使用寡核苷酸检测混合物中的材料的制作方法

文档序号:33507337发布日期:2023-03-18 04:07阅读:150来源:国知局
使用寡核苷酸检测混合物中的材料的制作方法
使用寡核苷酸检测混合物中的材料
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年11月6日提交的并且名称为“使用寡核苷酸检测混合物中的材料(detecting materials in a mixture using oligonucleotides)”的美国临时专利申请第63/110,655号的权益,该美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
3.序列表
4.本专利申请包含已以ascii格式电子提交的序列表,该序列表据此全文以引用方式并入。创建于2021年10月15日的所述ascii副本命名为ip-2035-pct-sl.txt并且大小为1,077字节。


背景技术:

5.生物样本中存在的特定核酸序列的检测已被用作例如鉴定和分类微生物、诊断传染病、检测和表征遗传异常、鉴定与癌症相关联的遗传变化、研究对疾病的遗传易感性,以及测量对各种类型的治疗的反应的方法。用于检测生物样本中的特定核酸序列的常用技术是核酸测序。
6.核酸测序方法已从maxam和gilbert所使用的化学降解方法以及sanger所使用的链伸长方法得到了发展。现在使用了允许在单个流动池上并行处理数百万个或者甚至数十亿个核酸的若干种测序方法。一些平台包括基于珠粒的格式和微阵列格式,其中二氧化硅珠粒用探针进行官能化,这取决于此类格式在包括测序、基因分型或基因表达谱分析在内的应用中的应用。一些测序系统(无论是用于“边合成边测序”还是用于基因分型)利用包括多个承载用于测序操作的不同试剂的不同贮存器的基板。


技术实现要素:

7.本文提供的示例涉及使用寡核苷酸检测混合物中的材料。还公开了使用此类寡核苷酸的设备。
8.在一些示例中,本文提供了一种检测材料混合物中的材料的方法。该方法可以包括:提供材料;以及提供彼此具有不同序列的寡核苷酸。这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸可以在这些材料中的相应的一种材料内并且可以对应于该相应的一种材料。该方法可以包括获得这些材料中的至少两种材料彼此的混合物。该混合物可以包含对应于那些材料的寡核苷酸。该方法可以包括对该混合物中的这些寡核苷酸进行测序;以及使用那些寡核苷酸的序列检测对应于那些寡核苷酸的材料。
9.在一些示例中,这些材料包含用于测序的试剂。在一些示例中,这些材料分别提供在基板的贮存器中。
10.在一些示例中,这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸的序列包括:(i)对应于该混合物的索引和(ii)对应于该相应的材料的条形码。
11.在一些示例中,这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸的序列包括对应于该相应的材料的条形码,并且该方法还包括向这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸中添加对应于该混合物的
索引。在一些示例中,在获得该混合物之后添加该索引。
12.在一些示例中,使用第一测序系统获得该混合物。例如,该混合物可以包含来自该第一测序系统的废物。在一些示例中,使用不同于该第一测序系统的第二测序系统对该混合物中的这些寡核苷酸进行测序。在一些示例中,这些寡核苷酸的这些序列包括与该第二测序系统相容并且与该第一测序系统不相容的衔接子。
13.在一些示例中,对该混合物中的这些寡核苷酸进行测序包括在表面上扩增这些寡核苷酸以在表面上产生相应的扩增子簇。在一些示例中,检测这些材料包括将这些寡核苷酸的这些序列与所存储的序列进行比较。在一些示例中,检测这些材料包括对这些寡核苷酸的相应量进行定量并且将这些寡核苷酸的这些量与这些相应的材料的量相关联。在一些示例中,这些寡核苷酸包括单链dna、双链dna、rna、lna或修饰核苷酸的序列。
14.在一些示例中,其中这些材料中的每种材料独立地选自由以下组成的组:液体、半固体和固体。在一些示例中,该液体包括溶剂或试剂。在一些示例中,该固体包括处于液体中的干粉或粉末。在一些示例中,该半固体包括凝胶。
15.在一些示例中,本文提供了一种检测材料混合物中的材料的方法。该方法可以包括将至少两种材料彼此混合以获得混合物。不同的寡核苷酸可以彼此具有不同的序列,并且可以分别安置在这些材料中的不同材料内。这些寡核苷酸的这些序列可以用于检测该混合物中的这些材料。
16.在一些示例中,这些材料包含用于测序的试剂。在一些示例中,这些材料分别提供在基板的贮存器中。在一些示例中,这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸的序列包括以下中的一者或两者:(i)对应于该混合物的索引和(ii)对应于该相应的材料的条形码。
17.在一些示例中,使用第一测序系统获得该混合物。例如,该混合物可以包含来自该测序系统的废物。在一些示例中,使用不同于该第一测序系统的第二测序系统对该混合物中的这些寡核苷酸进行测序。在一些示例中,这些寡核苷酸的这些序列包括与该第二测序系统相容并且与该第一测序系统不相容的衔接子。
18.在一些示例中,通过将这些寡核苷酸的这些序列与所存储的序列进行比较来检测这些材料。在一些示例中,通过对这些寡核苷酸的相应量进行定量并且将这些寡核苷酸的这些量与这些相应的材料的量相关联来检测这些材料。在一些示例中,这些寡核苷酸包括单链dna、双链dna、rna、lna或修饰核苷酸的序列。
19.在一些示例中,这些材料中的每种材料独立地选自由以下组成的组:液体、半固体和固体。在一些示例中,该液体包括溶剂或试剂。在一些示例中,该固体包括处于液体中的干粉或粉末。在一些示例中,该半固体包括凝胶。
20.在本文的一些示例中,提供了一种设备。该设备可以包括基板,该基板包括多个贮存器。该设备可以包括多种材料,这些材料中的每种材料在这些贮存器中的相应的一个贮存器内。该设备可以包括多种寡核苷酸,该多种寡核苷酸彼此具有不同的序列,这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸在这些材料中的相应的一种材料内。
21.在一些示例中,这些材料包含用于测序的试剂。
22.在一些示例中,这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸的序列包括以下中的一者或两者:(i)对应于该混合物的索引和(ii)对应于该相应的材料的条形码。
23.在一些示例中,该设备用于测序系统以获得这些材料中的两种或更多种材料的混
合物。例如,该混合物可以包含来自该测序系统的废物。在一些示例中,这些寡核苷酸的这些序列包括与该测序系统不相容的衔接子。在一些示例中,这些寡核苷酸包括单链dna、双链dna、rna、lna或修饰核苷酸的序列。
24.在一些示例中,这些材料中的每种材料独立地选自由以下组成的组:液体、半固体和固体。在一些示例中,该液体包括溶剂或试剂。在一些示例中,该固体包括处于液体中的干粉或粉末。在一些示例中,该半固体包括凝胶。
25.应当理解,如本文所述的本公开的方面中的每个方面的任何相应特征/示例可以以任何适当的组合一起实施,并且来自这些方面中的任何一个或多个方面的任何特征/示例可以与如本文所述的其他方面的任何特征一起以任何适当的组合实施以实现如本文所述的益处。
附图说明
26.图1a至图1b示意性地展示了用于使用寡核苷酸检测混合物中的材料的处理流程中的示例性设备和操作。
27.图2a至图2d示意性地展示了用于如参考图1a至图1b描述的处理流程的示例性寡核苷酸。
28.图3示意性地展示了用于使用寡核苷酸检测混合物中的材料的处理流程中的示例性操作。
29.图4示意性地展示了用于使用寡核苷酸检测混合物中的材料的另一处理流程中的示例性操作。
30.图5示意性地展示了用于使用寡核苷酸检测混合物中的材料的处理流程中的另一示例性设备和操作。
31.图6a至图6c示意性地展示了用于使用寡核苷酸检测混合物中的液体的处理流程中的示例性测量结果。
具体实施方式
32.本文提供的示例涉及使用寡核苷酸检测混合物中的材料。还公开了使用此类寡核苷酸的设备。
33.本技术的技术涉及使用以少量混合到相应材料中的寡核苷酸,以用于定性或定量地确定混合物中的此类材料中的一种或多种材料的存在。寡核苷酸可以在任何合适的环境和任何合适的一种或多种材料,例如任何合适的液体、半固体或固体中实施。例示性地,本寡核苷酸可以用于鉴定可能的表观污染来源,例如,以检测任何材料(如试剂)是否有意或无意地混合到其他材料中。另外地或可替代地,本寡核苷酸可以用于例如通过一次或多次检测混合物中不同位置处的不同材料的量来对用于将两种或更多种材料混合在一起的方法的有效性进行定量。在各种示例中,这些材料的量可以表示为样本中的绝对量(例如,为浓度或体积),或者可以表示为样本中的相对量(例如,为摩尔比),或者可以定性地表示(例如,为存在或不存在)。在一些示例中,材料可以用于寡核苷酸测序过程中,在该测序过程中,一种材料被另一种材料污染可能不利地影响测序过程。
34.在一些示例中,可以分别将彼此具有不同序列的寡核苷酸混合到不同的材料中。
可以将这些材料中的两种或更多种材料混合在一起,并且因此混合物还可以包含混合到那些材料中的寡核苷酸。对寡核苷酸进行扩增,然后从该混合物的样本中测序。使用存在的寡核苷酸的序列,确定哪些材料混合在一起,以及样本中此类材料的绝对或相对量。例如,这些寡核苷酸的序列可以包括一个或多个鉴定子序列,该一个或多个鉴定子序列可以是任意但唯一的。例如,第一子序列(在本文中可以称为“条形码”)对于寡核苷酸被混合到的特定材料可以是唯一的,从而允许在检测到序列时鉴定该材料。第二子序列(在本文中可以称为“索引”)对于该材料的特定体积可以是唯一的,从而允许将不同样本(其可以包含彼此相同的材料,但来自那些材料的不同体积)汇集在一起以用于测序目的,同时允许鉴定那些样本中的材料来源于的特定体积。可以在获取混合物的样本之后添加第二子序列,并且例如,如果样本不汇集在一起,则可以省略第二子序列。寡核苷酸还可以包括用于扩增的衔接子。在将寡核苷酸混合到在第一测序过程中使用的试剂中的示例中,那些寡核苷酸的衔接子可以与可以在第一测序过程中使用的衔接子正交,使得寡核苷酸本身可以在第一测序过程中不被扩增或测序,而是在第二测序过程中扩增和测序,该第二测序过程可以与第一测序过程分开进行,并且可以在与第一测序过程不同的测序系统上进行。然而,应当理解,本技术不限于在测序试剂中使用,并且可以用于检测任何给定材料混合物中的任何数量的材料。
35.首先,将简要解释本文使用的一些术语。然后,将描述用于使用寡核苷酸检测混合物中的材料的一些示例性方法和相关联的设备。
36.术语
37.除非另有定义,否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包括”以及其他形式(如“包括(include/includes/included)”)的使用不是限制性的。术语“具有”以及其他形式(如“具有(have/has/had)”)的使用不是限制性的。如本说明书中所用,无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中,术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都将被解释为具有开放式含义。即,上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如,当在过程的上下文中使用时,术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤,但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时,术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分,但是也可包含额外特征或组分。
38.在本说明书通篇中使用的术语“基本上”、“大约”和“约”用于描述和说明小的波动,如由于处理中的变化所引起的小的波动。例如,它们可以指小于或等于
±
10%,如小于或等于
±
5%,如小于或等于
±
2%,如小于或等于
±
1%,如小于或等于
±
0.5%,如小于或等于
±
0.2%,如小于或等于
±
0.1%,如小于或等于
±
0.05%。
39.如本文所使用的,“杂交”旨在意指将第一多核苷酸与第二多核苷酸沿着那些聚合物的长度非共价缔合以形成双链“双链体”。例如,两个dna多核苷酸链可以通过互补碱基配对缔合。第一多核苷酸与第二多核苷酸之间的缔合的强度随着那些多核苷酸内的核苷酸序列之间的互补性而增加。多核苷酸之间的杂交强度可以通过熔融温度(tm)来表征,在该熔融温度下,50%的双链体彼此解离。
40.如本文所用,术语“核苷酸”旨在意指包含糖和至少一个磷酸酯基团的分子,并且在一些示例中还包含核碱基。缺乏核碱基的核苷酸可以被称为“无碱基”。核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、经修
饰的肽核苷酸、经修饰的磷酸糖主链核苷酸以及它们的混合物。核苷酸的示例包括腺苷单磷酸(amp)、腺苷二磷酸(adp)、腺苷三磷酸(atp)、胸苷单磷酸(tmp)、胸苷二磷酸(tdp)、胸苷三磷酸(ttp)、胞苷单磷酸(cmp)、胞苷二磷酸(cdp)、胞苷三磷酸(ctp)、鸟苷单磷酸(gmp)、鸟苷二磷酸(gdp)、鸟苷三磷酸(gtp)、尿苷单磷酸(ump)、尿苷二磷酸(udp)、尿苷三磷酸(utp)、脱氧腺苷单磷酸(damp)、脱氧腺苷二磷酸(dadp)、脱氧核苷三磷酸(datp)、脱氧胸苷单磷酸(dtmp)、脱氧胸苷二磷酸(dtdp)、脱氧胸苷三磷酸(dttp)、脱氧胞苷二磷酸(dcdp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷单磷酸(dgmp)、脱氧鸟苷二磷酸(dgdp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、脱氧尿苷单磷酸(dump)、脱氧尿苷二磷酸(dudp)和脱氧尿苷三磷酸(dutp)。
41.如本文所使用,术语“核苷酸”还旨在涵盖任何核苷酸类似物,与天然存在的核苷酸相比,该核苷酸类似物是包含经修饰的核碱基、糖和/或磷酸部分的核苷酸类型。示例性经修饰的核碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、15-卤代尿嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶、6-偶氮基胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫代腺嘌或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤代经取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂腺嘌呤、3-去氮杂鸟嘌呤、3-去氮杂腺嘌呤等。如本领域已知的,某些核苷酸类似物无法掺入多核苷酸中,例如如腺苷5'-磷酸硫酸酯等核苷酸类似物。核苷酸可以包含任何合适数量的磷酸酯,例如三个、四个、五个、六个或多于六个磷酸酯。
42.如本文所使用,术语“多核苷酸”是指包括彼此键合的核苷酸序列的分子。多核苷酸是聚合物的一个非限制性示例。多核苷酸的示例包括脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)以及它们的类似物。多核苷酸可以是核苷酸的单链序列(如rna或单链dna)、核苷酸的双链序列(如双链dna),或者可以包括核苷酸的单链和双链序列的混合物。双链dna(dsdna)包括基因组dna以及pcr和扩增产物。可以将单链dna(ssdna)转化为dsdna,反之亦然。多核苷酸可以包括非天然存在的dna,如对映体dna。多核苷酸中的核苷酸的精确序列可以是已知的或未知的。以下是多核苷酸的示例:基因或基因片段(例如,探针、引物、表达序列标签(est)或基因表达系列分析(sage)标签)、基因组dna、基因组dna片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核糖酶、cdna、重组多核苷酸、合成多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针、引物或上述任何一项的扩增的拷贝。
43.如本文所使用,“聚合酶”旨在意指具有通过将核苷酸聚合成多核苷酸来组装多核苷酸的活性位点的酶。聚合酶可以结合所引发的单链靶多核苷酸,并且可以相继地将核苷酸添加到生长的引物以形成具有与靶多核苷酸的序列互补的序列的“互补拷贝”多核苷酸。然后,另一种聚合酶或相同的聚合酶可以通过形成该互补拷贝多核苷酸的互补拷贝来形成靶核苷酸的拷贝。此类拷贝中的任一个拷贝在本文中可以称为“扩增子”。dna聚合酶可以与靶多核苷酸结合,并且然后沿靶多核苷酸向下移动,将核苷酸相继地添加到生长的多核苷酸链(生长的扩增子)的3'末端处的游离羟基基团。dna聚合酶可以从dna模板合成互补dna
分子,并且rna聚合酶可以从dna模板合成rna分子(转录)。聚合酶可以使用短rna或dna链(引物)以开始链生长。一些聚合酶可以置换位点上游的链,在该位点处这些聚合酶将碱基添加到链中。此类聚合酶可以被称为链置换,意指这些聚合酶具有从由聚合酶读取的模板链去除互补链的活性。具有链置换活性的示例性聚合酶包括但不限于bst(嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus))聚合酶的大片段、exo-klenow聚合酶或测序t7级exo-聚合酶。一些聚合酶使位于它们前面的链降解,有效地将该链用后面的生长链置换(5'核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有降解其后面的链的活性(3'核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶已经通过突变或其他方式修饰以减少或消除3'和/或5'核酸外切酶活性。
44.如本文所使用,术语“引物”是指核苷酸可以通过游离3'oh基团添加到的多核苷酸。引物长度可以是任何合适的数目的碱基长度并且可以包括天然和/或非天然核苷酸的任何合适的组合。靶多核苷酸可以包括与引物杂交(具有与引物互补的序列)的“衔接子”,并且可以通过向引物的游离3'oh基团添加核苷酸来扩增以便产生互补拷贝多核苷酸。引物可以偶联到基板。彼此“互补”的引物可以基本上沿着它们的整个长度彼此杂交,而彼此“正交”的引物基本上不彼此杂交,它们的扩增子也基本上不彼此杂交。
45.在一些示例中,引物是可从illumina公司(illumina,inc)商购获得的p5或p7引物。p5和p7引物是彼此正交的引物的非限制性示例。在一些示例中,p5和p7引物序列可以具有以下序列:
46.配对读段组:
47.p5:5'-aatgatacggcgaccaccgagauctacac-3'(seq id no:1)
48.p7:5'-caagcagaagacggcatacgag*at-3'(seq id no:2)
49.单个读段组:
50.p5:5'-aatgatacggcgaccaccga-3'(seq id no:3)
51.p7:5'-caagcagaagacggcatacga3'(seq id no:4)
52.其中g*是g或8-氧代鸟嘌呤。
53.在一些示例中,所连接的寡核苷酸(如引物或者p5或p7引物)在5'末端处包括连接子或间隔区。可以包括此类连接子或间隔区,以便允许化学或酶促裂解,或者赋予一些其他期望的特性,例如以实现与聚合物或固体载体的共价连接,或充当间隔区以将裂解位点定位成与固体载体相距最佳距离。在某些情况下,10个间隔区核苷酸可以定位于p5或p7引物与聚合物或固体载体的连接点之间。在一些示例中,使用polyt间隔区,但也可以使用其他核苷酸以及它们的组合。在一个示例中,间隔区是6t至10t间隔区。在一些示例中,连接子包括可裂解核苷酸,该可裂解核苷酸包含可化学裂解的官能团,如邻二醇或烯丙基t。
54.如本文所使用,术语“扩增子”当用于指多核苷酸时旨在意指拷贝该多核苷酸的产物,其中该产物具有与该多核苷酸的核苷酸序列的至少一部分基本上相同或基本上互补的核苷酸序列。“扩增(amplification)”和“扩增(amplifying)”是指制备多核苷酸的扩增子的过程。靶多核苷酸的第一扩增子可以为互补拷贝。另外的扩增子是在产生第一扩增子之后由靶多核苷酸或由第一扩增子形成的拷贝。后续的扩增子可以具有与靶多核苷酸基本上互补或与靶多核苷酸基本上相同的序列。应理解,多核苷酸的少量突变(例如,由于扩增伪影引起)可以在产生该多核苷酸的扩增子时发生。
55.如本文所使用,术语“基板”是指用作本文所述组合物的载体的材料。示例性基板
材料可以包括玻璃、二氧化硅、塑料、石英、金属、金属氧化物、有机硅酸盐(例如,多面体有机倍半硅氧烷(poss))、聚丙烯酸酯、氧化钽、互补金属氧化物半导体(cmos)或它们的组合。poss的示例可以是kehagias等人,《微电子工程(microelectronic engineering)》86(2009),第776至778页中所述的poss,该文献以全文引用的方式并入。在一些示例中,本技术中所使用的基板包括基于二氧化硅的基板,如玻璃、熔融二氧化硅或其他含二氧化硅的材料。在一些示例中,基板可以包括硅、氮化硅或硅酮氢化物。在一些示例中,本技术中所使用的基板包含塑料材料或组分,如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、尼龙、聚酯、聚碳酸酯和聚(甲基丙烯酸甲酯)。示例性塑料材料包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯和环状烯烃聚合物基板。在一些示例中,基板是或包括基于二氧化硅的材料或塑料材料或它们的组合。在特定示例中,基板具有至少一个包含玻璃或基于硅的聚合物的表面。在一些示例中,基板可以包括金属。在一些此类示例中,金属是金。在一些示例中,基板具有至少一个包含金属氧化物的表面。在一个示例中,该表面包含氧化钽或氧化锡。丙烯酰胺、烯酮或丙烯酸酯也可以用作基板材料或组分。其他基板材料可以包括但不限于砷化镓、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、树脂、聚合物和共聚物。在一些示例中,基板和/或基板表面可以是或包括石英。在一些其他示例中,基板和/或基板表面可以是或包括半导体,如gaas或ito。前述列表旨在说明但不限于本技术。基板可以包括单一材料或多种不同材料。基板可以是复合物或层合物。在一些示例中,基板包括有机硅酸盐材料。基板可以是平坦的、圆形的、球形的、棒状的或任何其他合适的形状。基板可以是刚性的或柔性的。在一些示例中,基板是珠粒或流动池。
56.在一些示例中,基板包括图案化表面。“图案化表面”是指在基板的暴露层中或该暴露层上的不同区域的布置。例如,这些区域中的一个或多个区域可以是存在一种或多种捕获引物的特征。这些特征可以由不存在捕获引物的间隙区域隔开。在一些示例中,该图案可以是呈行和列形式的特征部的x-y格式。在一些示例中,该图案可以是这些特征和/或间隙区域的重复布置。在一些示例中,该图案可以是这些特征和/或间隙区域的随机布置。在一些示例中,基板在表面中包括孔(凹陷)的阵列。这些孔可以由基本上竖直的侧壁提供。这些孔可以如本领域通常已知的那样使用多种技术来制造,该些技术包括但不限于光刻、压印技术、模制技术和微蚀刻技术。本领域的技术人员将会知道,所使用的技术将取决于阵列基板的组成和形状。
57.基板的图案化表面中的特征部可以包括玻璃、硅、塑料或其他合适的材料上的孔(例如,微孔或纳米孔)阵列中的具有图案化且共价连接的凝胶(如聚(n-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam))的孔。该过程产生用于测序的凝胶垫,该凝胶垫在具有大量循环的测序运行中可以是稳定的。聚合物与孔的共价连接可以有助于在多种用途期间以及在结构化基板的整个寿命期间将凝胶保持为结构化特征。然而,在许多示例中,凝胶无需共价连接到孔。例如,在一些条件下,未与结构化基板的任何部分共价连接的不含硅烷的丙烯酰胺(sfa)可以用作凝胶材料。
58.在特定示例中,结构化基板可以通过以下方式来制作:将合适的材料图案化为具有孔(例如,微孔或纳米孔),用凝胶材料(例如,pazam、sfa或其化学改性的变体,如sfa的叠氮化型式(azido-sfa))涂覆图案化材料,并且抛光已涂覆凝胶的材料的表面(例如通过化学抛光或机械抛光),从而将凝胶保留在孔中,而从结构化基板表面上位于孔之间的间隙区
域移除基本上所有凝胶或使这些间隙区域中的基本上所有凝胶失活。引物可以与凝胶材料连接。然后可以使包含多种靶多核苷酸(例如,片段化的人基因组或其部分)的溶液与已抛光的基板接触,使得单个靶多核苷酸将通过与凝胶材料连接的引物的相互作用接种到单个孔中;然而,由于不存在凝胶材料或该凝胶材料失活,靶多核苷酸将不占用间隙区域。靶多核苷酸的扩增可以被限制在孔中,因为间隙区域中不存在凝胶或凝胶失活可以抑制生长簇的向外迁移。该过程便于制造、可规模化,并且可利用常规的微米或纳米制造方法。
59.图案化基板可以包括例如蚀刻到载玻片或芯片中的孔。孔的蚀刻和几何形状的图案可以采取各种不同的形状和大小,并且此类特征可以彼此物理或功能分离。具有此类结构特征的特别有用的基板包括可以选择固体颗粒(如微球)的大小的图案化基板。具有这些特性的示例图案化基板是与珠粒阵列技术(加利福尼亚州圣地亚哥illumina公司(illumina,inc.,san diego,calif.))结合使用的蚀刻基板。
60.在一些示例中,基板形成流动池的至少一部分或位于流动池中或联接到流动池。流动池可以包括分成多个通道或多个扇区的流动室。用于制造可以用于本文所阐述的方法和组合物中的流动池的示例性流动池和基板包括但不限于可从illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥(san diego,ca))商购获得的流动池和基板。
61.如本文所使用,术语“多个”旨在意指两个或更多个不同成员的群体。多个可以在从小、中等、大到非常大的大小范围内变化。小多个的大小可以在例如几个成员到数十个成员的范围内变化。中等大小的多个可以例如在数十个成员到约100个成员或数百个成员的范围内变化。大多个可以例如在约数百个成员到约1000个成员、到数千个成员并且至多数万个成员的范围内变化。非常大的多个可以例如在数万个成员到约几十万个成员、百万、数百万个并且至多或大于数亿万个成员的范围内变化。因此,多个的大小可以在两个到远远超过一亿成员的范围内,以及如通过成员数量测量的,在上述示例范围之间且大于上述示例范围的所有大小。多个示例性多核苷酸包括例如约1
×
105个或更多个、5
×
105个或更多个、或1
×
106个或更多个不同的多核苷酸的群体。因此,该术语的定义旨在包括大于两个的所有整数值。可以例如通过样本中多核苷酸序列的理论多样性来设置多个的上限。
62.如本文所使用,术语“靶多核苷酸”旨在意指作为分析或动作的目标的多核苷酸。该分析或动作包括使多核苷酸经受扩增、测序和/或其他程序。靶多核苷酸可以包括除待分析的靶序列之外的核苷酸序列。例如,靶多核苷酸可以包括侧接待分析的靶多核苷酸序列的一个或多个衔接子,包括用作引物结合位点的衔接子。
63.术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。除非另外具体说明,否则不同的术语不旨在表示大小、序列或其他特性的任何特定差异。为了描述的清楚性,这些术语可以用于在描述包括若干多核苷酸物种的特定方法或组合物时将一种多核苷酸物种与另一种物种区分开来。
64.如本文所使用,术语“测序系统”是指被配置为确定多核苷酸序列的系统。多种测序系统是可商购获得的。例示性地,测序系统可以是或包括可从illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥)商购获得的iseq
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100测序系统。iseq
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100测序系统是台式系统,该台式系统使用包括储存不同测序试剂的贮存器的预填充筒执行边合成边测序。测序系统的其他非限制性示例包括可从illumina公司商购获得的cbot 2、novaseq 6000和miniseq系统,以及来自其他来源的测序系统。
65.如本文所使用,如“混合(mixing)”和“混合(mixed)”等术语旨在意指材料彼此组合的方式使得这些材料中的每种材料遍布于由此类组合产生的“混合物”中。任何合适数量的此类材料的分布在整个混合物中可以是均相的(即均匀分布),使得该混合物的任何给定部分可以包含与该混合物的任何其他给定部分基本上相同浓度的此类材料。另外地或可替代地,任何合适数量的此类材料的分布在整个混合物中是可以非均相的(即,不均匀地分布),使得该混合物的任何给定部分可以包含与该混合物的一个或多个其他给定部分不同浓度的此类材料。在给定混合物内,一种或多种材料可以是均相的,并且一种或多种材料可以是非均相的。给定混合物中的每种材料可以保持其自身的化学同一性(即,不与该混合物中的任何其他材料进行化学反应)。可替代地,给定混合物中的两种或更多种材料可以彼此进行化学反应以形成一种或多种新材料。
66.可以将任何合适类型的材料混合在一起以形成混合物,如液体、固体和/或半固体的任何合适的组合。混合物是均相的或非均相的程度可以取决于所混合的特定材料,例如基于每种材料在该混合物中的其他材料中的任何材料中可溶的程度(如果有的话)。例如,可混溶的液体可以混合以形成均相混合物,而不混溶的液体可以混合以形成非均相混合物,如包含分散在另一液体中的一种液体的液滴的乳液。另外地或可替代地,液体可以与固体混合,如微粒固体(具有尺寸为例如约1nm至约1mm,或约10nm至约100μm,或约100nm至约10μm的颗粒的固体)。当固体溶解在液体中时,所得混合物可以是均相的,而当固体悬浮在液体中并且在该液体中不溶解时(例如,在该液体内形成固体颗粒的胶体悬浮液),所得混合物可以是非均相的。液体的非限制性示例包括溶剂(如水或有机溶剂)和试剂(如可以与一种或多种其他化学或生物物种反应的化学或生物物种)。
67.另外地或可替代地,液体可以与半固体,如“凝胶”,例如包括三维交联结构(例如,交联聚合物、胶体颗粒的交联网络或纳米颗粒或纳米结构的交联网络)的材料混合,其中液体安置于该结构内。当凝胶溶解在液体中时,所得混合物可以是均相的,而当凝胶悬浮在液体中并且在该液体中不溶解时(例如,在该液体内形成凝胶颗粒的胶体悬浮液),所得混合物可以是非均相的。另外地或可替代地,固体可以与半固体(如凝胶)混合。当固体溶解在凝胶中时,然后所得混合物可以是均相的,而当固体悬浮在凝胶中并且不溶于该凝胶中时(例如,在该凝胶内形成固体颗粒的胶体悬浮液),然后所得混合物可以是非均相的。另外地或可替代地,可以将半固体(如凝胶)与另一半固体(如凝胶)混合。当凝胶可混溶时,例如,一种凝胶溶解在其他凝胶中,所得混合物可以是均相的,而当一种凝胶在其他凝胶中悬浮并且在凝胶中不溶解(例如,在其他凝胶内形成凝胶颗粒的悬浮液)时,所得混合物可以是非均相的。凝胶的非限制性示例包括水凝胶、有机凝胶和纳米复合材料水凝胶。
68.另外地或可替代地,固体可以与一种或多种其他固体混合在一起。可以混合在一起的固体的非限制性示例是干粉(例如,附聚或冻干介质,如微球)。这些固体中的每种固体均可以是可流动的,即能够以使得彼此可混合的方式流动。取决于固体彼此混合的方式和程度,固体的混合物可以是均相的或非均相的。固体的非限制性示例包括聚合物、玻璃、半导体、金属、盐和陶瓷。
69.另外地,寡核苷酸可以混合到任何合适的材料中,例如任何合适的液体、固体和/或半固体。例如,可以将寡核苷酸溶解到液体中,可以溶解到凝胶中,可以掺入到固体中,或者可以涂覆在微粒固体的外表面。因此,此类材料的任何组合的混合物也将包含混合到此
类材料中的寡核苷酸。因此,以如本文其他地方所描述的方式,可以对任何此类寡核苷酸进行扩增、测序并将此类寡核苷酸用于检测该寡核苷酸混合于的材料。
70.可以使用任何合适的使用任何合适的方法或混合器,例如使用对流、搅拌、搅动、湍流、扩散或层流混合来获得不同材料彼此的混合物。在一个非限制性示例中,材料可以在系统(如测序系统)的废物接收器中混合在一起,因为该系统使用那些材料并且然后在这种使用之后处置那些材料。
71.使用寡核苷酸检测混合物中的材料以及相关联的设备
72.如上所述并且如下文更详细地描述,本设备和方法可以用于检测材料混合物中的一种或多种材料。可以使用本主题检测的材料包括液体、半固体和固体的任何合适的组合。例如,图1a至图1b示意性地展示了用于使用寡核苷酸检测混合物中的材料的处理流程中的示例性设备和操作。图1a中所示的设备100可以包括基板110,该基板包括多个贮存器,例如贮存器121、122、123、124。在图1a所示的非限制性示例中,贮存器121、122、123、124可以包括设置在彼此共同的一体形成的基板110内的孔。然而,应当理解,贮存器121、122、123、124中的一个或多个贮存器和实际上所有贮存器121、122、123、124可以彼此物理分离,并且不必彼此形成于共同的基板中。例如,以如参考图5所描述的方式,贮存器可以彼此物理分离。
73.在图1a所示的非限制性示例中,设备100可以包括多种材料,例如液体1、液体2和液体3,但是应理解可以使用任何其他合适类型的材料。这些材料(例如液体)中的每种材料可以在这些贮存器中的相应的一个贮存器内。例如,液体1储存在贮存器121内,液体2储存在贮存器122内,并且液体3储存在贮存器123内。在一些示例中,液体1、液体2和液体3中的一种或多种液体包含用于测序的试剂。例示性地,液体1、液体2和液体3可以包含选自由以下组成的组的测序试剂:聚合酶、标记的核苷酸、洗涤缓冲液、裂解试剂和其他酶促试剂。例示性地,设备100可以用于测序系统以获得这些材料(例如液体)中的两种或更多种材料的混合物。例示性地,测序系统可以是或包括可从illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥)商购获得的iseq
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100测序系统。iseq
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100测序系统是台式系统,该台式系统使用包括以与图1a至图1b中所示的设备100类似的方式储存不同测序试剂的贮存器的预填充筒执行边合成边测序。然而,应当理解,设备100可以适用于与任何其他测序系统一起使用,如可从illumina公司商购获得的cbot 2、novaseq 6000或miniseq系统、来自其他来源的测序系统,以及实际上在其中使用一种或多种材料的生物、药物、化学、工程或其他技术领域中的任何其他系统。
74.如图1a所示,设备100可以包括彼此具有不同序列的多种寡核苷酸,这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸在这些材料中的相应的一种材料内。例如,具有第一序列的寡核苷酸s1可以在贮存器121中的液体1内,具有第二不同序列的寡核苷酸s2可以在贮存器122中的液体2内,并且具有第三仍不同序列的寡核苷酸s3可以在贮存器123中的液体3内。以如下文参考图2a至图2d更详细地描述的方式,寡核苷酸s1、s2和s3可以包括可以用于扩增这些寡核苷酸的衔接子,并且还可以包括可以用于使用此类寡核苷酸的扩增序列来分别检测液体1、液体2和液体3的独特序列。在一些示例中,可以修饰这些寡核苷酸中的一种或多种寡核苷酸以与其中提供的材料相容。例示性地,可以对用于包含核酸外切酶的液体中的寡核苷酸进行修饰,以在3'末端处包含硫代磷酸键,以抑制由核酸外切酶进行的降解。
75.在图1a所示的特定时间,贮存器124可以是空的。相比之下,在图1b所示的特定时
间,贮存器124可以以如图1b所示的方式储存液体1、液体2和液体3中的两种或更多种液体的混合物。在一些示例中,贮存器124可以用于收集来自使用液体1、液体2和/或液体3的过程(例如,测序过程)的废物,并且这种收集的结果可能包括这些材料中的每种材料中的一些。在其他示例中,液体1、液体2和/或液体3可以在贮存器124内混合在一起,并且该混合物用于过程(例如,测序过程)中。贮存器124内的混合物可以包含对应于那些材料的寡核苷酸,例如,可以包含s1、s2和/或s3。
76.可以获得这些材料中的至少两种材料彼此的混合物的样本,例如,图1b中所示的液体1、液体2、液体3的混合物的样本,并且此类样本类似地可以包含如非限制性的所示示例中的寡核苷酸s1、s2和s3。该样本可以具有任何适当的大小,例如,可以具有约1nl至约1ml的体积,或约10nl至约100μl的体积,或约100nl至约10μl的体积,或约100nl至约1μl的体积,或约10nl至约100nl的体积,或约1nl至约10nl的体积。可以对该混合物样本中的寡核苷酸进行测序,并且可以使用那些寡核苷酸的序列来检测与那些寡核苷酸相对应的材料。例如,混合物样本内的寡核苷酸可以以如参考图2a至图2d所描述的方式扩增,并且然后可以进行测序。寡核苷酸s1、s2、s3的所得的检测到的序列分别可以与已知包含已知浓度的那些寡核苷酸的材料121、122、123相关联。例如,检测电路系统可以包括计算机可读介质和被配置为使用存储在计算机可读介质中的信息和指令的处理器。所存储的信息可以包括(i)寡核苷酸序列,(ii)具有那些序列的寡核苷酸分别混合到的材料的鉴定,以及(iii)这些寡核苷酸被混合到那些材料中的浓度。这些指令可以使处理器:(i)将s1、s2和s3的检测到的序列与所存储的寡核苷酸序列进行比较,(ii)使用此类比较,确定所存储的寡核苷酸序列中的哪些寡核苷酸序列与检测到的寡核苷酸序列相对应,并且(iii)针对所存储的寡核苷酸序列中的每个被确定为与检测到的寡核苷酸序列相对应的寡核苷酸序列,使用所存储的信息来确定样本中存在哪些材料。因此,根据给定寡核苷酸的序列的存在,可以检测材料的存在。在此,寡核苷酸s1、s2和s3可以用于检测混合物内相应材料液体1、液体2和液体3的存在。
77.另外,根据给定寡核苷酸的序列的量,可以确定材料的绝对量或相对量。例如,如下文参考图6a所描述的标准曲线可以在使材料中特定序列的所鉴定的读段的量与该材料中的寡核苷酸的浓度相关的时间之前制备,并且该曲线的斜率和偏移可以存储在检测电路系统中。例如,可以使用“内部梯”为这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸产生并存储标准曲线,该“内部梯”也可以称为浓度梯。更具体地,可以制备不同的材料,这些材料中的每种材料包含多种寡核苷酸,这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸以不同的已知浓度处于这些材料中的每种材料中。例如,可以以这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸的指定浓度制备不同的材料,或者可以确定这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸的浓度,并且然后在暴露于污染或混合之前存储。用于产生标准曲线的浓度可以在例如约1pm至约1000pm、或约10pm至约1000pm、或约10pm至约100pm的范围内。
78.检测电路系统(例如,测序系统或其他类型的系统上的处理器)可以根据来自材料的样本的寡核苷酸的序列的所鉴定读段的量,使用此类标准曲线(存储在计算机可读介质内)计算该样本中的寡核苷酸的浓度,例如通过将该寡核苷酸的序列的所鉴定读段的量与该寡核苷酸的标准曲线中的所鉴定读段的量进行比较,并且鉴定与该标准曲线中的所鉴定读段的该量相对应的标准曲线中的寡核苷酸的浓度,该浓度对应于该样本中寡核苷酸的浓
度。然后可以使用样本中寡核苷酸的所确定的浓度和材料中寡核苷酸的已知浓度来计算该样本中材料的浓度。检测电路系统可以将样本中的材料的量表示为绝对量(例如,为浓度,或通过将该浓度乘以所分析的样本的量表示为体积),或者可以将样本中的材料的量表示为相对量(例如,为摩尔比,其可以通过将样本中一种材料的浓度除以样本中一种或多种其他材料的浓度来计算)。可以在例如体积为约0.1nl至500nl、约0.1nl至100nl、约0.1nl至10nl、约0.1nl至1nl的样本中以相对较低的体积和量检测材料。
79.图2a至图2d示意性地展示了用于如参考图1a至图1b描述的处理流程的示例性寡核苷酸。每种寡核苷酸可以包括对于寡核苷酸被混合到的特定材料唯一的子序列(在本文中可以称为“条形码”),从而允许在检测到序列时鉴定该材料。每种寡核苷酸还可以包括对该材料的特定体积唯一的子序列(在本文中可以称为“索引”),从而允许将不同样本(其可以包含彼此相同的材料,但来自那些材料的不同体积)汇集在一起以用于测序目的,同时允许鉴定那些样本中的材料来源于的特定体积。在所示示例中,寡核苷酸s1包括对应于相应液体1的条形码201、第一衔接子211和第二衔接子212。类似地,寡核苷酸s2包括对应于相应液体2的条形码202、第一衔接子211和第二衔接子212。类似地,寡核苷酸s3包括对应于相应液体3的条形码203、第一衔接子211和第二衔接子212。在一些示例中,寡核苷酸s1、s2和s3可以包括单链dna、双链dna、rna、lna或经修饰的核苷酸的序列。寡核苷酸s1、s2和s3可以包括彼此相同类型的核苷酸(例如,所有寡核苷酸可以包括dna、rna、lna或相同类型的经修饰的核苷酸),或者可以包括彼此不同类型的核苷酸。
80.第一衔接子211和第二衔接子212可以具有彼此相同的序列,并且可以在过程中用于扩增混合物样本中的寡核苷酸s1、s2和s3。然而,第一衔接子211和第二衔接子212可以与使用这些材料的测序系统不相容,并且因此可以抑制或防止寡核苷酸s1、s2和s3的扩增,但是与扩增和检测寡核苷酸s1、s2、s3的测序系统相容。也就是说,第一衔接子211和第二衔接子212可以与用于使用这些材料的测序系统的引物正交,并且可以与扩增和检测寡核苷酸s1、s2、s3的测序系统中使用的引物互补。在一个非限制性示例中,第一衔接子211和第二衔接子212是可从illumina公司商购获得的衔接子,并且可以使用标签化(tagmentation)过程添加到条形码201、202、203中,其中转座体用于将dna裂解成片段并将衔接子添加到片段化dna的两端。可替代地,可以制备或商业订购具有所期望的序列,例如包括条形码和衔接子的寡核苷酸。
81.条形码201、202和203可以彼此具有不同的序列,并且因此可以分别用于检测材料,例如液体1、液体2和液体3并将它们彼此区分开。因此,尽管寡核苷酸s1、s2和s3的序列的一些部分可以彼此相同(例如,第一衔接子211和第二衔接子212),但是寡核苷酸的序列可以被认为是彼此不同的,因为条形码201、202、203彼此不同。条形码201、202、203中使用的特定序列不必具有除了彼此不同之外的彼此任何特定关系,并且实际上可以是任意的。另外地,条形码201、202、203的长度可以包括任何合适数量的核苷酸并且不必彼此具有相同数量的核苷酸,例如,可以包括约1至约200个核苷酸,或约2至约150个核苷酸,或约5至约100个核苷酸,或约5至约50个核苷酸,或约10至约40个核苷酸,或约20至约30个核苷酸。应注意,条形码201、202、203中的核苷酸的数量越大,可以制备不同序列的不同数目越多,并且因此可以使用此类序列检测材料的不同数量越多。在一个非限制性、纯例示性示例中,条形码201、202、203是或包括phix的单链dna基因组(二十面体、无尾噬菌体)的不同片段。在
使用衔接子的示例中,可以产生phix片段,并且在标签化过程期间具有添加到其上的衔接子211、212。
82.另外地或可替代地,在一些示例中,寡核苷酸s1、s2、s3中的每种寡核苷酸的序列包括对应于混合物的索引。此类索引可以是有用的,例如,用于将获自不同样本的混合物汇集在一起,其中该索引对应于每个此类样本。在一些示例中,在将寡核苷酸添加到它们相应的材料中之前,索引可以包括在寡核苷酸s1、s2和s3内。可替代地,可以在获得混合物的样本之后将索引添加到寡核苷酸s1、s2和s3中。例如,图2b展示了可以用于将索引220添加到寡核苷酸s1、s2和s3中的扩增引物p1和p2。扩增引物p1包括:与测序系统中的第一表面引物互补的引物231,在该测序系统上对寡核苷酸s1、s2和s3进行测序;对应于混合物的索引序列220;以及与寡核苷酸s1、s2和s3的衔接子211互补的引物211'。扩增引物p2包括:与测序系统中的第二表面引物互补的引物232,在该测序系统上对寡核苷酸s1、s2和s3进行测序;对应于混合物的索引序列220;以及与寡核苷酸s1、s2和s3的衔接子212互补的引物212'。扩增引物p1和p2可以与包含寡核苷酸s1、s2和s3的混合物的样本混合,并且两者均用于将那些寡核苷酸中的每种寡核苷酸扩增到可以容易测序的浓度(例如,使用聚合酶链反应),并且在所得扩增子中的每个扩增子内提供索引序列220。
83.例如,以如图2c所示的方式,扩增引物p1的引物211'可以与寡核苷酸s1、s2、s3的衔接子211杂交,扩增引物p2的引物212'可以与该寡核苷酸的衔接子212杂交。然后可以执行扩增过程,该扩增过程延伸寡核苷酸s1以包括索引220的补体的两个示例以及引物231和引物232的补体;并且延伸扩增引物p1和p2,以便彼此相交并且形成包括条形码201的补体的连续寡核苷酸。然后可以进一步扩增所得寡核苷酸中的每种寡核苷酸(例如,使用聚合酶链反应)。此类过程可以针对寡核苷酸s2和s3同时发生,从而产生混合物中这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸的扩增子。例如,图2d展示了寡核苷酸s1的扩增子as1、寡核苷酸s2的扩增子as2和寡核苷酸s3的扩增子as3。可以选择寡核苷酸s1、s2和s3以便以与彼此大致相同的速率扩增,并且因此可以预期扩增子的浓度与寡核苷酸s1、s2和s3的浓度成比例。在一些示例中,引物231和232可以与测序系统中的对应表面引物杂交,并且用于进一步扩增表面处的扩增子以形成可以例如使用边合成边测序合适测序的簇。
84.当对扩增子as1、as2和as3进行测序时,序列可以包括:分别对应于材料(例如如液体1、液体2和液体3)的寡核苷酸s1、s2和s3的相应条形码201、202和203,在这些材料中已经提供了那些寡核苷酸;以及对应于包含那些寡核苷酸的混合物的索引220。不同的索引可以独立于那些混合物中的寡核苷酸中的任何寡核苷酸是否来自彼此相同的材料而包括在从其他混合物获得的寡核苷酸中。因此,当对那些寡核苷酸的所得扩增子进行测序时,序列可以包括分别对应于其中已经提供有那些寡核苷酸的材料的相应条形码以及对应于包含那些寡核苷酸的混合物的索引。如果需要,可以将来自不同混合物的扩增子汇集在一起并且在共同过程中一起测序,并且每个此类扩增子的序列可以用于鉴定已经添加了对应寡核苷酸的材料(使用条形码)和包含那些寡核苷酸的材料的混合物(使用索引)。这种汇集可以避免运行单独(例如,顺序)测序过程的需要,并且允许全部在彼此相同的时间检测多种混合物中的材料。
85.应注意,索引不必例如以如参考图2b和图2c所描述的方式添加到来自混合物的寡核苷酸中。相反,可以使用省略索引220并且连接可以与测序系统中的表面引物杂交的引物
231和232的扩增引物p1和p2来扩增寡核苷酸,或者可以将寡核苷酸s1、s2和s3的引物211、212直接与测序系统中的表面引物杂交,使得寡核苷酸在该表面处扩增。
86.应当理解,尽管图1a至图1b和图2a至图2c可以描述三种材料的混合物的使用,但是可以类似地处理任何合适数量的材料的混合物,以便使用在那些材料内提供的寡核苷酸的序列来检测此类混合物中的材料。还应了解,并非每种材料必须包含本寡核苷酸,并且不需要每种混合物包含包括本寡核苷酸的材料中的多种或(甚至一种)材料。例如,这些材料中的一种或多种材料可以包含本寡核苷酸,并且给定混合物可以包含或可以不包含该材料,并且因此可以包含或可以不包含对应的寡核苷酸。根据混合物中不存在寡核苷酸,可以确定对应的材料基本上不存在于混合物中。
87.还应了解,给定材料的浓度在整个混合物体积中可能不一定是均匀的。如本文所提供的,寡核苷酸的序列可以用于确定混合物体积内的任何给定子体积处给定材料的量或浓度。例如,图5示意性地展示了用于使用寡核苷酸检测混合物中的材料的处理流程中的另一示例性设备和操作。图5中所示的设备500包括在其中储存具有第一寡核苷酸s1的材料1的第一材料贮存器521、在其中储存具有第二寡核苷酸s2的材料2的第二材料贮存器522和通过导管531接收来自第一贮存器521的材料1和通过导管532接收来自第二贮存器522的材料2的第三材料贮存器533。第三贮存器523可以通过任何合适的结构从任何合适数量的贮存器接收任何合适数量的材料,并且任何合适数量的此类材料可以包含相应的寡核苷酸。材料1和材料2可以使用任何合适的方法或混合器,例如使用对流、搅拌、搅动、湍流、扩散或层流混合在第三贮存器523内彼此混合。通过此类混合,材料1和材料2可以分布在整个第三贮存器523中,并且因此寡核苷酸s1和s2可以分布在整个第三贮存器523中。
88.然而,第三贮存器523内的材料1和材料2的混合物可能不一定在所有时间(或实际上在任何时间)是均相的,并且第三贮存器523内不同体积处的s1和s2的量可以相应地变化。实际上,在任何给定时间,混合物内的两个给定体积中材料1与材料2的相对比例(例如,摩尔比)可以不同于该混合物中的另一给定体积处的相对比例。类似地,在两个不同的给定时间,即使在混合物内的相同体积处,材料1与材料2的相对比例(例如,摩尔比)也可能在不同时间是不同的。为了评估材料1和材料2在特定时间在混合物的特定子体积处混合在一起的程度,可以在该时间从该子体积获得样本。例如,可以获得与图5中表示为a、b、c和d的子体积相对应的样本。可以在任何期望的时间,例如在彼此不同的时间或在彼此相同的时间获得样本。例示性地,样本可以包括分别安置在合适的采样装置(如移液管(未具体展示))被致动的位置处的预定义子体积。这些样本中的每个样本内的寡核苷酸可以以如参考图1a至图1b所描述的方式进行测序,并且那些寡核苷酸的量用于确定这些样本中的每个样本内材料1和材料2的量。
89.例如,可以使用所关注的设计或方法混合具有已知或确定量的寡核苷酸的材料的批量材料。预期在混合物样本中检测到的寡核苷酸的比率与该样本内的材料的比率成比例,从而提供分配或混合事件的定量测量。在同一运行和/或在不同运行中的不同样本中多次重复此类测量可以提供给定运行内或运行之间的方差的度量。因此,在设计或方法的开发中,本主题提供了一种复杂的测量工具以评估混合结果。例如,该测量工具可以用于示出哪些组分不以预期量存在于混合容器或反应容器的特定区域处,并且因此鉴定可以改进的设计或方法特征。在设计或方法的改变之后,可以重复测量,以便相对于先前迭代评估那些
改变的效果。在其他示例中,寡核苷酸可以用于确认洗涤方案或批次与批次之间的结转污染,或者设备是否用于不同的试剂或产品。
90.还应当理解,可以使用任何合适的操作顺序和次序来使用寡核苷酸检测混合物中的材料。例如,图3示意性地展示了用于使用寡核苷酸检测混合物中的材料的处理流程中的示例性操作。图3中所示的处理流程300可以包括提供材料(操作310)。例如,任何合适数量的材料可以以如参考图5所描述的方式提供在单独的贮存器中,或者可以以如参考图1a至图1b所描述的方式提供在设置在共同基板中的贮存器中。这些材料可以独立选自由以下组成的组:液体、半固体和固体。在一个非限制性示例中,这些材料中的至少一种材料包含用于测序过程的试剂。
91.图3中所示的处理流程300还可以包括提供彼此具有不同序列的寡核苷酸,这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸在这些材料中的相应的一种材料内并且对应于该相应的一种材料(操作320)。例如,这些材料中的每种材料可以包含已知浓度的寡核苷酸,该寡核苷酸的序列与包含在这些材料中的任何其他材料内的寡核苷酸的序列不同。应注意,并非每种材料必须需要包含此类寡核苷酸。以如参考图2a至图2d所描述的方式,这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸的序列可以包括对应于相应的材料的条形码。在一些示例中,对应于混合物的索引可以包括在这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸内或添加到这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸中。在一些示例中,寡核苷酸包括单链dna,但是应当理解,可以使用其他类型的寡核苷酸。
92.图3中所示的处理流程300还可以包括获得这些材料中的至少两种材料彼此的混合物,该混合物包含对应于那些材料的寡核苷酸(操作330)。在一些示例中,如参考图1a至图1b所描述的,可以使用第一测序系统获得混合物。混合物可以但不一定包含来自第一测序系统的废物。在其他示例中,如参考图5所描述的,混合物可以使用设置在接收来自其他贮存器的材料的贮存器内的混合器获得。
93.图3中所示的处理流程300还可以包括对混合物中的寡核苷酸进行测序(操作340)。对混合物中的寡核苷酸进行测序可以包括在表面上扩增寡核苷酸以在表面上产生相应的扩增子簇。例如,寡核苷酸可以以如参考图2a至图2d所描述的方式扩增,例如,以便添加索引和/或添加与用于对寡核苷酸进行测序的测序系统中的表面引物互补的引物。此类测序系统可以不同于使用流体本身的测序系统。在一些示例中,寡核苷酸的序列可以与用于对寡核苷酸进行测序的测序系统相容并且与其中使用流体本身的测序系统不相容的衔接子。
94.图3中所示的处理流程300还可以包括使用那些寡核苷酸的序列检测对应于那些寡核苷酸的材料(操作350)。例如,可以将寡核苷酸的序列与对应于在相应材料内提供的寡核苷酸的所存储的序列进行比较。在一些示例中,可以对寡核苷酸的相应量进行定量,并且例如使用如本文其他地方所描述的标准曲线将寡核苷酸的此类量与相应的材料的量相关联。
95.图4示意性地展示了用于使用寡核苷酸检测混合物中的材料的另一处理流程400中的示例性操作。图4中所示的处理流程400可以包括将至少两种材料彼此混合以获得混合物,彼此具有不同序列的不同寡核苷酸安置在这些材料中的不同材料内(操作410)。这些材料可以在任何合适的贮存器,如废物贮存器(例如,如参考图1a至图1b所描述的)或混合贮
存器(例如,如参考图5所描述的)中混合。在一些示例中,材料可以选自由以下组成的组:液体、半固体和固体。在一个非限制性示例中,材料包含用于测序的试剂和/或可以提供在包括多个贮存器的基板中,每种材料在这些贮存器中的相应一个贮存器内,例如,如参考图1a至图1b所描述,但是应当理解,可以使用任何合适类型的材料和贮存器的布置以及混合材料的方式。寡核苷酸可以包括单链dna,但是可以使用其他合适类型的寡核苷酸。在一个非限制性、纯例示性示例中,使用第一测序系统获得混合物。
96.图4中所示的处理流程400可以包括使用寡核苷酸的序列来检测混合物中的材料(操作420)。以如参考图2a至图2b所描述的方式,这些寡核苷酸中的每种寡核苷酸中的序列可以包括对应于混合物的索引和/或可以包括对应于相应的材料的条形码。以例如参考图1a至图1b描述的方式,可以通过将寡核苷酸的序列与所存储的序列进行比较来检测材料。另外,在一些示例中,通过对这些寡核苷酸的相应量进行定量并且将这些寡核苷酸的这些量与这些相应的材料的量相关联来检测这些材料。在一个非限制性、纯例示性示例中,使用不同于第一测序系统的第二测序系统对混合物中的寡核苷酸进行测序。在此类示例中,寡核苷酸的序列可以包括与第二测序系统相容并且与第一测序系统不相容的衔接子,以便抑制在第一测序系统上对寡核苷酸的测序。
97.工作实施例
98.在以下实施例中更详细地公开了另外的示例,这些实施例并非旨在以任何方式限制权利要求书的范围。
99.图6a至图6c示意性地展示了用于使用寡核苷酸检测混合物中的液体的处理流程中的示例性测量结果。更具体地,制备一组寡核苷酸,其中phix基因组的不同相应部分的26个碱基用作条形码,并且以如图2a所示的方式将nextera
tm
pcr标签化衔接子序列的34个碱基作为衔接子提供在每侧。使用上述内部梯方法制备图6a中所示的标准曲线,其中所鉴定的读段的百分比与寡核苷酸浓度相关联。
100.将这些寡核苷酸中的不同寡核苷酸混合到可从illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥)商购获得的iseq
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100测序系统的预填充筒内的每种液体中。使用iseq
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100测序系统来执行在其中使用不同液体的测序操作,并且收集来自那些操作的废物,并且多其中的寡核苷酸进行扩增,并且然后进行测序。使用寡核苷酸的序列和废物中的那些序列的量以及标准曲线(图6a)和不同液体中的那些序列的已知浓度来确定废物样本中不同液体的量。更具体地,原始溶液中的寡核苷酸的已知浓度用于理解它们在废物池内的相应稀释度。例如,如果进入废物的第一试剂和第二试剂内的寡核苷酸的相应浓度最初是相同的,并且在废物池的样本中,这些寡核苷酸中的第一寡核苷酸具有300个读段,并且另一寡核苷酸具有700个读段,则确定第一试剂占废物溶液的30%。使用废物的总体积,可以将此浓度转换为体积。
101.图6b展示了确定处于来自iseq
tm
100测序系统中的示例性过程的废物样本中的不同液体的体积,并且下表1列出了此类体积。应注意,一些液体(如hcx1、hcx2和hcx3)各自含有多种寡核苷酸。
102.表1
[0103][0104][0105]
从图6b和表1中,可以理解,本寡核苷酸可以用于以亚纳升精度确定若干种材料的混合物(例如,超过10种液体、或超过20种液体、或超过30种液体的混合物)中的每种材料的
相应体积(例如,以检测约0.1nl至500nl、约0.1nl至100nl、约0.1nl至10nl、约0.1nl至1nl的体积)。
[0106]
另外地,确定不同液体的混合比率。更具体地,图6c展示了从液体混合物的样本获得的液体hcx1、hcx2和hcx3的百分比。如图6c所示,三种液体的“理想”混合物包含31.48% hcx1、15.74% hcx2和31.48%hcx3,但确定样本包含29.03% hcx1、16.49% hcx2和33.18% hcx3。根据图6c,可以理解,本寡核苷酸可以用于确定混合物中每种材料提供的混合物的相对百分比,并且可以用于评估用于使三种材料的实际混合物更靠近所期望的过程的“理想”混合物的过程改进,例如通过增加或减少添加到该过程中的材料中的一种或多种材料的量。
[0107]
另外的注释
[0108]
应当理解,如本文所述的本公开的方面中的每个方面的任何相应特征/示例可以以任何适当的组合一起实施,并且来自这些方面中的任何一个或多个方面的任何特征/示例可以与如本文所述的其他方面的任何特征一起以任何适当的组合实施以实现如本文所述的益处。
[0109]
虽然上文描述了各种例示性示例,但是对于本领域技术人员显而易见的是,在不脱离本发明的情况下可以在其中进行各种更改和修改。所附权利要求书旨在涵盖落入本发明的真实精神和范围内的所有此类更改和修改。
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