年12月,109(52)21516-21521；doi:10.1073/pnas.1216988110；外显子4中存在缺失(δ外显子4)的cdkl5-ko小鼠(参见amendola等人(2014)绘制cdkl5病症小鼠模型的病理表型(mapping pathological phenotypes in a mouse model of cdkl5 disorder).《公共科学图书馆-综合(plos one)》9(5):e91613.doi.org/10.1371/journal.pone.0091613(2014)；cdkl5(r59x敲入)模型(可从杰克逊实验室(jackson laboratory)获得；参见tang等人(2019),tang s等人改变的nmdar信号传导是cdkl5缺乏症的小鼠模型中自闭症样特征的基础(altered nmdar signaling underlies autistic-like features in mouse models of cdkl5 deficiency disorder).《自然通讯(nat commun.)》2019；10(1):2655.发布于2019年6月14日.doi:10.1038/s41467-019-10689-w；以及cdkl5(d471fs)模型(rodney samaco，德克萨斯州休斯顿的贝勒医学院(baylor college of medicine,houston,tx))。
[0173]
在此研究中，示出了在三种cdd小鼠模型(cdkl5-ko(外显子6)，cdkl5(r59x)、cdkl5(d471fs))的cns中恢复cdkl5表达显著改善疾病症状。开发了一种aav基因疗法载体，所述aav基因疗法载体包含aavhu68衣壳、具有人突触蛋白启动子的表达盒和工程化的人cdkl5转基因。当通过新生注射入侧脑室而向cdkl5敲除小鼠施用aav-cdkl5载体时，检测到在整个脑中高达50％的神经元中有强烈的表达。aav施用和人cdkl5表达耐受性良好。人
cdkl5主要定位于细胞质；蛋白质表达和激酶活性持续超过4个月。对经处理的cdkl5-ko小鼠队列进行了一系列神经行为测试，并且发现未处理的cdkl5-ko表型对野生型小鼠中观察到的行为结果有显著改善。然后，在两种不同的cdd小鼠模型中重复了相同的研究，这两种模型携带患者来源的移码突变(cdkl5(r59x)和cdkl5(d471fs)模型)而不是基因敲除。获得了非常类似的结果，从而重申了cdkl5基因疗法载体的治愈益处。
[0174]
cdkl5在人脑中表达为至少四种不同的同种型。针对三种替代性剪接同种型生成了类似的aav基因疗法载体，所述同种型均被发现在转导的小鼠脑中表达并展现出激酶活性。
[0175]
为了测试aav-cdkl5基因疗法载体在较大动物中的表达，用恒河猴进行了一项研究。通过经小脑延髓池注入脑脊液，能够实现载体以每个二倍体基因组0.1至1个载体拷贝分布于整个脑。在背根神经节(drg)中观察到高得多的载体转导。因此，用特异于人cdkl5序列的探针进行的原位杂交示出在drg神经元中丰富的表达，但在皮层灰质神经元中的表达要稀少得多。cdkl5施用和表达在所有六只恒河猴中通常耐受良好，持续60天，然而，注意到脊髓白质束的轻度轴突病变。
[0176]
总之，示出了cdkl5基因疗法为模型小鼠提供了持久的治疗益处，并且在非人类灵长类动物中耐受良好的有希望的证据。这种方法的进一步优化可能最终为受cdd影响的儿童提供一种临床干预的选择。
[0177]
实例1.材料和方法.
[0178]
质粒.在人脑1中表达的四种cdkl5(细胞周期蛋白依赖性激酶样5，uniprot id o76039)的氨基酸序列被反向翻译成dna序列。编码序列被进一步工程化，例如，通过考虑在人类基因组中发现的密码子频率、隐蔽的rna剪接位点和替代性阅读框。在人突触蛋白启动子的控制下将工程化序列克隆到aav表达质粒中2。编码序列之前是kozak序列，之后是wpre增强子盒(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)，sv40 poly a序列，并且由aav2反向末端重复序列(itr)框住。为了抑制在背根神经节(drg)中的表达，在一些实验中，上述质粒被修饰成在cdkl5编码序列之后和wpre序列之前直接含有mir183结合位点(agtgaattctaccagtgccata)(seq id no:11)的四个重复序列。aav cdkl5载体在宾夕法尼亚大学载体核心公司(university of pennsylvania vector core)产生，作为衣壳php.b3用于小鼠研究，或作为aav9hu684或aavrh91用于小鼠和非人类灵长类动物研究。
[0179]
小鼠研究.所有涉及小鼠的研究都得到宾夕法尼亚大学iacuc的批准。从杰克逊实验室获得cdkl5-ko小鼠(b6.129(fvb)-cdkl5tm1.1joez/j，品系#021967)，并且使杂合雌性ko小鼠与wt c57bl6雄性杂交，以获得以下同窝出生小鼠的基因型：雄性半合cdkl5-ko(也称为ko小鼠或小鼠)、雄性wt、雌性杂合cdkl5-ko和雌性wt。小鼠在18-21日龄时通过眶后注射接受总体积为100μl的aav cdkl5载体(剂量范围为1
×
10
11
gc至5
×
10
11
gc)或媒剂对照(无菌磷酸缓冲盐水)。可替代地，小鼠在出生当天进行脑室内注射，剂量为1
×
10
10
gc至5
×
10
10
gc，总体积为2μl。就基因型和注射产品而言，将小鼠混合饲养，每周至少称重和观察两次，并且当小鼠经受行为测试时，雄性小鼠年龄为11周或雌性小鼠年龄为14周。没有观察到与治疗相关的发病率。
[0180]
蛋白质印迹和组织染色.在安乐死后，将一个皮层半球快速冷冻，并且随后使用ripa缓冲液产生蛋白质裂解物。用针对人cdkl5(s957d，英国邓迪大学)、eb2(ab45767，
abcam)或eb2 phospo222(pab01032-p，covalab，英国)的抗体进行蛋白质印迹。将另一半大脑在福尔马林中固定过夜，包埋在石蜡中，并且对薄切片进行处理以用相同的cdkl5抗体进行免疫荧光染色。
[0181]
行为测试.小鼠每天进行一次测试。每天的测试时间、操作员和环境保持不变(60db白噪声背景和1000流明白炽灯间接照明)。每次测试前，使小鼠在它们的居住笼子里习惯30分钟。对于旷场测定，将具有最少量垫料的新笼子放置到红外光束阵列(medassociates公司(medassociates,inc.))中。在笼子中间添加一只小鼠，并且自动记录接下来30分钟内的光束阻断次数，所述光束阻断分为靠近地面的光束阻断(一般活动)和高于地面3英寸的光束阻断(直立活动)。对于高架零迷宫(ezm，stoelting公司(stoelting co.))，使用具有两个相对封闭象限和两个开放象限的高架圆形平台以允许不间断的探索。将单一小鼠放置在开放象限的中间，并视频记录运动，持续15分钟。对于y迷宫(stoelting公司)，使用呈y形的含有三个相同臂的封闭平台。将单一小鼠放置在离操作者最近的臂中，并且视频记录其运动，持续5分钟。对于埋珠测定，向新笼子填充3英寸的alphadri垫料(shepherd specialty papers)并轻轻压实。12个纯蓝色珠子在垫料上等距地间隔开，并且将单一小鼠放置在笼子的中间。30分钟后记录至少一半被垫料覆盖的珠子的数量。
[0182]
数据分析.使用graphpad prims软件绘制和分析数据。视频文件以20fps的mp4格式记录，并使用ethovision xt软件(版本14，诺达思信息技术公司(noldus information technology))进行分析。对于筑巢测定，将小鼠单独容纳在新笼子中过夜，所述新笼子供应有标准化的2
×
2英寸小巢(nestlet)方块(基于棉花)。24小时后，按照1-5的等级对巢的质量进行评分，并且对任何剩余的未接触过的小巢材料进行称重。
[0183]
非人类灵长类动物实验.所有涉及非人类灵长类动物的研究都得到宾夕法尼亚大学iacuc的批准，并且根据usda的规定进行。猕猴(恒河猴)物种的非人灵长类动物(nhp)从科文斯研究产品公司(covance research products,inc.)获得。根据基因疗法程序sop(gene therapy program sops)进行检疫和畜牧驯养。在aav载体施用前一个月和整个研究期间，定期监测体重、体温、呼吸率和心率，并获得血液和csf样品。将全血用于细胞计数和分类以及临床血液化学检查(clinical blood chemistry panel)。csf样品用于血细胞计数和分类以及总蛋白定量。为了通过穿刺小脑延髓池将aav载体递送到csf中，将麻醉的猕猴以侧卧位放置在手术台上，头部向前弯曲。使用无菌技术，将21-27号、1-1.5英寸quincke脊柱针(碧迪公司(becton dickinson))推进到枕骨下空间中，直到观察到csf流动。针将指向小脑延髓池的更宽的上间隙，以避免血液污染和潜在的脑干损伤。将使用荧光镜通过脊髓造影术验证针穿刺的正确放置。在给药前收集1ml csf用于基线分析。在csf收集后，将leur通路延伸导管连接到脊柱针，以促进1ml碘海醇(iohexol)(商品名：欧乃派克180mg/ml，通用电气医疗公司(general electric healthcare))造影剂的给药。在验证针头放置后，将含有测试制品的注射器(体积等于1ml加上注射器和接头死区的体积)连接到柔性接头并注射30
±
5秒。将针移除并且直接对穿刺部位施加压力。aavhu68.hsyn.cdkl5-1co和aavhu68.hsyn.cdkl5-1co载体以高达3
×
10
13
gc/nhp的剂量注射。在研究的第0、14、18、41天和最后一个研究日，对所有猕猴进行神经系统评估，以详细评估神经系统功能。简而言之，评估包含姿势和步态评估、颅神经评估、本体感觉评估和脊髓/神经反射。在研究第56天，对猕猴实施安乐死，并进行总尸体剖检和尸检。从每只猕猴中收获25个主要组织，一式两份，
用于快速冷冻或在福尔马林中固定。从快速冷冻组织中纯化dna或rna并且将其分别用于载体生物分布或转基因表达分析。对于载体生物分布，使用taqman qpcr测定来确定每dna总重量的基因组拷贝数(gc)，其中探针再次指向转基因盒的polya区和内标物。为了对转基因表达进行定量，总rna用于通过与polyt寡核苷酸进行第一链合成来产生cdna，然后使用对不与内源性恒河猴cdkl5序列交叉反应的转基因具有特异性的探针进行taqman qpcr。对于组织病理学分析，将猕猴组织包埋到石蜡中，并且将这些切片分别用h&e溶液或cdkl5抗体染色。将相同的脊髓切片与劳克坚牢蓝一起温育以对髓鞘进行染色。所有经染色的组织切片均由通过职业验证的兽医病理学家审查，并且异常发现由同行审查核实。
[0184]
参考文献：
[0185]
1.hector,r.d.等人人和小鼠cdkl5转录物同种型的表征(characterization of cdkl5 transcript isoforms in human and mouse).《公共科学图书馆：综合》11,e0157758,(2016)。
[0186]
2.thiel,g.、greengard、p.&sudhof、t.c.人突触蛋白i基因启动子组织特异性转录的表征(characterization of tissue-specific transcription by the human synapsin i gene promoter).《美国国家科学院院刊》88,3431-3435,(1991)。
[0187]
3.deverman,b.e.等人cre依赖性选择产生用于将基因广泛地转移到成人大脑的aav变体(cre-dependent selection yields aav variants for widespread gene transfer to the adult brain).《自然生物技术(nat biotechnol)》34,204-209,(2016)。
[0188]
4.hinderer,c.等人在非人灵长类动物和仔猪中高剂量静脉内施用表达人smn的腺相关病毒载体后的严重毒性(severe toxicity in nonhuman primates and piglets following high-dose intravenous administration of an adeno-associated virus vector expressing human smn).《人类基因疗法》29,285-298,(2018)。
[0189]
实例2.基因疗法aav载体
[0190]
itr之间的表达构建体包含人突触蛋白启动子(seq id no:23)、人cdkl5同种型1的工程化的编码序列(seq id no:22)、wpre表达增强子(seq id no:27)和sv40 poly a序列(seq id no:28)(图1a)。类似地，替代性表达构建体分别含有人cdkl5、同种型2(cdkl5-2gs或hcdkl5-2gs；seq id no:24)、3(cdkl5-3gs或hcdkl5-3gs；seq id no:25)或4(cdkl5-4gs或hcdkl5-4gs；seq id no:26)，而不是同种型1的工程化的编码序列。所有测试的质粒在小鼠脑中表达良好，示出磷酸化eb2能力的微小差异(cdkl5激酶活性的测量)。发现需要wpre增强子在小鼠脑中获得类似于野生型小鼠cdkl5表达的人cdkl5表达水平(图2)。cdkl5是完全活性的，如由所述cdkl5磷酸化其内源性靶eb2蛋白的能力来确定(图2)。通过ihc证实cdkl5的表达和定位。还通过将人突触蛋白与人泛素c启动子(ubc)(图1b)或鸡β肌动蛋白杂合启动子(图1c)交换，产生替代性表达构建体。通过cdkl5-ko小鼠的新生icv以3
×
10
10
gc的剂量施用aavrh91衣壳中的aav载体aavrh91.ubc.cdkl5-1co.mir183和aavrh91.cbh.cdkl5-1co.mir183，并且在p14处执行尸检。小鼠脑组织的蛋白质印迹分析证实了在用包括ubc启动子或cbh启动子的aav载体基因组转导后cdkl5的表达。在用aavrh91.ubc.cdkl5-1co.mir183和aavrh91.cbh.cdkl5-1co.mir183转导后，在小鼠脑中观察到cdkl5转基因的表达。在用aavrh91.ubc.cdkl5-1co.mir183转导后，在小鼠脑的海马中观察到每个细胞较高的cdkl5表达。而其中在用aavrh91.cbh.cdkl5-1co.mir183转导后，在
小鼠脑的海马中观察到每个细胞较低的cdkl5表达。在用aavrh91.ubc.cdkl5-1co.mir183转导后，在小鼠脑皮层中观察到每个细胞较高的cdkl5表达。在用aavrh91.cbh.cdkl5-1co.mir183转导后，在小鼠脑皮层中观察到每个细胞较低的cdkl5表达。此外，比较了施用aavrh91.ubc.cdkl5-1co.mir183(3
×
10
10
gc，新生icv)和aavhu68.hsyn.cdkl5-1co.mir183(2.5
×
10
10
gc)后cdkl5-ko小鼠脑中的cdkl5表达。按照规定施用aav后，在小鼠脑中观察到非常类似的表达模式。在用aavrh91.ubc.cdkl5-1co.mir183(aavrh91衣壳；泛素c启动子)或用aavhu68.hsyn.cdkl5-1co.mir183(aavhu68衣壳；突触蛋白启动子)转导后，在小鼠脑中观察到cdkl5表达。另外，在cdkl5-ko小鼠中检查了以1
×
10
10
gc、3
×
10
10
gc和6
×
10
10
gc的不同剂量的aavrh91.ubc.cdkl5-1co.mir183和aavrh91.cbh.cdkl5-1co.mir183的行为影响。
[0191]
aav.ubc.cdkl5-1co.mir183载体在小鼠中表现出类似于当cdkl5表达由hsyn驱动时的治疗效用。当与包括工程化的核酸序列的aav载体基因组一起使用时，aavrh91衣壳实现了与aavhu68的cdkl5表达相似的cdkl5表达。与hsyn启动子相比，用ubc启动子使小鼠脑中的cdkl5蛋白水平更高。
[0192]
实例3.cdd小鼠模型中cdkl5基因疗法的临床前治疗益处
[0193]
为了测试cdkl5基因疗法对cdkl5缺陷小鼠的治疗益处，通过眶后iv注射用5
×
10
11
gc(5e11 gc)aav9-php.b-hsyn-hcdkl5-1co.wpre载体对幼年cdkl5-ko(也称为ko小鼠或小鼠)和野生型(wt)同窝出生小鼠的队列进行治疗。所有治疗组继续以相同的速率增加，并且未观察到与治疗相关的死亡。在10周龄时，使小鼠经受一组行为测试。在高架零迷宫和旷场活动测试中，观察到治疗组的稳健且具有统计显著性的归一化。同一组在转棒仪和y迷宫测试中存在微小改善，而在热敏感性方面不存在改善。
[0194]
鉴于cdkl5对神经发育的重要性，想知道早期施用基因疗法是否可以改善小鼠的治疗结果。接下来，通过心室内(icv)注射用每只小鼠6
×
109gc至5
×
10
10
gc剂量范围内的aavhu68-hsyn-hcdkl5-1co.wpre载体治疗新生cdkl5-ko或wt同窝出生小鼠的队列。在指示的情况下，在10周龄或11至14周龄时进行行为测试。在所有组中的总体观察结果是，治疗耐受性良好，不存在治疗相关的死亡，并且观察到正常的体重增加(图9a和9b)和总体发育。在5
×
10
10
gc的剂量、2.5
×
1010gc的剂量和1
×
10
10
gc的剂量下，观察到cdkl5转基因在cdkl5-ko小鼠脑中的剂量依赖性表达。在10周龄时，ko小鼠表现出特征性后肢扣紧表型，这在经处理的ko小鼠中得到显著改善。通过后肢扣紧试验测量cdkl5基因疗法的治疗功效。在经处理的cdkl5-ko小鼠中观察到具有严重程度评分的剂量依赖性改善(图9c-9f)。同样地，在ko小鼠中发现的持续过度活动和饲养表型被归一化为野生型活动。在y迷宫测试(自发改变指数)中，经处理的ko小鼠的海马学习和记忆得到极大改善。cdkl5基因疗法的治疗功效进一步通过旷场活动测试来测量，所述旷场活动测试测量ko和aav处理的小鼠中过度活动的校正。观察到经处理的cdkl5-ko小鼠中过度活动的剂量依赖性消退(图11a-11f)。ko小鼠单独容纳在新笼子中过夜时不善于筑巢，并且不会撕毁所有的筑巢材料。经处理的ko小鼠以剂量依赖性方式大幅提高了小鼠的筑巢能力(图10a、10c、10e)。另外两种其它的神经行为测定(埋珠和y迷宫)表现出经处理的cdkl5-ko小鼠中表型改善的强烈趋势(图10b和10d)。eeg表型在初步合作研究中得到挽救，并且可能用作转化生物标志物。通过独立的实验队列另外地执行关键测定(后肢扣紧、步行活动)结果的验证。较大的队列大小(n＝18/组)导致更
稳固的统计学显著性。还利用替代性cdd小鼠模型(r59x、d471fs)执行关键测定(后肢扣紧、步行活动)结果的验证。总之，cdkl5基因疗法将功能性cdkl5蛋白递送至小鼠脑，并且在cdd雄性小鼠模型中对几种神经行为结果具有剂量依赖性治疗效果。
[0195]
完成行为测试之后，在小鼠约3个月大时采集脑。蛋白质印迹法显示了即使在aav施用后3个月，人cdkl5在cdkl5-ko脑中的强烈表达。最后，当对磷酸化的eb2蛋白进行印迹时，人cdkl5表现出稳健的激酶活性。
[0196]
还利用替代性cdd小鼠模型检测cdkl5基因疗法的结果。cdkl5(d471fs)携带导致过早终止密码子的患者点突变。与患者一样，在这些小鼠的脑中未发现cdkl5蛋白和高度降低的eb磷酸化水平。因此，cdkl5(d471fs)与先前使用的cdkl5-ko小鼠一样缺乏cdkl5蛋白，然而，由于小鼠模型的产生方法，遗传背景略有不同。新生幼鼠以与之前相同的浓度注射(5
×
10
10
gc，neoicv),并且在3个月后表现出稳健的hcdkl5蛋白表达和eb2磷酸化。使一小组试验队列经受行为测试。aav处理耐受性良好，并且未观察到发病率。在经处理的突变小鼠中，后肢扣紧被显著校正；同样地，在高架零迷宫试验中的突变体表型在经处理的突变体小鼠中被校正为野生型行为(位于开放区域中，开放区域进入次数)。在新笼子里，突变小鼠与排列在网格中玻璃珠子表现出较差的相互作用和掩埋行为，而野生型小鼠通常掩埋几乎所有的玻璃珠子。经处理的突变小鼠对野生型小鼠的行为表现出强烈校正。在5
×
10
10
gc/小鼠的较高剂量下，在处理组中的cdkl5-ko小鼠中观察到显著的改善。
[0197]
还利用替代性cdd小鼠模型检测cdkl5基因疗法的结果。cdkl5(r59x)携带引入过早终止密码子的患者点突变。与患者一样，在这些小鼠的脑中未发现cdkl5蛋白和高度降低的eb磷酸化水平。因此，cdkl5(r59x)与先前使用的cdkl5-ko小鼠一样缺乏cdkl5蛋白，然而，由于小鼠模型的产生方法，遗传背景略有不同。新生幼鼠以与之前相同的浓度注射(5
×
10
10
gc，neoicv),并且在3个月后表现出稳健的hcdkl5蛋白表达和eb2磷酸化。使一小组试验队列经受行为测试。aav处理耐受性良好，并且未观察到发病率。在经处理的突变小鼠中，后肢扣紧现象得到了显著校正。
[0198]
还在杂合雌性cdkl5-ko小鼠中利用替代性cdd小鼠模型检查cdkl5基因疗法的结果。此类模式反映了大多数cdd患者(cdd雌性)。总体评估显示，杂合雌性cdkl5-ko小鼠的神经行为表型要温和得多，发病较晚，因此更加难以对治疗结果做出可靠评估。然而，在高剂量(5
×
10
10
gc，新生icv)下后肢扣紧和步行活动的代表性数据表现出显著的改善(图14b和14c)。
[0199]
另外，在wt小鼠中检测到cdkl5基因疗法剂量递增。wt(c57bl6/j)小鼠通过新生icv以7.5
×
10
10
gc和1
×
10
11
gc(即先前最高使用剂量的1.5倍或2倍)注射。未观察到对体重、发育和存活率的明显影响。小鼠表现正常，并且未表现出后肢扣紧或活动变化。在病理学家对cns组织的审查中未观察到影响(图19a和19b)。
[0200]
实例4.实用人cdkl5同种型2-4
[0201]
已经表明，在人脑和小鼠脑中存在至少4种可检测的cdkl5 mrna剪接变体，但是尚未确定同种型2-4以稳定蛋白质的形式存在。同种型1占脑cdkl5的85％以上。
[0202]
对人cdkl4同种型2-4的编码序列进行了密码子工程化，并且将其克隆到与以前相同的aav载体中。将编码同种型1-4的aav9-php.b载体尾部iv注射到成年cdkl5-ko小鼠中，并且在2周后采集脑用于蛋白质印迹分析。发现所有四种同种型都稳健地表达并表现出预
期的凝胶迁移模式。选择产生与同种型1表达量非常类似的同种型2-4表达的工程化的序列用以随访。与同种型1相比，同种型2产生的eb2磷酸化水平略高，并且同种型3或4产生的eb2磷酸化水平略低。
[0203]
已经将三种替代性cdkl5同种型注射到新生cdkl5-ko小鼠中，以测试与同种型1的潜在治疗益处相比潜在治疗益处如何。图12示出了通过替代性cdkl5同种型(2、3和4)的处理对扣紧表型的显著校正。图8a至8d提供了针对表达同种型1、同种型2、同种型3或同种型4的aav.cdlk5载体构建体的cdkl5表达水平或活动。图8a示出了与注射了媒剂的野生型小鼠和注射了媒剂的敲除小鼠相比，注射了表达这些同种型中的每一种同种型的aav载体(5
×
10
10
gc，新生icv)的敲除小鼠的表达水平。图8b示出了如在注射了媒剂(pbs)的野生型小鼠、注射了媒剂的敲除小鼠或aav.cdkl5-1co中使用ps222eb2确定的cdkl5活性。图8c示出了如使用ps222eb2对图8a中所述组测定的cdkl5活性。图8d示出了图8b中所述组的cdkl5表达水平。
[0204]
总之，所有同种型都表达为蛋白质，并且具有相当的催化活性。当头对头进行测试(5
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10
10
gc，新生icv)时，用cdd小鼠模型中的同种型2、3或4的治疗结果与用同种型1的治疗结果相当。总的来说，用cdkl5同种型1进行cdkl5基因疗法对雄性cdd模型小鼠是一种有前景的且安全的方法，具有显著的治疗益处。
[0205]
实例5.hcdkl5基因疗法的毒性和安全性测试的初步nhp研究
[0206]
想研究包装在nhp中的aavhu68衣壳中的aav-hsyn-cdkl5-1co.wpre构建体的表达模式和安全特性。使用本文所描述的载体基因组和先前所描述的产生方法产生载体。参见例如wo 2018/160582，其通过引用并入本文中。经由小脑延髓池(icm)对一组六只恒河猴(年龄4-6岁)进行注射。在利用利尿剂乙酰唑胺预处理2天以减少csf产生之后，测试了不同的条件：
[0207]
a.剂量1
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gc，注射到1ml缓冲液中
[0208]
b.剂量1
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gc，注射到3ml或5ml缓冲液中
[0209]
c.剂量3
×
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gc，注射到3ml缓冲液中
[0210]
d.剂量1
×
10
14
gc，注射到1ml缓冲液中。
[0211]
简而言之，对于非人灵长类动物(nhp)研究，使用aavhu68-hsyn-cdkl5-1co-wpre载体执行hcdkl5基因疗法的毒性和安全性测试。在初步研究中，评估了三种不同的剂量：3
×
10
12
gc/动物、1
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10
13
gc/动物和3
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13
gc/动物。在初步研究中，选择了1
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gc/动物的剂量，并且评估了两种不同体积(3ml和5ml)的aav载体通过小脑延髓池递送到脑脊液(csf)。其它研究组使用1
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gc/动物和利尿剂(例如丹木斯牌乙酰唑胺)或3
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gc/动物(受试者)。
[0212]
另外，测试了2
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12
、1
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和3
×
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13
gc/受试者的剂量。利用cdkl5载体的处理耐受性良好，未观察到临床血液化学变化的体征。笼侧神经学检查的观察发现，与基线相比无变化。
[0213]
注射之后28天进行尸检，随后进行分子分析、组织学和病理学审查。总体而言，在cns外的主要器官中未发现主要转导差异(例如，肝脏的转导可能已经达到最大值)。在脊髓和drg中未观察到主要转导差异(保持非常高的转导率)，但是在脑组织中依赖于注射参数的显著变化变得明显。最高的转导增加见于皮层中。丹木斯导致通过脑的转导效率略有增
its role in neuronal microtubule dynamics)”.《欧洲食品安全局杂志(embo journal)》37(24)。
[0226]
8.munoz,i.m.等人(2018).“磷酸蛋白质组筛选鉴定cdkl5激酶的生理底物(phosphoproteomic screening identifies physiological substrates of the cdkl5 kinase)”.《欧洲食品安全局杂志》。
[0227]
本说明书中引用的所有文件通过引用并入本文中，如于2020年4月27日提交的美国临时专利申请第63/016,036号、于2020年10月13提交的美国临时专利申请第63/091,032号和于2020年11月4日提交的美国临时专利申请第63/109,608号。随此提交的标记为“20-9196pct_seqlisting_st25.txt”的序列表和其中的序列和文本通过引用并入。虽然已经参考特定实施例描述了本发明，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。