用于生产外源蛋白的修饰的丝状真菌的制作方法

cov-2)是引起2019年冠状病毒疾病(covid-19)的正义单链rna冠状病毒。冠状病毒是人畜共患的，意味着它们在动物和人之间传播。冠状病毒感染的常见体征包括呼吸道症状、发热、咳嗽、呼吸急促和呼吸困难。在被covid-19感染的危重症患者的血浆中记录到高浓度的细胞因子。在更严重的情况下，感染可以导致肺炎、呼吸道炎症、严重急性呼吸综合征、肾功能衰竭和死亡。病毒蛋白的重组生产可用作潜在的疫苗。冠状病毒刺突蛋白被认为是疫苗开发的主要靶点。
11.对用于以高效和高成本效益的方式大规模生产可用于制药工业的蛋白质的表达系统，仍存在着需求。具体来说，对可以生产稳定的抗体以及用于疫苗接种的病毒抗原的改进和强劲的表达系统，存在着需求。


技术实现要素：

12.本发明提供了遗传修饰的子囊菌类丝状真菌，其具有蛋白酶kex2和/或alp7的降低的表达，能够生产大量高度稳定的蛋白质。
13.具体来说，本发明提供了作为示例性子囊菌类丝状真菌的thermothelomyces heterothallica菌株c1，其被遗传修饰以增强外源蛋白的生产。在某些实施方式中，本文公开的真菌被修饰，以缺陷包括kex2和alp7在内的14种蛋白酶。
14.令人吃惊的是，本发明显示，与以前公开的真菌菌株相比，作为子囊菌类丝状真菌的实例的th.heterothallica可以被遗传修饰，以显著提高由所述th.heterothallica细胞表达的外源蛋白的表达和稳定性。本发明显示，包括kex2或alp7在内的特定蛋白酶的缺失显著提高表达的蛋白质的稳定性。
15.进一步公开了kex2和alp7的组合缺失显著提高表达的外源蛋白的稳定性和量。
16.有利的是，本发明的遗传修饰的子囊菌类丝状真菌在某些实施方式中被设计成生产分泌的蛋白质，其具有分泌蛋白酶的降低的表达。将表达的蛋白质分泌在培养基中并防止蛋白质片段化，简化了纯化程序并提高蛋白质得率。
17.本发明的示例性th.heterothallica c1系统通过破坏所述真菌天然表达的蛋白酶的编码基因进行了工程化改造，用于生产感兴趣的蛋白质。出人意料的是，多达13或14种蛋白酶的缺失不扰乱真菌生长和增殖速率，而是至少维持甚至提高生长速率，使得能够进行外源蛋白的大规模生产。
18.由本发明的申请人开发的几种th.heterothallica c1菌株与常规酵母菌株以及大多数其他子囊菌类丝状真菌宿主相比，对作为碳源存在于生长培养基中的葡萄糖和和其他可发酵糖的反馈阻遏具有较低的敏感性，因此可以耐受更高的碳源补料速率，导致这种真菌的高产量生产。
19.此外，由本发明的申请人开发的一些th.heterothallica c1菌株与大多数其他子囊菌类丝状真菌菌种相比，可以在发酵罐中具有显著降低的培养基粘度的液体培养中生长。th.heterothallica c1的低粘度培养与酿酒酵母(s.cerevisiae)和其他酵母菌种的低粘度培养相当。所述低粘度可能归因于所述菌株从亲本菌株中长且高度交错的菌丝向发育的菌株中短且交错较少的菌丝的形态改变。低培养基粘度在大规模工业生产中非常有利。
20.根据一个方面，本发明提供了一种被遗传修饰以生产感兴趣的蛋白质的丝状真菌，所述遗传修饰的丝状真菌包含至少一个具有kex2和/或alp7降低的表达和/或蛋白酶活
性的细胞，所述至少一个细胞包含至少一个编码所述感兴趣的蛋白质的外源多核苷酸。
21.根据某些实施方式，所述alp7包含与thermothelomyces heterothallica alp7的氨基酸序列具有至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％或100％同一性的氨基酸序列。根据某些实施方式，所述thermothelomyces heterothallica alp7包含seq id no：13的氨基酸序列。
22.根据某些实施方式，所述kex2包含与thermothelomyces heterothallica kex2的氨基酸序列具有至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％或100％同一性的氨基酸序列。根据某些实施方式，所述thermothelomyces heterothallica kex2包含seq id no：14的氨基酸序列。
23.根据某些实施方式，所述修饰的丝状真菌包含至少一个具有kex2和alp7降低的表达和/或活性的细胞。
24.根据某些实施方式，所述修饰的丝状真菌包含至少一个具有至少一种另外的蛋白酶的降低的表达和/或活性的细胞。
25.根据某些实施方式，所述修饰的丝状真菌包含至少一个具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种蛋白酶的降低的表达和/或活性的细胞。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据某些实施方式，所述修饰的丝状真菌包含至少一个具有至少5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种蛋白酶的降低的表达和/或活性的细胞。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
26.根据某些实施方式，所述至少一种另外的蛋白酶选自alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6和alp4。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
27.根据某些实施方式，所述至少一种另外的蛋白酶选自alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6、alp4、alp5、alp6、srp3、srp5和srp8。
28.根据某些实施方式，所述至少一个细胞具有选自alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6、alp4、alp5、alp6、srp3、srp5、srp8和srp10的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种蛋白酶的降低的表达和/或活性。
29.根据某些实施方式，所述修饰的丝状真菌包含至少一个具有alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6、alp4和alp7的降低的表达和/或活性的细胞。根据某些实施方式，所述修饰的丝状真菌包含至少一个具有alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6、alp4和kex2的降低的表达和/或活性的细胞。根据某些实施方式，所述修饰的丝状真菌还包含至少一个具有alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6、alp4、alp7和kex2的降低的表达和/或活性的细胞。
30.根据某些实施方式，所述丝状真菌被进一步修饰以产生具有与人类、伴侣动物和其他哺乳动物蛋白相似的n-聚糖的蛋白。根据某些实施方式，所述丝状真菌包含alg3基因的缺失或破坏，使得所述真菌不能产生有功能的α-1,3-甘露糖基转移酶。根据某些其他或可选实施方式，所述丝状真菌包含alg11基因的缺失或破坏，使得所述真菌不能产生有功能的α-1,2-甘露糖基转移酶。根据又一些其他或可选实施方式，所述丝状真菌被修饰以过表达翻转酶。翻转酶的过表达可以通过过表达所述真菌的内源翻转酶或通过异源翻转酶的表达来获得。
31.根据某些其他或可选实施方式，所述丝状真菌还包含异源glcnac转移酶1(gnt1)
和glcnac转移酶2(gnt2)的表达。在某些实施方式中，所述gnt1包含异源高尔基体定位信号。
32.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质选自抗原、抗体、酶、疫苗和结构蛋白。
33.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质具有前导肽或信号肽。根据其他实施方式，所述感兴趣的蛋白质是细胞内蛋白。
34.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包括蛋白质或蛋白质片段的两个或更多个重复序列。
35.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质与标签融合。根据某些实施方式，所述标签是c-端或n-端标签。根据某些实施方式，所述标签选自几丁质结合蛋白(cbp)、麦芽糖结合蛋白(mbp)、strep标签、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、flag标签、spy标签、c标签、alfa标签、v5标签、myc标签、ha标签、spot标签、t7标签、ne标签和聚(his)标签。根据某些实施方式，所述标签spy标签。根据某些实施方式，所述标签是c标签。
36.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是抗体或其片段。根据某些实施方式，所述抗体是igg4或igg1。根据其他实施方式，所述抗体是双特异性或多特异性抗体。根据特定实施方式，所述抗体或其片段是针对冠状病毒的中和抗体。
37.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是anticalin。
38.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是fc-融合蛋白。
39.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是抗原。
40.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是感染原的组分。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是真菌、细菌或病毒的组分。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是病毒组分。
41.根据某些实施方式，所述病毒组分是流行性病毒的组分。根据某些示例性实施方式，所述病毒组分是冠状病毒、流感病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、乳头瘤病毒、hiv、htlv-1或ebv的组分。
42.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是流感病毒蛋白。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是血凝素(ha)或其片段。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含血凝素的跨膜结构域(tmd)。根据特定实施方式，所述感兴趣的蛋白质是流感亚型h1n1的蛋白质。
43.根据某些实施方式，所述产生的血凝素蛋白被分泌。
44.根据某些实施方式，所述病毒组分是冠状病毒的组分。根据某些当前示例性实施方式，所述冠状病毒是sars-cov-2(covid-19)。
45.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是刺突蛋白。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)序列或其片段。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含sars-cov-2刺突蛋白的rbd。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质由sars-cov-2刺突蛋白的rbd组成。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含sars-cov-2刺突蛋白的受体结合基序(rbm)。根据特定实施方式，所述rbd或其片段与spy标签融合。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含rbd或其片段的2、3或4个重复序列。根据其他实施方式，所述感兴趣的蛋白质是核衣壳。根据某些实施方式，所述感兴
趣的蛋白质是sars-cov-2刺突蛋白的s2片段。
46.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是与fc片段融合的病毒抗原。根据某些实施方式，所述fc融合到所述抗原的n端。根据其他实施方式，所述fc融合到所述抗原的c端。
47.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是fc-rbd。根据其他实施方式，所述感兴趣的蛋白质是rbd-fc。
48.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含选自seq id no：45、seq id no：47、seq id no：49、seq id no：51、seq id no：53、seq id no：55和seq id no：57的氨基酸序列。
49.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是胰岛素。根据其他实施方式，所述感兴趣的蛋白质是纤维蛋白原。
50.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是治疗性蛋白。
51.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是来自于裂谷热病毒(rvfv)的疫苗蛋白抗原。
52.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是由两种不同抗原组成的融合蛋白。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是由不同病毒抗原的两种组分组成的融合蛋白。根据某些实施方式，所述病毒抗原是冠状病毒和流感病毒的抗原。
53.根据某些实施方式，所述病毒抗原与mhcii靶向序列融合。根据某些实施方式，所述病毒抗原和所述mhcii靶向序列通过接头相连。
54.在某些实施方式中，所述标签是位点特异性荧光标记肽/蛋白。
55.根据某些实施方式，所述遗传修饰的子囊菌类丝状真菌以与在类似条件下培养的相应的未遗传修饰的亲本子囊菌类丝状真菌中产生的量相比增加的量产生外源蛋白。根据某些实施方式，所述遗传修饰的子囊菌类丝状真菌能够产生与其亲本菌株相比多至少2倍的外源蛋白。
56.根据某些实施方式，所述遗传修饰的子囊菌类丝状真菌与其亲本子囊菌类丝状真菌相比能够将生长培养基中分泌的外源蛋白的量提高至少1.5、2、5或10倍。根据某些实施方式，所述分泌的蛋白质是完整蛋白质。
57.根据某些实施方式，所述遗传修饰的子囊菌类丝状真菌与其亲本子囊菌类丝状真菌相比能够将真菌细胞中的细胞内外源蛋白的量提高至少1.5、2、5或10倍。
58.根据某些实施方式，由所述遗传修饰的子囊菌类丝状真菌产生的外源蛋白与由在类似条件下培养的亲本子囊菌类丝状真菌菌株产生的相应蛋白质相比具有提高的稳定性。
59.根据某些实施方式，所述遗传修饰的子囊菌类丝状真菌以与在类似条件下培养的相应的亲本子囊菌类丝状真菌菌株相比更高的速率生长。
60.编码所述感兴趣的蛋白质的多核苷酸可以形成dna构建体或表达载体的一部分。
61.根据某些实施方式，所述至少一种外源多核苷酸是dna构建体或表达载体，其还包含至少一个在所述子囊菌类丝状真菌中可操作的调控元件。根据某些实施方式，所述调控元件选自所述真菌内源的调控元件和与所述真菌异源的调控元件。
62.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌属于盘菌亚门(pezizomycotina)中的属。
63.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌属于选自thermothelomyces、毁丝霉属(myceliophthora)、木霉属(trichoderma)、曲霉属(aspergillus)、青霉属(penicillium)、rasamsonia、金孢霉属(chrysosporium)、棒囊壳属(corynascus)、镰刀菌属(fusarium)、脉孢菌属(neurospora)和篮状菌属(talaromyces)的属。
64.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌属于选自thermothelomyces heterothallica(也称为嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila))、黄毁丝霉(myceliophthora lutea)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、绳状曲霉(aspergillus funiculosus)、黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、里氏木霉(trichoderma reesei)、哈茨木霉(trichoderma harzianum)、长枝木霉(trichoderma longibrachiatum)、绿色木霉(trichoderma viride)、rasamsonia emersonii、产黄青霉(penicillium chrysogenum)、疣梗青霉(penicillium verrucosum)、嗜热侧孢霉(sporotrichum thermophile)、corynascus fumimontanus、嗜热棒囊壳(corynascus thermophilus)、chrysosporium lucknowense、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、fusarium venenatum、粗糙脉孢菌(neurospora crassa)和talaromyces piniphilus的菌种。
65.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌是thermothelomyces heterothallica菌株，其包含与seq id no：20中阐述的核酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或100％同一性的rdna序列。
66.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌是thermothelomyces heterothallica c1。
67.根据一个方面，本发明提供了一种用于产生能够生产感兴趣的蛋白质的真菌的方法，所述方法包括对所述真菌进行工程化改造，以具有kex2和/或alp7抑制或降低的表达和/或活性。
68.根据某些实施方式，所述方法包括用至少一种外源多核苷酸转化所述真菌的至少一个细胞。
69.根据另一方面，本发明提供了一种用于产生能够生产感兴趣的蛋白质的真菌的方法，所述方法包括用至少一种外源多核苷酸转化所述真菌的至少一个细胞，其中所述至少一个细胞具有kex2和/或alp7降低的表达和/或蛋白酶活性。
70.根据某些实施方式，所述方法包括用至少两种编码不同蛋白质的外源多核苷酸转化所述真菌的至少一个细胞。
71.根据某些实施方式，所述方法还包括对所述真菌进行工程化改造，以在所述至少一个细胞中具有选自alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6和alp4的至少一种蛋白酶降低或抑制的表达和/或活性。
72.根据某些实施方式，所述方法还包括对所述真菌进行工程化改造，以具有选自alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6和alp4的至少两种不同蛋白酶抑制或降低的表达和/或活性。
73.根据某些实施方式，抑制蛋白酶的表达包括缺失或破坏编码所述蛋白酶的内源基因。
74.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌属于盘菌亚门(pezizomycotina)中的
属。
75.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌属于选自thermothelomyces、毁丝霉属(myceliophthora)、木霉属(trichoderma)、曲霉属(aspergillus)、青霉属(penicillium)、rasamsonia、金孢霉属(chrysosporium)、棒囊壳属(corynascus)、镰刀菌属(fusarium)、脉孢菌属(neurospora)和篮状菌属(talaromyces)的属。
76.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌属于选自thermothelomyces heterothallica(或嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila))、黄毁丝霉(myceliophthora lutea)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、绳状曲霉(aspergillus funiculosus)、黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、里氏木霉(trichoderma reesei)、哈茨木霉(trichoderma harzianum)、长枝木霉(trichoderma longibrachiatum)、绿色木霉(trichoderma viride)、rasamsonia emersonii、产黄青霉(penicillium chrysogenum)、疣梗青霉(penicillium verrucosum)、嗜热侧孢霉(sporotrichum thermophile)、corynascus fumimontanus、嗜热棒囊壳(corynascus thermophilus)、chrysosporium lucknowense、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、fusarium venenatum、粗糙脉孢菌(neurospora crassa)和talaromyces piniphilus的菌种。
77.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌是thermothelomyces heterothallica菌株，其包含与seq id no：20中阐述的核酸序列具有至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或100％同一性的rdna序列。
78.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌是thermothelomyces heterothallica c1。
79.根据另一方面，本发明提供了一种生产至少一种感兴趣的蛋白质的方法，所述方法包括将本文中所述的遗传修饰的真菌在适合的培养基中培养；和回收所述至少一种蛋白质产物。
80.根据某些实施方式，所述回收步骤包括从生长培养基、真菌生物质或两者回收所述蛋白质。
81.根据某些实施方式，从生长培养基回收所述蛋白质。根据某些实施方式，至少50％、60％、70％、80％90％或95％的所述蛋白质被分泌。
82.根据某些实施方式，所述培养基包含选自葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、乳糖、纤维二糖、甘油及其任何组合的碳源。
83.根据某些实施方式，将所述遗传修饰的真菌在适合的培养基中培养以与在类似条件下培养的相应的未遗传修饰的亲本真菌菌株中产生的量相比增加的量提供所述感兴趣的蛋白质的生产。
84.根据某些实施方式，所述相应的亲本真菌是与所述遗传修饰的真菌相同的物种。根据某些实施方式，所述相应的亲本真菌与所述遗传修饰的真菌同基因。
85.根据另一方面，本发明提供了一种感兴趣的蛋白质，其通过本文描述的任何方法生产。
86.根据一个方面，本发明提供了一种感兴趣的蛋白质，其通过包括下述步骤的方法生产：将本文中描述的遗传修饰的真菌在适合的培养基中培养；和回收所述感兴趣的蛋白
质。
87.所述感兴趣的蛋白质如上文中所述。
88.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是冠状病毒抗原。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是冠状病毒刺突蛋白。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含冠状病毒rbd序列或其片段。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含冠状病毒刺突蛋白的受体结合基序(rbm)序列。
89.本发明还提供了一种组合物，其包含通过本文中描述的任何方法生产的两种或更多种不同的感兴趣的蛋白质。
90.根据某些实施方式，所述组合物包含至少两种不同的冠状病毒抗原，所述抗原包含不同冠状病毒变体的序列。
91.应该明确理解，本发明的范围涵盖同源物、类似物、变体和衍生物，包括更短或更长的多肽、蛋白质和多核苷酸，以及具有本领域中已知的一个或多个氨基酸或核酸替换的多肽、蛋白质和多核苷酸类似物，条件是这些变体和修饰必须保留本文描述的蛋白质或酶的活性。
92.应该理解，本文公开的每个方面和实施方式的任何组合被明确包含在本发明的公开中。
93.本发明的其他目的、特点和优点将从下面的描述和附图变得清楚。
附图说明
94.图1.示出了来自于产生rbd-c标签(左图)或rbd-spy标签-c标签(右图)的c1转化体的24孔板培养物的使用c标签检测的western印迹。
95.图2.在缺失了12-14种蛋白酶基因的c1蛋白酶缺陷菌株中rbd-c标签和rbd-spy标签-c标签的生产。在kex2缺失的dnl155和dnl159菌株中rbd蛋白产量最高。rbd-c标签和rbd-spy标签-c标签两者的三个平行克隆之一生长不佳，因此产生较低的蛋白质水平。
96.图3a-3b.从c1菌株m4169的生物反应器培养物c标签亲和纯化rbd-c标签。示出了来自于不同纯化步骤的样品的染色sds凝胶(图3a)和western(图3b)分析。起始＝澄清后的起始样品，在凝胶中1:5稀释；流动起始＝载样开始时的穿流液，在凝胶中1:5稀释；流动结束＝载样结束时的穿流液，在凝胶中1:5稀释；fr4-f9＝洗脱级分。注意，由于高mgcl2浓度，在透析之前洗脱样品的迁移不正常。
97.图4.c1谱系的示意描述。
98.图5.示出了在不同蛋白酶缺陷菌株中使用抗体的掺加实验。将c1蛋白酶缺陷菌株在24孔细胞培养板中培养4天。对于掺加实验来说，将抗体在培养上清液中温育。在不同时间(0h、3h、o/n和o/2n)从所述样品取样，并通过western印迹进行分析。将独立的抗体用于检测重链和轻链。每道中上样270ng mab。对照
–
200ng。
99.图6.示出了在不同的13x蛋白酶缺陷菌株中使用抗体的掺加实验。将c1蛋白酶缺陷菌株在24孔细胞培养板中培养4天。对于掺加实验来说，将抗体在培养上清液中温育。在不同时间(0h、3h、o/n和o/2n)从所述样品取样，并通过western印迹进行分析。将独立的抗体用于检测重链和轻链。每道中上样270ng mab。对照
–
200ng。
100.图7.示出了在不同的13x蛋白酶缺陷菌株中使用纤维蛋白原的掺加实验。将c1蛋
rbd的m4169 c1菌株(实施例4)。
111.发明详述
112.本发明提供了用于生产大量蛋白质的可选的高效系统。本发明的系统部分是基于以前已开发作为蛋白质以及次级代谢物生产的天然细胞工厂的丝状真菌thermothelomyces heterothallica c1及其特定菌株。这些菌株显示出高生长速率并同时保持低培养物粘度，因此非常适合于在高达100,000-150,000升或更大体积下在发酵培养中连续生长。本发明在某些实施方式中提供了具有降低的kex2和/或alp7表达和/或活性得遗传修饰的真菌。
113.定义
114.本文所定义的子囊菌类丝状真菌是指属于盘菌亚门(pezizomycotina)的任何真菌菌株。盘菌亚门(pezizomycotina)包括但不限于下述组：
115.粪壳菌目(sordariales)，其包括下述属：
116.thermothelomyces(包括heterothallica和thermophila种)，
117.毁丝霉属(myceliophthora)(包括黄毁丝霉种(lutea)和未命名的种)，
118.棒囊壳属(corynascus)(包括fumimontanus种)，
119.脉孢菌属(neurospora)(包括粗糙脉孢霉(crassa)种)；
120.肉座菌目(hypocreales)，包括下述属：
121.镰刀菌属(fusarium)(包括禾谷镰刀菌(graminearum)和venenatum种)，
122.木霉属(trichoderma)(包括里氏木霉(reesei)、哈茨木霉(harzianum)、长枝木霉(longibrachiatum)和绿色木霉(viride)种)；
123.爪甲团囊菌目(onygenales)，包括下述属：
124.金孢霉属(chrysosporium)(包括lucknowense种)；
125.散囊菌目(eurotiales)，包括下述属：
126.rasamsonia(包括emersonii种)，
127.青霉属(penicillium)(包括疣梗青霉(verrucosum)种)，
128.曲霉属(aspergillus)(包括绳状曲霉(funiculosus)、构巢曲霉(nidulans)、黑曲霉(nige)和米曲霉(oryzae)种)，
129.篮状菌属(talaromyces)(包括piniphilus种(以前的绳状青霉(penicilliumfuniculosum))。
130.应该理解，上述列表不是结论性的，并且旨在提供工业上相关的丝状子囊菌类真菌物种的不完整名单。
131.尽管可能存在盘菌亚门(pezizomycotina)之外的丝状子囊菌类物种，但该类不包含酵母菌亚门(saccharomycotina)，所述亚门含有大多数通常已知的工业上相关的非丝状属，例如酵母属(saccharomyces)、komagataella(包括以前的巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris))、克鲁维酵母属(kluyveromyces)，或外囊菌亚门(taphrinomycotina)，所述亚门含有一些其他通常已知的工业上相关的非丝状属，例如裂殖酵母属(schizosaccharomyces)。
132.上述所有分类学类别均根据专利申请之日的ncbi分类学浏览器(ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)来定义。
133.必须认识到，真菌分类学不断变化，分类群的命名和等级位置在将来可能变化。然而，本领域技术人员能够明确地确定特定真菌菌株是否属于上述定义的类别。
134.根据某些实施方式，所述丝状真菌属选自毁丝霉属(myceliophthora)、thermothelomyces、曲霉属(aspergillus)、青霉属(penicillium)、木霉属(trichoderma)、rasamsonia、金孢霉属(chrysosporium)、棒囊壳属(corynascus)、镰刀菌属(fusarium)、脉孢菌属(neurospora)、篮状菌属(talaromyces)等。根据某些实施方式，所述真菌选自嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、thermothelomyces thermophila(以前的嗜热毁丝霉(m.thermophila))、thermothelomyces heterothallica(以前的嗜热毁丝霉(m.thermophila)和异宗毁丝霉(heterothallica))、黄毁丝霉(myceliophthora lutea)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、绳状曲霉(aspergillus funiculosus)黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、产黄青霉(penicillium chrysogenum)、疣梗青霉(penicillium verrucosum)、里氏木霉(trichoderma reesei)、哈茨木霉(trichoderma harzianum)、长枝木霉(trichoderma longibrachiatum)、绿色木霉(trichoderma viride)、chrysosporium lucknowense、rasamsonia emersonii、嗜热侧孢霉(sporotrichum thermophile)、corynascus fumimontanus、嗜热棒囊壳(corynascus thermophilus)、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、fusarium venenatum、粗糙脉孢菌(neurospora crassa)和talaromyces piniphilus。
135.具体来说，本发明提供了thermothelomyces heterothallica菌株c1作为能够生产大量稳定蛋白质的子囊菌类丝状真菌的模型。
136.术语“thermothelomyces”及其种“thermothelomyces heterothallica和thermophila”在本文中以本领域中已知的最宽的范围使用。属及其种的描述可以在例如marin-felix y(2015.mycologica 107(3):619-632doi.org/10.3852/14-228)和van den brink j等(2012,fungal diversity52(1):197-207)中找到。当在本文中使用时，“c1”或“thermothelomyces heterothallica c1”或th.heterothallica c1或c1全都是指thermothelomyces heterothallica菌株c1。
137.应该指出，上述作者(marin-felix等，2015)提出了基于最适生长温度、分生孢子形态和有性繁殖周期细节来划分毁丝霉属(myceliophthora)。根据所提出的标准，c1明确属于含有以前的耐热毁丝霉属(myceliophthora)物种的新确立的属thermothelomyces，而不是保留包括非耐热物种的毁丝霉属(myceliophthora)。由于c1可以与具有相反交配类型的一些其他thermothelomyces(以前的毁丝霉属(myceliophthora))菌株形成子囊孢子，因此c1最好被归类为th.heterothallica菌株c1而不是th.thermophila c1。
138.还必须认识到，真菌分类学在过去也不断变化，因此上面列出的当前名称在之前可能具有除了嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)之外的各种不同更早名称(van oorschot,1977.persoonia 9(3):403)，它们现在被认为是同义语。例如，thermothelomyces heterothallica(marin-felix等，2015.mycologica,3:619-63)与corynascusheterotchallicus、thielavia heterothallica、chrysosporium lucknowense和thermophile以及sporotrichium thermophile(alpinis 1963.nova hedwigia 5:74)同义。
139.还应该明确理解，本发明涵盖了含有与seq id no：20显示出99％或更高同源性的
核糖体dna(rdna)序列的任何菌株，并且所有那些菌株被认为是与thermothelomyces heterothallica同种的。
140.具体来说，术语th.heterothallica菌株c1涵盖了源自于野生型菌株的遗传修饰的亚株，其已使用随机或定点方法例如使用uv诱变或通过缺失一个或多个内源基因进行突变。例如，所述c1菌株可以是指被修饰以缺失一个或多个编码内源蛋白酶的基因的野生型菌株。例如，本发明涵盖的c1菌株包括：菌株uv18-25，保藏号vkm f-3631d；菌株ng7c-19，保藏号vkm f-3633d；和菌株uv13-6，保藏号vkm f-3632d。根据本发明的教导可以使用的其他c1菌株包括：hc菌株uv18-100f，保藏号cbs141147；hc菌株uv18-100f，保藏号cbs141143；lc菌株w1l#100i，保藏号cbs141153；和lc菌株w1l#100i，保藏号cbs141149，及其衍生菌株。
141.应该明确地理解，本发明的教导涵盖了th.heterothallica c1菌株的突变体、衍生物、后代和克隆，只要这些衍生物、后代和克隆在按照本发明的教导遗传修饰时能够产生至少一种根据本发明的教导的蛋白质产物即可。
142.应该明确地理解，术语“衍生物”在指称真菌株系时，涵盖了具有正面影响产物产率、效率或功效或影响改进所述真菌衍生物作为生产所需蛋白质的工具的任何性状的修饰的任何真菌亲本株系。当在本文中使用时，术语“后代”是指来自于亲本真菌株系的未修饰或部分修饰的后裔，例如来自于细胞的细胞。术语“亲本菌株”是指未降低根据本发明的特定蛋白酶的表达或活性的相应真菌菌株。
143.根据本发明的一个方面，提供了一种用于生产感兴趣的蛋白质的遗传修饰的丝状真菌，所述遗传修饰的丝状真菌包含至少一个具有蛋白酶kex2和/或alp7和至少一种另外的蛋白酶的降低或废除的表达和/或活性的细胞，所述丝状真菌包含至少一个含有编码所述感兴趣的蛋白质的至少一种外源多核苷酸的细胞。
144.根据本发明的一个方面，提供了一种用于生产异源蛋白的遗传修饰的丝状真菌，所述遗传修饰的丝状真菌包含至少一个具有kex2和至少一种另外的蛋白酶的降低或废除的表达和/或活性的细胞，所述丝状真菌包含至少一个含有编码异源蛋白的至少一种外源多核苷酸的细胞。
145.根据本发明的一个方面，提供了一种用于生产异源蛋白的遗传修饰的丝状真菌，所述遗传修饰的丝状真菌包含至少一个具有alp7和至少一种另外的蛋白酶的降低或废除的表达和/或活性的细胞，所述丝状真菌包含至少一个含有编码异源蛋白的至少一种外源多核苷酸的细胞。
146.根据本发明的一个方面，提供了一种生产异源蛋白的遗传修饰的丝状真菌，所述遗传修饰的丝状真菌包含至少一个具有蛋白酶alp7、kex2和至少一种另外的蛋白酶的降低或废除的表达和/或活性的细胞，所述丝状真菌包含至少一个含有编码异源蛋白的至少一种外源多核苷酸的细胞。
147.根据某些实施方式，所述至少一个细胞具有13种蛋白酶的降低或废除的表达和/或活性，其中蛋白酶之一是kex2。根据某些实施方式，所述至少一个细胞具有13种蛋白酶的降低或废除的表达和/或活性，其中蛋白酶之一是alp7。根据某些实施方式，所述至少一个细胞具有包括kex2和alp7在内的14种蛋白酶的降低或废除的表达和/或活性。
148.术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指氨基酸的聚合物而不是指特定长度的产物，因此，这个定义中包括了肽、寡肽和多肽。
149.当在本文中使用时，术语“感兴趣的蛋白质”是指希望以高水平在丝状真菌中表达的蛋白质。此类蛋白质包括但不限于抗体、酶、底物结合蛋白、结构蛋白、抗原等。
150.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌包含至少一个具有kex2和至少一种另外的蛋白酶的降低或废除的表达和/或活性的细胞。
151.根据某些实施方式，所述子囊菌类丝状真菌包含至少一个具有至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种或至少十五种蛋白酶的降低或废除的表达和/或活性的细胞。
152.根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达kex2。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达alp7。
153.根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达alp1。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达pep4。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达alp2。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达prt1。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达srp1。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达alp3。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达pep1。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达mtp2。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达pep5。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达mtp4。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达pep6。根据某些实施方式，所述遗传修饰的丝状真菌不表达alp4。
154.根据特定实施方式，所述子囊菌类丝状真菌包含至少一个具有选自alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6和alp4的至少一种另外的蛋白酶的降低或废除的表达和/或活性的细胞。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
155.根据本发明的一个方面，提供了一种用于生产感兴趣的蛋白质的遗传修饰的子囊菌类丝状真菌，其中所述遗传修饰的丝状真菌包含至少一个包含编码所述感兴趣的蛋白质的外源多核苷酸的细胞，所述遗传修饰的子囊菌类丝状真菌不表达或表达降低量的kex2和/或alp7和选自alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、apl3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6和alp4的至少一种另外的蛋白酶。
156.根据某些实施方式，所述丝状真菌不表达或表达降低量的kex2、alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6和alp4。
157.根据某些实施方式，所述丝状真菌不表达或表达降低量的alp7、alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6和alp4。
158.根据某些实施方式，所述丝状真菌不表达或表达降低量的kex2、alp7、alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6和alp4。
159.根据一个方面，本发明提供了一种用于生产病毒抗原的遗传修饰的子囊菌类丝状真菌，其中所述遗传修饰的丝状真菌包含至少一个包含编码所述病毒抗原的外源多核苷酸的细胞，所述遗传修饰的子囊菌类丝状真菌不表达或表达降低量的kex2、alp7、alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6和alp4。
160.根据某些实施方式，所述病毒抗原是来自于裂谷热病毒(rvfv)的疫苗抗原蛋白。
161.根据一个方面，本发明提供了一种用于生产sars-cov2刺突结构域的受体结合结构域(rbd)的遗传修饰的子囊菌类丝状真菌，其中所述遗传修饰的丝状真菌包含至少一个
包含编码所述rbd的外源多核苷酸的细胞，所述遗传修饰的子囊菌类丝状真菌不表达或表达降低量的kex2、alp7、alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtb2、pep5、mtp4、pep6和alp4。
162.也被称为qds1、srb1和vmn45的kex2基因编码kex2或kexin蛋白酶。kex2蛋白酶是一种丝氨酸肽酶。thermothelomyces heterothallica kex2氨基酸序列阐述在seq id no：14中。
163.根据某些实施方式，所述kex2包含与seq id no：14具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
164.所述thermothelomyces heterothallica alp7氨基酸序列阐述在seq id no：13中。
165.根据某些实施方式，所述alp7包含与seq id no：13具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
166.alp1基因编码碱性蛋白酶1。alp1是一种分泌的碱性蛋白酶，允许蛋白质类底物的同化。thermothelomyces heterothallica alp1氨基酸序列阐述在seq id no：1中。
167.根据某些实施方式，所述alp1包含与seq id no：1具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
168.pep4基因(别名：pho9、pra1、ysca)是一种天冬氨酸肽酶。thermothelomyces heterothallica pep4氨基酸序列阐述在seq id no：2中。
169.根据某些实施方式，所述pep4包含与seq id no：2具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
170.thermothelomyces heterothallica alp2氨基酸序列阐述在seq idno：3中。
171.根据某些实施方式，所述alp2包含与seq id no：3具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
172.thermothelomyces heterothallica prt1氨基酸序列阐述在seq idno：4中。
173.根据某些实施方式，所述prt1包含与seq id no：4具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
174.thermothelomyces heterothallica srp1氨基酸序列阐述在seq idno：5中。
175.根据某些实施方式，所述srp1包含与seq id no：5具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
176.thermothelomyces heterothallica alp3氨基酸序列阐述在seq idno：6中。
177.根据某些实施方式，所述alp3包含与seq id no：6具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％
同一性的氨基酸序列。
178.thermothelomyces heterothallica pep1氨基酸序列阐述在seq idno：7中。
179.根据某些实施方式，所述pep1包含与seq id no：7具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
180.thermothelomyces heterothallica mtp2氨基酸序列阐述在seq idno：8中。
181.根据某些实施方式，所述mtp2包含与seq id no：8具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
182.thermothelomyces heterothallica pep5氨基酸序列阐述在seq idno：9中。
183.根据某些实施方式，所述pep5包含与seq id no：9具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
184.thermothelomyces heterothallica mtp4氨基酸序列阐述在seq idno：10中。
185.根据某些实施方式，所述mtp4包含与seq id no：10具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
186.thermothelomyces heterothallica pep6氨基酸序列阐述在seq idno：11中。
187.根据某些实施方式，所述pep6包含与seq id no：11具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
188.thermothelomyces heterothallica alp4氨基酸序列阐述在seq idno：12中。
189.根据某些实施方式，所述alp4包含与seq id no：12具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
190.thermothelomyces heterothallica alp5氨基酸序列阐述在seq idno：15中。
191.根据某些实施方式，所述alp5包含与seq id no：15具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
192.thermothelomyces heterothallica alp6氨基酸序列阐述在seq idno：16中。
193.根据某些实施方式，所述alp6包含与seq id no：16具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
194.thermothelomyces heterothallica srp3氨基酸序列阐述在seq idno：17中。
195.根据某些实施方式，所述srp3包含与seq id no：17具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
196.thermothelomyces heterothallica srp5氨基酸序列阐述在seq idno：18中。
197.根据某些实施方式，所述srp5包含与seq id no：18具有至少75％、80％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
198.thermothelomyces heterothallica srp8氨基酸序列阐述在seq idno：19中。
199.根据某些实施方式，所述srp8包含与seq id no：19具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
200.根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质与标签融合。根据某些实施方式，所述标签是c-端或n-端标签。根据某些实施方式，所述标签选自几丁质结合蛋白(cbp)、麦芽糖结合蛋白(mbp)、strep标签、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、flag标签、spy标签、c标签、alfa标签、v5标签、myc标签、ha标签、spot标签、t7标签、ne标签和聚(his)标签。根据某些实施方式，所述标签是spy标签。根据某些实施方式，所述标签是c标签。
201.当在本文中使用时，术语“标签”是指一个氨基酸序列，其在本领域中通常与另一个氨基酸序列融合或包含在另一个氨基酸序列中，用于a)便于整个氨基酸序列或多肽的纯化，b)提高整个氨基酸序列或多肽的表达，和/或c)便于整个氨基酸序列或多肽的检测。
202.术语“c标签”在本领域中是公知的，并且是指4个氨基酸的亲和标签：e-p-e-a(谷氨酸-脯氨酸-谷氨酸-丙氨酸)，其可以融合在任何重组蛋白的c-端。所述标签在用于纯化目的时提供高亲和性和选择性。
203.术语“spy标签”在本领域中是公知的，并且是指与spycatcher蛋白共价结合的短肽。spy标签序列是ala-his-ile-val-met-val-asp-ala-tyr-lys-pro-thr-lys。
204.术语“strep标签”在本文中以本领域中所知的使用，并且是指一种允许通过亲和层析来纯化和检测蛋白质的方法。所述方法是基于strep-tactin连接。
205.术语“谷胱甘肽s-转移酶(gst)”在本文中以本领域中所知的使用，并且是基于gst蛋白对谷胱甘肽(gsh)的强结合亲和性。gst标签通常被用于分离和纯化含有gst-融合蛋白的蛋白质。所述标签长为220个氨基酸。
206.术语“flag标签”在本文中以本领域中所知的使用，并且是指一种可以使用重组dna技术添加到蛋白质的多肽蛋白质标签。它是最特异的标签之一，并且它是一种人造抗原，已经开发了针对它的特异性、高亲和性单克隆抗体，并因此可用于通过亲和层析进行蛋白质纯化。
207.术语“alfa标签”在本文中以本领域中所知的使用，并且是指一种纳米抗体特异性识别的表位标签，可用于检测和纯化。
208.v5标签是一种用于蛋白质检测和纯化的短肽标签。v5标签可以融合/克隆到重组蛋白，并使用抗体和纳米抗体在elisa、流式细胞术、免疫沉淀、免疫荧光和western印迹中检测。
209.术语“myc标签”在本文中以本领域中所知的使用，并且是指一种源自于c-myc基因的短肽标签，其可以被特异性抗体识别。
[0210]“ha标签”在本文中以本领域中所知的使用，并且是指一种源自于人流感血凝素(ha)分子的肽，对应于第98-106位氨基酸。这种标签被用于便于感兴趣的蛋白质的检测、分离和纯化。
[0211]“spot标签”是一种被单域抗体纳米抗体(sdab)识别的12个氨基酸的肽标签。所述
标签可用于各种不同应用，包括免疫沉淀、亲和纯化、免疫荧光和超高分辨率显微镜。
[0212]
术语“t7标签”在本文中以本领域中所知的使用，并且是指一种由11个残基的肽组成的表位标签，由t7噬菌体基因10的前导序列编码。
[0213]
术语“ne标签”在本文中以本领域中所知的使用，并且是指一种被设计为表位标签的合成的肽标签(ne标签)，用于重组蛋白的检测、定量和纯化。这种肽标签由18个亲水性氨基酸组成。
[0214]
术语“聚(his)标签”或“聚组氨酸标签”在本领域中已知，并且是指蛋白质中通常由至少6个组氨酸(his)残基组成的氨基酸基序，通常在所述蛋白质的n-或c-端。它也被称为六聚组氨酸标签、6xhis标签和his6标签。所述短肽可以被金属离子例如二价镍或钴结合。
[0215]
根据某些实施方式，所述丝状真菌被进一步修饰以产生具有与人类、伴侣动物和其他哺乳动物蛋白质相似的n-聚糖的蛋白质。根据某些实施方式，所述丝状真菌包含alg3基因的缺失或破坏，使得所述真菌不能产生有功能的α-1,3-甘露糖基转移酶。根据某些实施方式，丝状真菌包含alg11基因的缺失或破坏，使得所述真菌不能产生有功能的α-1,2-甘露糖基转移酶。根据某些实施方式，所述丝状真菌包含内源翻转酶的过表达或异源翻转酶的表达。
[0216]
根据某些实施方式，所述丝状真菌还包含异源glcnac转移酶1(gnt1)和glcnac转移酶2(gnt2)的表达。在某些实施方式中，所述gnt1包含异源高尔基体定位信号。在某些实施方式中，所述异源gnt1和gnt2是动物来源的。
[0217]
根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是抗原。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是刺突蛋白。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)序列或其片段。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质是sars-cov-2刺突蛋白的rbd。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含sars-cov-2刺突蛋白的受体结合基序(rbm)。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含sars-cov-2s蛋白的糖蛋白结合结构域(gbd)序列。根据特定实施方式，所述rbd或其片段与spy标签融合。根据某些实施方式，所述rbd或其片段与c标签融合。根据其他实施方式，所述rbd与抗体的fc融合。根据某些实施方式，所述感兴趣的蛋白质包含rbd或其片段的2、3或4个重复序列。
[0218]
所述冠状病毒抗原序列可以根据冠状病毒的任何已知或发现的变体进行操作。例如，所述序列可以根据下述文献中描述的序列来操作：rambaut等，ncov-2019genomic epidemiology,2020年12月(https://virological.org/t/preliminary-genomic-characterisation-of-an-emer gent-sars-cov-2-lineage-in-the-uk-defined-by-a-novel-set-of-spike-mutatio ns/563)；tegally,h.等，2020(https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.12.21.2024 8640v1)；或faria nr等2020(https://virological.org/t/genomic-characterisation-of-an-emergentsars-cov-2-lineage-in-manaus-preliminary-findings/586)。本发明涵盖了与基于本技术中鉴定的任一序列的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。术语“序列同一性”和“序列同源性”在本说明书中被认为是同义的。
[0219]
有许多已建立的算法可用于比对两个氨基酸序列。通常，一个序列充当参比序列，可以将测试序列与其进行比较。序列比较算法在指定的程序参数的基础上计算所述测试序
列相对于参比序列的序列同一性百分比。用于比较的氨基酸序列的比对可以例如通过计算机执行的算法(例如gap、bestfit、fasta或tfasta)或blast和blast2.0算法来进行。
[0220]
在比较中，同一性可能存在于所述序列的长度为至少10个氨基酸残基(例如长度为至少15、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或685个氨基酸残基，例如直至所述参比序列的整个长度)的区域内。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
[0221]
当在本文中使用时，术语“外源”是指不在所述真菌中天然表达的多核苷酸或蛋白质(例如来自于不同物种的异源多核苷酸)。所述外源多核苷酸可以以稳定或瞬时的方式引入到所述真菌中，以便产生核糖核酸(rna)分子和/或多肽分子。
[0222]
当在本文中使用时，术语“异源”包括插入到真菌中并且在所述真菌中不天然存在的序列。
[0223]
术语“dna构建体”、“表达载体”、“表达构建体”和“表达盒”用于指称人工组装或分离的核酸分子，其包含编码感兴趣的蛋白质的核酸序列，并被组装成使得所述感兴趣的蛋白质在靶宿主细胞中功能性表达。表达载体通常包含与编码所述感兴趣的蛋白质的核酸序列可操作连接的适合的调控序列。表达载体还可以包含编码选择标记的核酸序列。
[0224]
术语“多核苷酸”、“核酸序列”和“核苷酸序列”在本文中用于指称脱氧核糖核苷酸(dna)、核糖核苷酸(rna)及其修饰的形式的聚合物，其是独立片段的形式或作为更大构建体的组分。核酸序列可以是编码序列，即在细胞中编码最终产物例如蛋白质的序列。
[0225]
与参比序列“同源的”序列(例如核酸序列和氨基酸序列)在本文中是指所述序列之间的同一性百分比，其中所述同一性百分比为至少70％、至少75％、优选至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％。每种可能性代表本发明的独立实施方式。同源核酸序列包括与密码子用法和遗传密码的简并性相关的变化。
[0226]
编码本发明的蛋白质的核酸序列可以被优化用于表达。此类序列修饰的实例包括但不限于改变g/c含量以更接近丝状真菌中通常发现的含量。
[0227]
短语“密码子优化”是指选择接近感兴趣的生物体内的密码子用法的适合的dna核苷酸用在结构基因或其片段中，和/或是指通过将本源序列的至少一个密码子(例如1个或超过约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子)用在该宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子来代替并同时维持本源氨基酸序列，来修饰核酸序列以增强在所述宿主细胞中的表达的方法。各种不同物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子用法的差异)通常与信使rna(mrna)的翻译效率相关，后者进而据信取决于尤其是正在翻译的密码子的性质和特定转运rna(trna)分子的可利用性。细胞中所选trna的主导性通常反应了肽合成中最频繁使用的密码子。因此，可以在密码子优化的基础上对基因进行定制，以在给定生物体中获得最佳基因表达。因此，优化的基因或核酸序列是指其中本源或天然存在的基因的核苷酸序列已被修饰以利用所述生物体内统计学优选的或统计学喜爱的密码子的基因。
[0228]
序列同一性可以使用本领域中已知的核苷酸/氨基酸序列比较算法来确定。
[0229]
术语“编码序列”在本文中是指核苷酸序列，其始于起始密码子(atg)，含有不包括终止密码子的任何数量的密码子，和终止密码子(taa、tga、taa)，编码有功能的多肽。
[0230]
本文中列出的任何编码序列或氨基酸序列也包括截短的序列，其从所述序列的任
何部分失去了1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子或氨基酸。编码序列或氨基酸序列的截短的版本可以使用本领域中已知的核苷酸/氨基酸序列比较算法来鉴定。
[0231]
本文中列出的任何编码序列或氨基酸序列还包括融合的序列，其除了本文中提供的编码序列或如上所定义的该序列的截短之外还含有其他序列。所述融合的序列可以是本文所公开的序列和其他序列。融合的编码序列或氨基酸序列可以使用本领域中已知的核苷酸/氨基酸序列比较算法来鉴定。
[0232]
通过常规分子生物学方法，利用限制性核酸内切酶和连接酶、gibson组装或酵母重组，将dna序列组装成表达盒、选择盒并进一步组装成dna构建体和/或表达载体。此外，上述材料可以由dna合成服务提供商合成。正如本领域中已知的，几种不同技术可以实现相同的结果。
[0233]
正如下文中描述的以及本领域中已知的，将dna序列组装成表达盒，其将5’调控区(启动子)、编码序列和3’调控区(终止子)相连。这三种序列的任何组合可形成有功能的表达盒。
[0234]
终止子的名单包括但不限于th.heterothallica的编码下述蛋白质的基因的终止子：未表征的蛋白g2qf75(xp_003664349)；聚泛素同源物(g2qhm8，xp_003664133)；未表征的蛋白质(g2qia5，xp_003664731)；β-葡萄糖苷酶(g2qd93，xp_003662704)；延伸因子1-α(g2q129，xp_003660173)；几丁质酶(g2qdd4，xp_003663544)；磷酸甘油酸激酶(pgk)(uniprot g2qld8)，甘油醛3-磷酸脱氢酶(gpd)(g2qpq8)，磷酸果糖激酶(pfk)(g2q605)；或磷酸丙糖异构酶(tpi)(g2qbr0)；肌动蛋白(act)(g2q7q5)；cbh1(genbank ax284115)或β-葡萄糖苷酶1bgl1(xm_003662656)。外源终止子包括构巢曲霉(aspergillus nidulans)gpda终止子。
[0235]5’
调控区(启动子)在实践中被定义为在它们所调控的基因的编码序列的起始密码子之前至多2000个碱基对的区段，倘若所述前方区域是非编码的。
[0236]3’
调控区(终止子)在实践中被定义为从所述基因的编码序列的终止密码子起下游至多300个碱基对的区段，倘若所述后方区域是非编码的。
[0237]
dna序列也被组装成选择标记盒，它们是其中编码序列编码当在被转化菌株中存在时提供选择优势的基因的表达盒。此类优势可以是利用新的碳源或氮源、对有毒物质的抗性等。
[0238]
本文公开的蛋白酶的缺失可以如本领域中所知来进行。在某些实施方式中，所述缺失通过转化适合的dna构建体来进行。用于靶向转化的dna构建体由下述组件组成：(a)允许将所述dna构建体维持在特定宿主中的适合的载体，(b)0、1个或更多个采取任何方向的表达盒，(c)采取任何方向的选择标记盒，和(d)与选择的靶基因组dna区段相同的序列(也被称为靶向臂)。这些组件被放置成使得所述两个靶向臂涵盖任何表达盒和选择标记盒，使得当在所述靶向臂与基因组dna中的两个相同区域之间发生同源重组时，在所述dna构建体的靶向臂之间的序列被插入到染色体中并代替最初存在于染色体上的序列。使用这一原理，可以将基因从基因组中敲除或插入到基因组中。通过将与紧靠选择标记盒上游的序列相同的序列放置在选择标记盒下游，可以如本领域中所知回收利用所述标记。
[0239]
术语“调控序列”是指控制编码序列的表达(转录)的dna序列，例如启动子、增强子和终止子。
[0240]
术语“启动子”是指在体内或体外控制或指导另一个dna序列的转录的调控dna序列。通常，启动子位于被转录序列的5'区域中(即之前，位于上游)。启动子可以整体源自于天然来源，或者可以由源自于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的核苷酸区段。启动子可以是组成型(即启动子激活不受诱导剂调控，因此转录速率恒定)或诱导型(即启动子激活受诱导剂或环境条件调控)的。启动子也可以将转录限制到所述生物体的某个发育阶段或某个形态上不同的部分。在大多数情况下，调控序列的精确边界尚未被完全定义，并且在某些情况下不能被完全定义，因此某些变异的dna序列可能具有相同的启动子活性。
[0241]
术语“终止子”是指调控转录终止的另一种调控dna序列。终止子序列被可操作连接到待转录的核酸序列的3
′
端。
[0242]
术语“c1启动子”和“c1终止子”是指适合用于c1、即能够在c1中指导基因表达的启动子和终止子序列。
[0243]
然而，正如专业技术人员已知的，启动子和终止子的选择可能不是关键的，使用提供相似或相同的基因表达的各种不同启动子和终止子可以获得相似的结果。
[0244]
术语“可操作连接”意味着所选核酸序列与调控元件(启动子、增强子和/或终止子)邻近，以允许所述调控元件调控所选核酸序列的表达。
[0245]
本发明公开了使用遗传修饰的th.heterothallica c1菌株生产感兴趣的蛋白质。正如上文中所述，也可以使用共有相似的内源前体生产途径的其他物种的丝状真菌。
[0246]
根据某些实施方式，本发明的多核苷酸根据待生产的蛋白质的氨基酸序列，使用丝状真菌的密码子用法来设计。根据某些实施方式，所述丝状真菌属于盘菌亚门(pezizomycotina)。根据某些实施方式，所述丝状真菌属于选自粪壳菌目(sordariales)、肉座菌目(hypocreales)、爪甲团囊菌目(onygenales)和散囊菌目(eurotiales)的组，包括如上文在“定义”部分中所描述的属和种。根据某些示例性实施方式，所述真菌是th.heterothallica。根据这些实施方式，本发明的多核苷酸是在th.heterothallica中鉴定到的多核苷酸或其同源物。根据某些当前示例性实施方式，所述真菌是th.heterothallica c1。
[0247]
根据某些示例性实施方式，所述th.heterothallica c1菌株是菌株uv18-#100的衍生株。
[0248]
所述一个或多个dna构建体或表达载体各自包含控制所述多核苷酸在所述至少一个真菌细胞内转录的调控元件。所述调控元件可以是真菌、特别是th.heterothallica c1内源的调控元件或对所述真菌来说外源的调控元件。
[0249]
根据某些实施方式，所述调控元件选自5’调控元件(合称为启动子)和3’调控元件(合称为终止子)，尽管这些核苷酸序列可能含有在严格意义上不被分类为启动子或终止子序列的其他调控元件。
[0250]
根据某些实施方式，所述dna构建体或表达载体包含至少一个启动子，其可操作连接到至少一个含有编码序列的多核苷酸，后者可操作连接到至少一个终止子。根据某些实施方式，所述启动子是所述真菌、特别是th.heterothallica的内源启动子。根据另外或可选的实施方式，所述启动子对所述真菌、特别是th.heterothallica来说是异源的。根据某些实施方式，所述终止子是所述真菌、特别是th.heterothallica的内源终止子。根据其他
或可选实施方式，所述终止子对所述真菌、特别是th.heterothallica来说是异源的。
[0251]
根据某些示例性实施方式，所述dna构建体含有被称为“合成表达系统”(ses)的合成的调控元件，其基本上如国际(pct)申请公开号wo 2017/144777中所述。
[0252]
根据某些实施方式，所述多核苷酸被稳定整合到所述遗传修饰的真菌的至少一个细胞的至少一个染色体座位中。根据某些实施方式，所述多核苷酸被稳定整合到所述真菌染色体上的确定位点中。根据某些实施方式，所述多核苷酸被稳定整合到所述染色体的随机位点中。根据某些实施方式，所述多核苷酸可以以定向或随机方式作为1、2个或更多个拷贝并入到1、2个或更多个染色体座位中。
[0253]
根据某些可选实施方式，正如本领域技术人员已知的，所述多核苷酸使用染色体外表达载体瞬时表达。
[0254]
根据某些实施方式，将所述遗传修饰的真菌在适合的培养基中培养，提供了以与在相似条件下培养的相应的亲本真菌中产生的量相比提高的量的感兴趣的蛋白质的生产。
[0255]
根据某些示例性实施方式，本发明提供了一种遗传修饰的th.heterothallica c1真菌，其能够生产感兴趣的蛋白质。根据这些实施方式，此类遗传修饰的th.heterothallica c1真菌包含至少一个具有kex2和/或alp7和至少一种另外的蛋白酶的降低的表达和/或活性的细胞。
[0256]
根据某些实施方式，用于培养所述遗传修饰的真菌的适合的培养基包含选自葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、乳糖、纤维二糖和甘油的碳源。根据某些实施方式，所述碳源由淀粉、甜菜和甘蔗的乙醇生产或其他生物生产的废物提供，例如包含可发酵糖的糖蜜、淀粉、包含聚合糖类(例如纤维素和半纤维素)的木质纤维生物质。
[0257]
根据某些当前示例性实施方式，所述真菌是th.heterothallica c1。根据某些实施方式，所述th.heterothallica c1菌株选自：菌株uv18-25，保藏号vkm f-3631d；菌株ng7c-19，保藏号vkm f-3633d；和菌株uv13-6，保藏号vkm f-3632d。可以使用的其他菌株是：hc菌株uv18-100f，保藏号cbs141147；hc菌株uv18-100f，保藏号cbs141143；lc菌株w1l#100i，保藏号cbs141153；和lc菌株w1l#100i，保藏号cbs141149；及其衍生株。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
[0258]
根据另一方面，本发明提供了一种产生能够生产感兴趣的外源蛋白的真菌的方法，所述方法包括用编码所述感兴趣的蛋白质的至少一种多核苷酸转化所述真菌的至少一个细胞，所述真菌的至少一个细胞具有kex2和/或alp7和至少一种另外的蛋白酶的降低的表达和/或活性。
[0259]
根据某些实施方式，所述方法还包括缺失、抑制或降低kex2或alp7的表达。根据某些实施方式，所述方法还包括缺失、抑制或降低选自alp1、pep4、alp2、prt1、srp1、alp3、pep1、mtp2、pep5、mtp4、pep6、alp4的至少一种蛋白酶的表达。
[0260]
本文描述的术语蛋白质、特别是蛋白酶的“降低的表达”或“抑制的表达”可互换使用，并且包括但不限于缺失或破坏编码所述蛋白质的基因。
[0261]
本文描述的术语蛋白质、特别是蛋白酶的“降低的活性”或“抑制的活性”可互换使用，并且还包括导致所述蛋白质的活性降低或废除的翻译后修饰。
[0262]
根据本发明的教导，可以使用本领域中已知的用于用编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸转化丝状真菌的任何方法。
223)中所述使用原生质体/peg方法共转化到具有12种蛋白酶基因缺失的c1菌株dnl146中。
[0275]
将在pyr4选择培养基平板上生长的转化的菌落在相同的选择培养基上再次划线。通过pcr进行正确转化体的鉴定。将来自于转化体划线的菌丝体溶解在20mm naoh中，并在100℃下温育以裂解细胞。将1-2μl这种溶液作为模板，使用phire plant pcr试剂盒
tm
(thermo fisher)进行pcr。在该pcr中使用的寡核苷酸引物在表1中示出。缺失构建体在alp7座位中的整合通过两个pcr反应显示。在基因5’末端处的整合通过使用如seq id nos：25和26所阐述的引物的反应来显示。扩增出1233bp片段，这表明成功整合到alp7座位。在alp7的3’末端处的整合使用如seq id nos：27和28所阐述的引物来显示。扩增出1748bp片段，这表明成功整合到alp7座位。alp7基因的丧失通过使用如seq id nos：29和30所阐述的引物的反应来显示。未扩增出569bp的片段，这表明alp7基因的缺失。
[0276]
表1.用于显示正确整合和alp7的丧失的寡核苷酸引物
[0277]
seq id no：序列25(omyt2190)cctgcattgcaagttcccac26(omyt0106)agtttgacagtgcccagagc27(omyt0027)agcctggaaggcctatctgg28(omyt0693)ggtcggattggcttggtaca29(omyt0694)accaccgtcaacacgtacaa30(omyt0695)caaaggtcttgccaccgatg31(omyt2193)ttcgttgctaacactccccc32(omyt2194)ctggttgatggccgagttga
[0278]
将对两个整合pcr反应阳性和对alp7 orf的丧失阳性的转化体，使用如seq id nos：31和32所阐述的引物通过定量pcr进行进一步分析，以证实alp7基因已从测试的转化体完全缺失。将对缺失盒在alp7座位中的整合阳性并在检测alp7基因存在的qpcr测试中阴性的一个c1转化体克隆储存在-80℃下，并给予菌株编号dnl150。
[0279]
实施例2：c1 kex2基因的缺失
[0280]
将c1 kex2蛋白酶基因从早些时候缺失了12种蛋白酶的c1蛋白酶缺失谱系菌株中缺失。用于kex2的缺失盒分两部分构建在两个独立质粒中，它在转化到c1后以与alp7缺失盒(上文描述)相似的方式起作用。所述缺失盒也含有5’侧翼区的正向重复序列，用于移除pyr4标记。所述缺失构建体质粒的序列阐述在seq id nos：23和24中。5’臂质粒pmyt0997含有用于整合的kex2 5
′
侧翼区片段(seq id no：23的第9
–
1,058位)和半个pyr4标记(seq id no：23的第1,033-2,812位)。3’臂质粒pmyt0998含有另一半pyr4标记(seq id no：24的第17-1273位)、正向重复序列(seq id no：24的第1281-1782位)和用于整合的kex2 3
′
侧翼区片段(seq id no：24的第1791-2690位)。
[0281]
从c1基因组dna扩增所述kex2侧翼区和正向重复序列的片段，并通过用nebbuilder
tm
hifi dna组装试剂盒(new england biolabs)按照制造商的说明书进行gibson克隆，克隆到含有pyr4标记的源自于psr426质粒的骨架载体中。将缺失构建体的两个部分从所述质粒切下，并如前在visser,v.j等(同上)中所述共转化到具有12种蛋白酶基因缺失的c1菌株dnl146中。
[0282]
将在pyr4选择培养基平板上生长的转化的菌落在相同的选择培养基上再次划线。
通过pcr进行正确转化体的鉴定。将来自于转化体划线的菌丝体溶解在20mm naoh中，并在100℃下温育以裂解细胞。将1-2μl这种溶液作为模板，使用phire plant pcr试剂盒
tm
(thermo fisher)进行pcr。在该pcr中使用的寡核苷酸引物在表2中示出。缺失构建体在kex2座位中的整合通过两个pcr反应显示。在基因5’末端处的整合通过使用如seq id nos：33和34所阐述的引物的反应来显示。扩增出1187bp片段，这表明成功整合到kex2座位。在kex2的3’末端处的整合使用如seq id nos：35和36所阐述的引物来显示。扩增出1849bp片段，这表明成功整合到kex2座位。kex2基因的丧失通过使用如seq id nos：37和38所阐述的引物的反应来显示。未扩增出510bp的片段，这表明kex2基因的缺失。
[0283]
表2.用于显示正确整合和kex2的丧失的寡核苷酸引物
[0284]
seq id no：序列33(omyt2305)ggcagattattccggaccgt34(omyt0106)agtttgacagtgcccagagc35(omyt0027)agcctggaaggcctatctgg36(omyt2306)tcaacgtgtgggagcagtac37(omyt2299)gggctccatctacgtcttcg38(omyt2300tggatccagggcgagtagaa39(omyt2301)tgggctcgtacgacttcaac40(omyt2302)cggcgatgttggagtcgtat41(omyt2303)cgagaccgacaagaccaaca42(omyt2304)gaagagcacgatgagcacga
[0285]
将对两个整合pcr反应阳性和对kex2 orf的丧失阳性的转化体，使用如seq id nos：39和40所阐述的引物和使用如seq id nos：41和42所阐述的引物通过定量pcr进行进一步分析，以证实kex2基因已从测试的转化体完全缺失。将对缺失盒在kex2座位中的整合阳性并在检测kex2基因存在的qpcr测试中阴性的一个c1转化体克隆储存在-80℃下，并给予菌株编号dnl152。
[0286]
实施例3：c1alp7基因和c1kex2基因的组合缺失
[0287]
其中alp7基因和kex2基因均被缺失的c1菌株的产生，通过从其中早些时候缺失了alp7基因和12种其他蛋白酶基因的dnl150菌株中缺失kex2基因来进行。在缺失kex2基因之前，除去dnl150菌株中的pyr4标记，以便使用与上文dnl152菌株的产生中所述相同的缺失盒来缺失kex2基因。
[0288]
使用在上文dnl150的产生中描述的缺失盒移除pyr4选择标记是基于两个特点：a)有功能的pyr4基因将5-氟乳清酸(5-foa)转变成5-氟尿嘧啶这种有毒代谢物，因此失去有功能的pyr4基因的克隆能够在5-foa存在下生长；和b)在5-foa选择压力下，缺失构建体中的正向重复序列能够使所述克隆通过5’侧翼区与正向重复序列之间的同源重组事件移除pyr4选择标记。成功的重组成环排出完整的pyr4标记，能够使正确的克隆在5-foa存在下生长。
[0289]
从dnl150移除pyr4标记按照下述方案进行：将来自于平板的一小部分新鲜菌丝体悬浮在0.9％ nacl，0.025％吐温20溶液中。制备所述悬液的稀释液。将不同量的菌丝体悬液铺于含有5-氟乳清酸(5-foa)的平板上(5-foa平板的培养基组分：7mm kcl，11mm kh2po4，
0.1％葡萄糖，10mm尿嘧啶，10mm尿苷，2mm mgso4，10mm脯氨酸，微量元素溶液(1000x：174mm edta，76mm znso4.7h2o，178mm h3bo3，25mm mnso4.h2o，18mm feso4.7h2o，7.1mm cocl2.6h2o，6.4mm cuso4.5h2o，6.2mm na2moo4.2h2o)，4mm 5-氟乳清酸，20g/l颗粒琼脂，ph 6.0)。将板在+35℃下温育，直至菌落出现。将在5-foa培养板上生长的菌落在相同的选择培养基上再次划线。由于在5-foa选择培养基上的生长不良并且划线未生长成清晰的划线，因此将来自于微弱划线的菌丝体在非选择培养基上重新划线(培养基组分：7mm kcl，55mm kh2po4，1,0％葡萄糖，670mm蔗糖，0,6％酵母提取物，35mm(nh4)2so4，2mm mgso4，10mm尿嘧啶，10mm尿苷，微量元素溶液(1000x：174mm edta，76mm znso4.7h2o，178mm h3bo3，25mm mnso4.h2o，18mm feso4.7h2o，7.1mm cocl2.6h2o，6.4mm cuso4.5h2o，6.2mm na2moo4.2h2o)，16g/l颗粒琼脂，ph 6.5)，以获得良好生长。将在非选择培养基上高效生长的划线在不含的尿嘧啶和尿苷的pyr4选择培养基平板上重新划线，用于表型测试。在表型测试中，其中pyr4移除成功的克隆不能在未增补尿嘧啶和尿苷的培养基上生长(培养基组分：7mm kcl，11mm kh2po4，1,0％葡萄糖，670mm蔗糖，35mm(nh4)2so4，2mm mgso4，微量元素溶液(1000x：174mm edta，76mm znso4.7h2o，178mm h3bo3，25mm mnso4.h2o，18mm feso4.7h2o，7.1mm cocl2.6h2o，6.4mm cuso4.5h2o，6.2mm na2moo4.2h2o)，15g/l颗粒琼脂，ph 6.5)。将在表型测试平板中不生长的克隆使用如seq id no：43和44所阐述的引物，通过定量pcr分析pyr4的移除。在所述qpcr反应中使用的寡核苷酸引物在表3中示出。
[0290]
表3.在用于pyr4的丧失的定量pcr中使用的寡核苷酸引物
[0291]
seq id no：序列43(omyt1292)ttggtaagacggtgcagatg44(omyt1293)gtagttgatgcgttccttcca
[0292]
将在表型测试中不能生长并在定量pcr中显示出pyr4基因的阴性结果的一个dnl150 pyr4环出克隆储存在-80℃下，并给予菌株编号dnl151。
[0293]
使用与上文在dnl152的产生中所述相同的缺失盒和转化方法，从c1菌株dnl151缺失kex2蛋白酶。通过pcr反应鉴定正确整合和kex2缺失如上文在dnl152的产生中所述来进行。将对缺失盒在kex2座位中的整合阳性并在检测kex2基因存在的qpcr测试中阴性的一个c1转化体克隆储存在-80℃下，并给予菌株编号dnl155(δalp1δalp2δpep4δprt1δsrp1δalp3δpep1δmtp2δpep5δmtp4δpep6δalp4δalp7δkex2)。
[0294]
实施例4：sars-cov-2rbd在蛋白酶缺陷的c1菌株中的表达
[0295]
在蛋白酶缺陷的c1菌株中表达sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)。第一个构建体含有编码c1内源cbh1信号序列、来自于sars-cov-2的刺突蛋白的第333-527位残基、gly-ser-接头和两侧带有针对c1表达载体的重组序列和mssi限制性酶位点的c标签的序列。所述片段由genscript(usa)合成，并被阐述为seq id no：45(rbd-c标签氨基酸序列，包括信号序列和在rbd与c标签之间的gly/ser接头)。优化所述基因的密码子用法以用于在thermothelomyces heterothallica中表达。通过pcr从genscript质粒扩增所述合成的片段，并通过gibson组装(hifi dna组装克隆试剂盒，new england biolabs)方法克隆到c1表达载体pmyt1055的paci位点中，在内源c1 bgl8启动子和c1 chi1终止子之下。通过对插入到质粒中的片段进行测序来确认构建体的正确序列。序列正确的质粒被给予质粒编号pmyt1142(seq id no：46)。第二个构建体除了与pmyt1142中相同的序
列之外，还含有gly-ser-接头和rbd结构域与c-端gly-ser接头之间的spy标签以及c标签。这个序列被阐述为seq id no：47(rbd-spy标签-c标签氨基酸序列，包括信号序列和spy标签与c标签之间的gly/ser接头)。将所述第二个构建体以与pmyt1142相似的方式构建到pmyt1055表达载体中，并且序列正确的质粒被给予质粒编号pmyt1143(seq id no：48)。
[0296]
将表达载体pmyt1142和完成潮霉素抗性标记基因和向bgl8座位的整合所需的模拟载体配偶体pmyt1140用mssi消化，并共转化到已缺失14种蛋白酶基因的dnl155菌株。所述转化使用原生质体/peg方法(visser,v.j等，同上)进行，并选择nia1+表型和潮霉素抗性的转化体。将转化体在选择培养基平板上划线，并从划线接种到24孔板中的液体培养基。所述培养基组分是(单位为g/l)：葡萄糖5，酵母提取物1，(nh4)2so
4 4.6，mgso4·
7h2o 0.49，kh2po
4 7,48，和(单位为mg/l)edta 45，znso4·
7h2o 19.8，mnso4·
4h2o 3.87，cocl2·
6h2o1.44，cuso4·
5h2o 1.44，na2moo4·
2h2o 1.35，feso4·
7h2o 4.5，h3bo49.9，d-生物素0.004，50u/ml青霉素和0,05mg链霉素。将所述24孔板在35℃下以800rpm振摇温育4天。收集培养上清液并通过western印迹进行分析，所述western印迹使用标准方法，使用第一检测试剂capture select生物素-抗c标签抗体偶联物(thermofisher)和第二试剂irdye 800cw链霉亲和素(li-cor)来进行。western分析(图1)显示对于许多rbd-c标签和rbd-spy标签-c标签转化体检测到预期尺寸的强信号，表明这两种蛋白质均在c1中产生。
[0297]
通过单菌落铺板纯化产生rbd-c标签蛋白的转化体，纯化的克隆通过pcr检测表达盒的正确整合并通过qpcr检测克隆纯度来核实。将一个核实的产rbd-c标签的转化体储存在-80℃下，并给予菌株编号m4169。
[0298]
以与上文为pmyt1142所述相同的方式将带有rbd-spy标签-c标签版本的表达载体pmyt1143与模拟载体配偶体pmyt1140共转化，从24孔板培养物分析转化体(图1)，并通过单菌落铺板进行纯化。在pcr核实后，将一个产rbd-spy标签-c标签的c1转化体克隆储存在-80℃下，并给予菌株编号m4173。
[0299]
也将质粒pmyt1142和pmyt1143转化到dnl155之外的其他c1蛋白酶缺陷菌株，以比较不同蛋白酶缺失菌株中的生产水平。这些菌株中的蛋白酶基因缺失列于表4中。将产rbd的质粒pmyt1142和pmyt1143转化到4种其他蛋白酶缺陷菌株：1)已缺失12种蛋白酶的dnl145菌株，2)已缺失13种蛋白酶的dnl150，3)作为dnl155的平行克隆的dnl159，和4)缺失了14种蛋白酶但kex2基因完整的dnl157。转化、转化体的分析、单菌落纯化和pcr分析以与上文为产生菌株m4169和m4173所述相同的方式进行。在所有四种蛋白酶缺陷菌株中，获得了几个核实的生产菌株均生产rbd-c标签和rbd-spy标签-c标签两者。将来自于dnl145、dnl150、dnl157和dnl159中的这些新生产菌株的三个平行转化体与m4169和m4173以及这两种菌株的两个其他平行克隆一起，在24孔板中的液体培养基中，在35℃和800rpm振摇下培养4天。收集培养上清液并使用本领域中已知的方法在考马斯染色的sds凝胶中进行分析。在kex2缺失的dnl155和dnl159菌株中观察到rbd蛋白的最高产量(图2)。
[0300]
表4.在c1蛋白酶缺陷菌株中缺失的c1蛋白酶
[0301][0302]
将产生rbd-c标签蛋白的c1菌株m4169在2l生物反应器中，以分批补料方法在含有酵母提取物作为有机氮源和葡萄糖作为碳源的培养基中培养。所述培养在38℃下进行5天。在培养结束后，通过以4000g离心20分钟除去菌丝体，在得到的液体培养上清液中以1-2mm的浓度添加苯甲基磺酰氟以抑制蛋白酶活性，并将上清液储存在-80℃下。对于通过c标签亲和层析进行的rbd纯化来说，将100ml液体培养物在冰上融化，并在融化后将样品通过在+4℃下3x 20min 20000g离心进行澄清，然后通过0.45μm滤器过滤。将90ml透明上清液用1xpbs(12mm na2hpo4*2h20，3mm nah2po4*h20，150mm nacl ph7,3)稀释到终体积为200ml。c标签亲和纯化使用附连到start蛋白纯化系统(cytiva)的10ml填充captureselect c标签xl树脂柱(thermo fisher)进行，并以2.5ml/min的流速操作。在载样前首先将柱用5倍柱体积(cv)的1xpbs平衡。在载样后，将柱用15cv的1xpbs清洗，然后用5cv的20mm tris-hcl，2m mgcl2，1mm edta ph7.5的一步梯度进行洗脱，级分体积为3ml。洗脱的rbd的量通过用包含在start系统中的unicorn 1.0软件对洗脱峰的uv迹线进行积分来定量。在计算rbd-c标签的量中使用1.498的消光系数，并在计算rbd-spy标签-c标签的量中使用1.450的消光系数。在洗脱后，将柱用5cv的0,1m甘氨酸ph 2.3再生，并用1xpbs清洗直至达到ph7.3。将含有蛋白质的洗脱级分合并用于透析步骤，以将洗脱缓冲液交换成1xpbs缓冲液。将合并的级分装入12ml透析盒中，将透析盒在1.5l1xpbs中在+4℃透析1h，并在磁力搅拌器上搅拌。1h后将1xpbs更换为新鲜缓冲液，并在相同条件下继续透析2h。最后，更换新鲜1xpbs并继续透析过夜。透析的rbd的浓度使用nanodrop分光光度计测量280nm处的吸光度，对rbd-c标签使用1.498并对rbd-spy标签-c标签使用1.450的消光系数来确定。将rbd制备物的等分试样储存在-80℃下。从m4169发酵亲和纯化rbd-c标签作为实例在图3a-3b中示出。在western检测中使用sars-cov-2刺突rbd抗体、兔多克隆抗血清(sinobiologicals)和山羊抗兔irdye 680rd(li-cor)。
[0303]
实施例5：蛋白质在thermothelomyces heterothallica c1的不同菌株中的表达和稳定性
[0304]
thermothelomyces heterothallica c1的不同菌株在图4中示出。
[0305]
使用掺加实验来研究蛋白质和抗体的稳定性。添加靶蛋白并在真菌菌株的培养上
清液中温育。在不同时间点获取样品并使用western印迹进行分析。如图5和6中所示，alp7的缺失对抗体稳定性具有正面影响。
[0306]
图7示出了使用纤维蛋白原的掺加实验。在kex2缺陷菌株中发现了提高的稳定性。
[0307]
图8示出了使用fc-fgf21的掺加实验。在kex2和srp10缺陷菌株中发现了提高的稳定性。
[0308]
图9示出了mab在蛋白酶缺陷菌株中的掺加实验和表达。与12x和13x srp10蛋白酶缺陷菌株相比，在13x alp7缺陷菌株中发现了提高的稳定性和蛋白量。当同一mab在13x alp7蛋白酶缺失菌株中表达时，产生更加完整的mab。
[0309]
图10示出了mab在具有kex2或alp7缺失的13x蛋白酶缺失菌株中的表达。与12x亲本菌株相比，在kex2缺失菌株中没有形成27kda降解片段(用箭头标记)。此外，与12x蛋白酶缺陷亲本菌株相比，在13x alp7缺陷菌株中没有产生37kda降解片段。
[0310]
实施例6：rvfv在14x蛋白酶缺陷菌株中的表达
[0311]
在13x蛋白酶缺失菌株dnl150和具有kex2缺失的14x蛋白酶缺失菌株dnl155中，来自于裂谷热病毒的疫苗抗原蛋白与来自相同表达载体的spycatcher结构域表达为融合蛋白。
[0312]
将用rvfv抗原表达载体转化的菌株在24孔板中生长，并使用针对rvfv抗原的抗体通过western印迹分析抗原的产生。
[0313]
如图11中所示，14x蛋白酶缺陷菌株dnl155的转化体显示出rvfv的高表达。表达水平远高于在13x蛋白酶缺陷菌株(dnl150)中。
[0314]
实施例7：rbd-spy标签在14x蛋白酶缺陷菌株中的表达和功能
[0315]
在thermothelomyces heterothallica c1的14x蛋白酶缺陷菌株中，与spy标签融合的sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域的结构形成呈现在图12a-12b中。将所述蛋白质偶联到spycatcher重组乙肝病毒表面抗原(hbsag)病毒样粒子(vlp)疫苗，以研究使用所述产生的蛋白质作为疫苗的可能性。研究了两个批次的c1 rbd-spy标签(#2和#4)。在sds-page凝胶中研究了蛋白质和偶联物的稳定性，然后使用小鼠抗hbsag抗体(1
st ab)和山羊抗小鼠igg-ap(2
nd ab)通过western印迹进行分析。如图12a-12b中所示，rbd-spy标签被高效偶联到spycatcher hbsag vlp。重要的是，偶联或未偶联spycatcher的rbd蛋白能够产生二聚体/三聚体。重组rbd的二聚化和三聚化模拟冠状病毒rbs的天然结构，并预期会产生高效疫苗。
[0316]
接下来，使用cr3022抗体研究了rbd-spy标签与人类ace-2蛋白的结合。如13a-13f中所示，cr3022抗体能够与呈递在vlc粒子上的rbd结合。此外，使用间接elisa显示了偶联的rbd结合hace-2但不结合vlc粒子。合在一起，所述结果显示产生的与spy标签融合的rbd被正确组装，呈递在vlc粒子上，并因此可用作疫苗。
[0317]
实施例8：在c1中生产sars-cov-2受体结合结构域的fc融合蛋白
[0318]
在c1中进行了两种潜在冠状病毒sars-cov-2疫苗蛋白的生产，其中将sars-cov-2s2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)与igg1抗体fc结构域n-端或c-端融合。dna片段编码与c1 bgl8启动子的40bp重叠区、c1 cbh1信号序列、rbd-fc或fc-rbd氨基酸序列的编码区(显示为seq id nos：49和51；所述序列包括信号序列和rbd与fc之间的接头)、终止密码子和与c1的bgl8或chi1终止子的重叠区。所述dna片段的蛋白质编码区显示为seq id nos：50
和52。将与chi1终止子重叠的dna片段克隆到表达构建体(质粒pmyt1055)的5’臂中，并将与bgl8终止子重叠的片段克隆到表达构建体(质粒pmyt1056)的3’臂中。利用gibson组装方法，使用nebuildertmhifi dna组装试剂盒(new england biolabs)，按照制造商的说明书来进行克隆。得到的表达质粒被命名为pmyt1302(rbd-fc 5’臂)、pmyt1303(rbd-fc 3’臂)、pmyt1304(fc-rbd 5’臂)和pmyt1305(fc-rbd 3’臂)。
[0319]
为了构建产rbd-fc的c1菌株，将表达质粒pmyt1302和pmyt1303一起转化到三种不同c1菌株中：dnl155(δalp1δalp2δpep4δprt1δsrp1δalp3δpep1δmtp2δpep5δmtp4δpep6δalp4δalp7δkex2)，dnl157(δalp1δalp2δpep4δprt1δsrp1δalp3δpep1δmtp2δpep5δmtp4δpep6δalp4δalp7δsrp10)和具有10种蛋白酶缺失的糖工程化菌m3599(δalp1δalp2δpep4δprt1δsrp1δalp3δpep1δmtp2δalp6δsrp7)。在转化后，表达构建体的5’和3’臂整合到bgl8座位，并且两个臂中的潮霉素抗性基因重叠片段彼此重组，以在bgl8座位中形成具有两个表达盒的最终表达构建体。转化如visser,v.j等(同上)中所述来进行。选择具有潮霉素抗性的转化体，并使用24孔板培养和western印迹筛选rbd-fc蛋白的产生。western分析使用标准方法来进行，使用1:10 000稀释的抗人类igg f(c)山羊多克隆抗体-irdye700dx偶联物(licor)。信号检测使用licor odyssey荧光计装置进行。结果显示在具有10种蛋白酶缺失的m3599菌株中产生的rbd-fc中只有一小部分具有全长(计算分子量为49.4kda)。在m155和m157菌株中，大多数rbd-fc不被蛋白酶降解并作为完整产物产生(图14a)。这些菌株具有alp7(dnl157)或alp7和kex2(dnl155)蛋白酶缺失。在dnl155中的生产水平明显高于dnl157中。总而言之，alp7和kex2缺失对rbd-fc生产具有有益影响。
[0320]
为了产生表达fc-rbd融合蛋白的菌株，如上为rbd-fc生产菌株的构建所述将质粒pmyt1304和pmyt1305一起转化到dnl155菌株中。如上所述通过western印迹从24孔板培养物分析转化体的fc-rbd(图14b)。检测到几个产生高水平fc-rbd蛋白的转化体。绝大多数产物是完整的。
[0321]
实施例9：用sars-cov-2rbd抗原对小鼠疫苗接种
[0322]
测试了实施例4产生的sars-cov-2刺突蛋白作为疫苗的用途。将所述sars-cov-2rbd抗原注射到k18 hace2转基因小鼠。将两组转基因小鼠用20μg用alhydrogel配制的rbd疫苗接种。初期疫苗接种在第1天(“初免”)和第21天(“加强”)进行。在第42天，将小鼠用2000pfu的sars-cov-2攻击。血清研究揭示出所述抗原产生高滴度的中和抗体。在用sars攻击后2天，所有对照小鼠死亡，而14只疫苗接种的小鼠中的13只存活，几乎没有体重减轻。
[0323]
实施例10：在蛋白酶缺陷的c1菌株中αmhcii-cal07重组抗原的表达
[0324]
在蛋白酶缺陷的c1菌株中表达由mhcii靶向结构域和流感毒株a/california/07/2009(亚型h1n1)的ha抗原组成的重组抗原αmhcii-cal07。所述表达构建体含有编码c1内源cbh1信号序列、mhcii特异性靶向单元、20-aa的接头、源自于流感毒株a/california/07/2009的ha蛋白的第18-541位残基和两侧带有针对c1表达载体的重组序列和mssi限制性酶识别位点的c标签的序列。所述片段由genscript(usa)合成。将基因的密码子用法进行优化以用于在thermothelomyces heterothallicus中表达。通过用限制性酶mssi消化从genscript质粒释放出所述合成的片段，并通过gibson组装(hifi dna组装克隆试剂盒，new england biolabs)方法克隆到c1表达载体pmyt1055的paci位点中，在内源
c1 bgl8启动子和c1 chi1终止子之下。通过对插入到质粒中的片段进行测序来确认构建体的正确序列。序列正确的质粒被给予质粒编号pmyt1242。
[0325]
在第二种情况下，通过pcr从genscript质粒扩增所述合成的片段，并通过gibson组装方法克隆到c1表达载体pmyt0987的paci位点中，在合成anses启动子和内源c1 chi1终止子之下。通过对插入到质粒中的片段进行测序来确认构建体的正确序列。序列正确的质粒被分派质粒编号pmyt1243。
[0326]
将表达载体pmyt1242和完成潮霉素抗性标记基因和向bgl8座位的整合所需的模拟载体配偶体pmyt1140用mssi消化，并共转化到14种蛋白酶基因已缺失的dnl155菌株和10种蛋白酶基因已缺失的m3599菌株。在上述菌株中缺失的蛋白酶列于表5中。转化使用原生质体/peg方法(visser,v.j等(同上))进行，并选择具有nia1+表型和潮霉素抗性的转化体。将转化体在选择培养基平板上划线，并从所述划线接种到24孔板中的液体培养物。培养基组分是：(单位为g/l)葡萄糖5，酵母提取物1，(nh4)2so
4 4.6，mgso4·
7h2o 0.49，kh2po47.48，和(单位为mg/l)edta 45，znso4·
7h2o 19.8，mnso4·
4h2o 3.87，cocl2·
6h2o 1.44，cuso4·
5h2o 1.44，na2moo4·
2h2o 1.35，feso4·
7h2o4.5，h3bo
4 9.9，d-生物素0.004，50u/ml青霉素和0.05mg链霉素。将所述24孔板在35℃和800rpm振摇下温育4天。收集培养上清液并通过western印迹进行分析，所述western印迹使用标准方法，使用第一检测试剂capture select生物素-抗c标签抗体偶联物(thermofisher)和第二试剂irdye 800cw链霉亲和素(li-cor)来进行。对于源自于dnl155菌株的许多αmhcii-cal07转化体，western分析(图15)显示出预期尺寸(87kda)的强信号，确认了所述蛋白质在c1中产生。然而，在源自于m3599的任何转化体中未能检测到预期尺寸的产物。与dnl155来源的转化体相比，m3599来源的转化体中存在的另外的蛋白酶引起产物的蛋白水解降解。
[0327]
通过单菌落铺板纯化产生αmhcii-cal07蛋白的转化体，纯化的克隆通过pcr检测表达盒的正确整合并通过qpcr检测克隆纯度来核实。将一个核实的产αmhcii-cal07的转化体作为甘油储用物储存在-80℃下，并给予菌株编号m4540。
[0328]
以与上文为pmyt1242所述相同的方式将c1菌株dnl155用mssi消化的带有由合成的anses启动子控制的αmhcii-cal07构建体的表达载体pmyt1243和模拟载体配偶体pmyt1141进一步共转化，从24孔板培养物分析转化体(图15)，并通过单菌落铺板进行纯化。在pcr核实后，将一个产αmhcii-cal07的c1转化体克隆储存在-80℃下，并给予菌株编号m4543。
[0329]
另外，以与上文为dnl155所述相同的方式，将缺失了14种蛋白酶基因并缺失了编码多萜醇-p-man依赖性α(1-3)甘露糖基转移酶的alg3基因的c1菌株m4621用mssi消化的表达载体pmyt1243和模拟载体pmyt1141共转化。alg3基因的缺失引起附连到糖蛋白的n-聚糖的结构的变化，导致向具有更少甘露糖残基的更小n-聚糖物质转变。将在这种转化后得到的转化体在24孔板中的液体培养基中，在35℃和800rpm振摇下培养4天。收集培养上清液并通过western印迹进行分析，所述western印迹使用标准方法，使用第一检测试剂capture select生物素-抗c标签抗体偶联物(thermofisher)和针对流感毒株a/california/07/2009的ha抗原产生的鼠类单克隆抗体29e3(manicassamy等，2010；plos pathog 6(1):e1000745.doi:10.1371/journal.ppat.1000745)和第二试剂irdye 680rd链霉亲和素(li-cor)和irdye 800cw山羊抗小鼠igg第二抗体(li-cor)来进行。western分析显示对于许多
转化体来说存在预期尺寸(87kda)的信号，确认了所述蛋白质在m4621来源的转化体中产生(数据未示出)。
[0330]
表5-c1蛋白酶缺陷菌株中缺失的c1蛋白酶
[0331][0332]
将产生αmhcii-cal07重组蛋白的c1菌株m4540在0.25l生物反应器中，以分批补料方法在含有酵母提取物作为有机氮源和葡萄糖作为碳源的培养基中培养。所述培养在38℃下进行7天。在培养结束后，将发酵液储存在-80℃下。对于通过c标签亲和层析进行的αmhcii-cal07纯化来说，将50ml液体培养物在冰上融化，并在融化后将样品通过在+4℃下3x 20min 20000
×
g离心进行澄清，然后通过0.45μm滤器过滤。将33ml透明上清液用1xpbs/0.5m nacl(12mm na2hpo
4 2h2o，3mm nah2po
4 h2o，650mm nacl ph 7,3)稀释到终体积为100ml。c标签亲和纯化使用附连到start蛋白纯化系统(cytiva)的1ml captureselect c标签xl柱(thermo fisher)进行，并以1ml/min的流速操作。在载样前首先将柱用5倍柱体积(cv)的1
×
pbs/0.5m nacl平衡。在载样后，将柱用15cv的1
×
pbs/0.5m nacl清洗，然后用10cv的20mm tris-hcl，2m mgcl2，1mm edta ph7.5的一步梯度进行洗脱，级分体积为1ml。洗脱的αmhcii-cal07的量通过用包含在start系统中的unicorn 1.0软件对洗脱峰的uv迹线进行积分来定量。在计算αmhcii-cal07的量中使用1.7的消光系数。在洗脱后，将柱用5cv的0.1m甘氨酸ph 2.3再生，并用1
×
pbs清洗直至达到ph7.3。将含有蛋白质的洗脱级分合并用于透析步骤，以将洗脱缓冲液交换成1
×
pbs缓冲液。将合并的级分装入12ml透析盒中，将透析盒在1.5l 1
×
pbs中在+4℃透析1h，并在磁力搅拌器上搅拌。1h后将1
×
pbs更换为新鲜缓冲液，并在相同条件下继续透析2h。最后，更换1
×
pbs并继续透析过夜。透析的αmhcii-cal07的浓度使用nanodrop分光光度计测量280nm处的吸光度并使用1.7的消光系数来确定。将rbd制备物的等分试样储存在-80℃下。从m4540发酵上清液亲和纯化αmhcii-cal07作为实例在图16a-16c中示出。在western检测中使用第一试剂captureselect生物素-抗c标签抗体偶联物(thermofisher)和针对流感ha抗原产生的鼠类单克隆抗体29e3和第二试剂irdye 680rd链霉亲和素(li-cor)和irdye 800cw山羊抗小鼠igg第二抗体(li-cor)。
[0333]
实施例11：sars-cov-2rbd变体在14种蛋白酶缺陷的c1菌株中的表达
[0334]
在蛋白酶缺陷的c1菌株dnl155中表达sars-cov-2刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)的三种变体。所述三种变体是：1)具有n501y突变的rbd_b.1.1.7-uk，2)具有k417n、e484k和n501y突变的rbd_b.1.351-sa，和3)具有k417t、e484k和n501y突变的rbd_1.1.28.1(p.1)-br。每种变体的片段由genscript(usa)合成，并使用wuhan rbd的优化序列(在实施
例4的pmyt1142中)作为基础，从其将突变的氨基酸用c1中最频繁的密码子代替。所述合成的片段的设计类似于带有c标签的wuhan rbd(在实施例4的pmyt1142中使用)，区别在于rbd变体与c标签之间的gly/ser接头长为3个氨基酸，而在wuhan rbd-c标签中所述接头长为5个氨基酸。变体rbd在c1中作为两个基因拷贝表达，并且为了在同一基因组座位中进行双拷贝表达，为每种变体制造了两个质粒构建体(5’臂和3’臂)，两者均带有一个基因拷贝。在c1细胞中，5’臂和3’臂质粒中的选择标记片段之间的重组使所述标记基因有功能，并且能够使所述转化体在选择下生长。对于5’臂质粒来说，通过pcr从genscript质粒扩增合成的片段，并通过gibson组装(hifi dna组装克隆试剂盒，new england biolabs)方法克隆到c1表达载体pmyt1055的paci位点中，在内源c1 bgl8启动子和c1 chi1终止子之下。通过对插入到质粒中的片段进行测序确认了构建体的正确序列。序列正确的质粒分别给予质粒编号pmyt1572(对于rbd_b.1.1.7-uk来说)、pmyt1574(对于rbd_b.1.351-sa来说)和pmyt1576(对于rbd_1.1.28.1(p.1)-br来说)。对于3’臂质粒来说，将在genscript质粒中的合成片段用mssi限制性酶切下，并通过gibson组装(hifi dna组装克隆试剂盒，new england biolabs)方法克隆到c1表达载体pmyt1056的paci位点中，在内源c1 bgl8启动子和c1 bgl8终止子之下。序列正确的质粒分别给予质粒编号pmyt1573(对于rbd_b.1.1.7-uk来说)、pmyt1575(对于rbd_b.1.351-sa来说)和pmyt1577(对于rbd_1.1.28.1(p.1)-br)来说。
[0335]
对于双拷贝表达来说，将5’臂和3’臂质粒两者用mssi消化，并将带有相同变体基因的质粒共转化到已缺失14种蛋白酶基因的dnl155菌株。选择dnl155作为宿主菌株是因为在几种c1蛋白酶缺失菌株中测试了wuhan rbd的生产(实施例4)，并在均为具有kex2缺失的14种蛋白酶缺失菌株的dnl155和dnl159菌株中产量最高。与wuhan rbd(实施例4)相同通过24孔培养进行了转化和转化体的筛选，区别在于将培养上清液通过同时使用两种第一检测试剂的western印迹进行分析：sars-cov-2(2019-ncov)刺突rbd抗体，兔多克隆抗血清(sinobiologicals目录号40592-t62)，和capture select生物素-抗c标签抗体偶联物(thermofisher)。第二检测试剂是山羊抗兔irdye680rd(li-cor)和irdye 800cw链霉亲和素(li-cor)。图17示出了使用每种rbd变体的至少一个阳性转化体获得的western印迹结果的实例。使用两种第一抗体均检测到预期尺寸的强信号，并且变体rbd-c标签蛋白的生产水平似乎等于产生wuhan rbd-c标签的m4169对照菌株。
[0336]
rbd_b.1.1.7-uk的氨基酸序列阐述在seq id no：53中，dna序列阐述在seq id no：54中。所述序列包括信号序列、gly/ser接头和c标签。
[0337]
rbd_b.1.351-sa的氨基酸序列阐述在seq id no：55中，dna序列阐述在seq id no：56中。所述序列包括信号序列、gly/ser接头和c标签。
[0338]
rbd_1.1.28.1(p.1)-br的氨基酸序列阐述在seq id no：57中，dna序列阐述在seq id no：58中。所述序列包括信号序列、gly/ser接头和c标签。
[0339]
特定实施方式的上述描述充分揭示了本发明的总体性质，使得其他人可以不需过多实验并且不背离一般性概念，通过应用当前知识容易地修改和/或改编此类特定实施方式以适用于各种不同应用，因此，此类改编和修改应该并且旨在涵盖在所公开的实施方式的等同物的含义和范围之内。应该理解，本文中使用的短语或术语是出于描述而不是限制的目的。用于执行各种公开的功能的手段、材料和步骤可以采取各种不同的替代形式，而不
背离本发明。