具有主动补偿的电穿孔的制作方法

具有主动补偿的电穿孔
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
120要求于2020年7月22日提交的美国专利申请序列号16/935,987的优先权，该美国专利申请的全部内容通过援引并入本文。
技术领域
3.本披露内容涉及具有主动补偿的电穿孔。


背景技术：

4.本节提供与本披露内容相关的背景信息，该信息不一定是现有技术。
5.转染通常用于将核酸引入细胞以产生基因修饰的细胞。存在用于转染细胞的多种物理、化学和病毒方法，包括光电穿孔、利用磷酸钙的基于聚合物的方法、显微注射、电穿孔、病毒转导和脂质介导的方法(例如，使用脂质体-dna复合物)。当使用电穿孔来转染细胞时，将受控制的直流(dc)电脉冲施加到细胞以产生跨膜电位。这个跨膜电位引起细胞膜的有序结构的可逆破坏，从而导致在膜中形成孔。然后，感兴趣的分子可以通过孔进入细胞。可以通过调整各种参数来控制孔形成，这些参数包括在电穿孔过程中使用的平行电极之间的距离、电脉冲的特性、跨电极的电场强度等。


技术实现要素：

6.本节提供了本披露内容的总体概要，而并不是对其全部范围或所有特征的全面披露。
7.根据本披露内容的一个方面，提出了一种用负载物电穿孔细胞的装置。该装置包括：两个电极，该两个电极彼此间隔开并且为包括这些细胞和该负载物的流体在其间流动限定路径；dc电源，该dc电源跨这些电极耦合；以及控制电路。当流体流动经过该路径时，这些电极之间具有电阻。该控制电路被配置成：控制该dc电源以一定电压向这些电极提供多个电脉冲，以产生经过这些电极的电流，从而在这些电极之间以定义值生成电场；检测由于这些电极之间的电阻增大导致的所产生电流的减小；以及控制该dc电源以增大该所产生电流，从而将这些电极之间的电场维持在该定义值。
8.根据本披露内容的另一方面，提出了一种用负载物电穿孔细胞的装置。该装置包括：两个电极，该两个电极彼此间隔开并且为包括这些细胞和该负载物的流体在其间流动限定路径；dc电源，该dc电源跨这些电极耦合以提供多个电脉冲，以产生经过这些电极的电流，从而在这些电极之间生成电场；以及控制电路，该控制电路被配置成：检测与该流体相关联的第一参数；响应于检测到与该流体相关联的该第一参数，控制该dc电源以生成该多个电脉冲；检测与该流体相关联的第二参数；以及响应于检测到与该流体相关联的该第二参数，控制该dc电源以停止生成该多个电脉冲。
9.根据本披露内容的另一方面，提出了一种用负载物电穿孔细胞的装置。该装置包括：两个电极，该两个电极彼此间隔开并且为包括这些细胞和该负载物的流体在其间流动
限定路径；dc电源，该dc电源跨这些电极耦合；以及控制电路。当流体流动经过该路径时，这些电极之间具有电阻。该控制电路被配置成：控制该dc电源以一定电压向这些电极提供多个电脉冲，以产生经过这些电极的电流，从而在这些电极之间以定义值生成电场；检测由于这些电极之间的电阻增大导致的所产生电流的减小；在一段时间内确定这些电极之间的电阻的多个值；基于该电阻的所确定的多个值来预测这些电极之间的电阻的未来值；以及基于该电阻的未来值控制该dc电源以增大该所产生电流，从而将这些电极之间的电场维持在该定义值。
10.根据本披露内容的另一方面，提出了一种用负载物电穿孔细胞的方法。该方法包括使包括这些细胞和该负载物的流体在由彼此间隔开的两个电极限定的路径中流动。当流体流动经过该路径时，这些电极之间具有电阻。该方法进一步包括：控制该dc电源以一定电压向这些电极提供多个电脉冲，以产生经过这些电极的电流，从而在这些电极之间以定义值生成电场；检测由于这些电极之间的电阻增大导致的所产生电流的减小；以及控制该dc电源以增大该所产生电流，从而将这些电极之间的电场维持在该定义值。
11.根据本披露内容的另一方面，提出了一种用负载物电穿孔细胞的方法。该方法包括：使包括这些细胞和该负载物的流体在由彼此间隔开的两个电极限定的路径中流动；检测与该流体相关联的第一参数；响应于检测到与该流体相关联的该第一参数，控制dc电源以生成多个电脉冲，以产生经过这些电极的电流，从而在这些电极之间生成电场；检测与该流体相关联的第二参数；以及响应于检测到与该流体相关联的该第二参数，控制dc电源以停止生成该多个电脉冲。
12.根据本披露内容的另一方面，提出了一种用负载物电穿孔细胞的方法。该方法包括使包括这些细胞和该负载物的流体在由彼此间隔开的两个电极限定的路径中流动。当流体流动经过该路径时，这些电极之间具有电阻。该方法进一步包括：控制该dc电源以一定电压向这些电极提供多个电脉冲，以产生经过这些电极的电流，从而在这些电极之间以定义值生成电场；检测由于这些电极之间的电阻增大导致的所产生电流的减小；在一段时间内确定这些电极之间的电阻的多个值；基于该电阻的所确定的多个值来预测这些电极之间的电阻的未来值；以及基于该电阻的未来值控制该dc电源以增大该所产生电流，从而将这些电极之间的电场维持在该定义值。
13.进一步的方面和应用领域将从本文提供的描述中变得显而易见。应当理解，本披露的各方面可以单独实施或与一个或多个其他方面组合实施。还应当理解，本文中的描述和具体示例仅旨在用于说明的目的而并非旨在限制本披露内容的范围。
附图说明
14.本文所描述的附图仅用于说明选定实施例的目的而并非所有可能的实施方式，并且不旨在限制本披露内容的范围。
15.图1是根据本披露内容的一个示例实施例的采用主动补偿来维持电场强度的电穿孔装置的框图。
16.图2至图3是示出了根据另一示例实施例的当未应用主动补偿时提供到电穿孔装置的电极的电压、经过电极的所产生电流以及导致电场强度降级的电极之间增大的电阻的图表。
17.图4是示出了根据另一示例实施例的不具有主动补偿的不同电穿孔过程的电场强度的降级的图表。
18.图5是示出了根据另一示例实施例的经过采用主动补偿的电穿孔装置的电极的所产生电流的图表。
19.图6至图7是示出了根据另一示例实施例的采用
‘
全部数据’线性投影的预测性补偿技术的图表。
20.图8至图9是示出了根据另一示例实施例的采用
‘
移动窗口’线性投影的预测性补偿技术的图表。
21.图10是示出了根据另一示例实施例的当采用不同预测性补偿技术时的电场强度的图表。
22.图11是示出了根据另一示例实施例的当应用不同补偿技术时的生物性能结果的图表。
23.图12是根据另一示例实施例的电穿孔装置的框图，该电穿孔装置包括电极以及用于检测电极之间何时存在流体的(多个)传感器。
24.图13是图12的电穿孔装置中的流体流动的框图。
25.图14是根据另一示例实施例的可在图1的电穿孔装置中采用的电极的框图。
26.图15是根据另一示例实施例的可在图1的电穿孔装置中采用的电源和控制电路的框图。
27.在附图的全部视图中，对应的附图标记指示对应的(但不一定是相同的)部分和/或特征。
具体实施方式
28.示例实施例被提供以使得本披露将是详尽的，并且将向本领域技术人员充分地传达本发明的范围。阐述了许多特定细节，比如特定部件、装置和方法的示例，以提供对本披露内容的实施例的透彻理解。对于本领域技术人员而言显而易见的是，不需要采用特定细节，示例实施例可以以许多不同的形式体现，并且都不应该被解释为限制本披露的范围。在一些示例实施例中，未详细描述众所周知的过程、众所周知的装置结构和众所周知的技术。
29.本文所使用的术语仅用于描述具体示例实施例的目的，而不旨在是限制性的。如本文所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”也可以旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(including)”和“具有”是包含性的，并且因此指定所叙述的特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但是不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、部件和/或它们的组的存在或添加。本文所描述的方法步骤、过程和操作不应被解释为一定要求它们以所讨论或图示的特定顺序执行，除非被具体标识为一定执行顺序。还应当理解，可以采用附加的或替代的步骤。
30.尽管本文可以使用术语第一、第二、第三等来描述各种元件、部件、区域、层和/或部分，但是这些元件、部件、区域、层和/或部分不应该受这些术语的限制。这些术语可以仅用于将一个元件、部件、区域、层或部分与另一个区域、层或部分区分开。比如“第一”、“第二”之类的术语和其他数字术语在本文中使用时并不暗示序列或顺序，除非上下文明确指
出。因此，下面讨论的第一元件、部件、区域、层或部分可以被称为第二元件、部件、区域、层或部分，而不脱离示例实施例的教导。
31.为了便于描述，比如“内部”、“外部”、“之下”、“下方”、“下部”、“上方”、“上部”等空间相关的术语可以在本文中用于描述如在附图中所展示的一个元件和特征与另一个(一些)元件或特征的关系。除了附图中描绘的取向之外，空间相关术语可以旨在涵盖装置在使用或操作中的不同取向。例如，如果将附图中的装置翻转，则被描述为在其他元件或特征“下方”或“之下”的元件将被定向为在其他元件或特征“上方”。因此，示例术语“下方”可以涵盖上方和下方取向两者。装置可以以其他方式定向(旋转90度或以其他取向)，并且本文所使用的空间相关描述符可以被相应地解释。
32.现在将参考附图更全面地描述示例实施例。
33.图1中展示了根据本披露内容的一个示例实施例的用负载物电穿孔细胞的装置，并且通常由附图标记100指示。如图1中所示出的，装置100包括两个电极102、104、跨电极耦合的dc电源106、以及控制电路108。电极102、104彼此间隔开并且为包括细胞112和负载物110的流体在其间流动限定路径(通常用箭头f示出)。电极之间具有电阻r
芯片
。控制电路108进行以下操作：控制dc电源106以一定电压v
ps
向电极102、104提供直流(dc)电脉冲，以产生经过电极102、104的电流i
芯片
，从而在电极102、104之间生成电场e；检测由于电极之间的电阻r
芯片
增大导致的所产生电流i
芯片
的减小；并且控制dc电源106以增大所产生电流i
芯片
以将电极102、104之间的电场e维持在定义值。
34.例如，电极102、104和相关联的部件可以形成芯片。电极102、104和在电极102、104之间流动的流体可以具有电阻r
芯片
(例如，当存在流体时芯片的电阻)。在这样的示例中，电阻r
芯片
至少等于流体的电阻rb、以及流体与电极102、104的表面之间的界面电阻ri。如图1中所示出的，电场e表示当dc电源106以电压v
ps
(例如，经调节电压)提供电脉冲时跨流体(例如，在电极102、104之间)生成的有效电场。在图1的特定示例中，电场e等于跨电极102、104的电压v
芯片
(例如，电压v
ps
减去任何电压降)除以电极102、104之间的距离。
35.通过增大穿过电极102、104的所产生电流i
芯片
，可以维持并且在一些示例中改善在电穿孔期间的转染效率。例如，在电穿孔期间，电阻r
芯片
可以作为由dc电源106提供的电脉冲的数量的函数随时间增大。在一些示例中，电阻r
芯片
增大可能是由(多个)界面电阻ri的增大导致的。在这样的示例中，电阻增大可以是由于例如带电分子、dna、蛋白质等附接到电极102、104的表面从而导致电极钝化、电极降级等。由于电阻r
芯片
增大，所产生电流i
芯片
可能下降并且跨在电极102、104之间流动的流体的有效电场e可能减小。因此，转染效率可能随时间降低，如下文中进一步所解释的。然而，如果流动经过芯片的所产生电流i
芯片
增大并且在一些示例中通过主动补偿(例如，如下文中进一步所解释的)维持在定义值，则可以维持并且在一些示例中改善跨流体的有效电场和在电穿孔期间的转染效率。
36.图2和图3展示了示出当未采用主动补偿时在电穿孔期间的与图1的电极102、104相关联的电特性的图表200、300。在图2和图3的特定示例中，电特性与用包含对α-ctla-4/txm-b融合蛋白质(例如，负载物)进行编码的dna的表达质粒转染cho-s细胞相关，如本文在示例1中所描述的。
37.具体地，图2展示了图1的与芯片相关联的电阻r
芯片
(线202)以及跨流体的电场e(线204)。图3展示了流动经过芯片的所产生电流i
芯片
(线302)以及跨电极102、104的电压v
芯片
(线
304)。测试已表明电阻r
芯片
(线202)随着由dc电源106提供的电脉冲的数量增加而增大。这个电阻增大在流体进入电极102、104之间的路径(例如，腔室)时开始。在图2的特定示例中，电阻r
芯片
在第七脉冲周围开始增大，如由线206所示出的(例如，当降级开始时)。当电阻随时间增大时，流动经过芯片的所产生电流i
芯片
(线302)减小并且电压v
芯片
(线304)增大，如图2和图3中所示出的。在这个时间期间，电场e(线204)在线206处开始减小并且继续降级，直到电穿孔过程在线208处结束。
38.图4展示了包括表示四个实验电穿孔过程p1、p2、p3、p4的电场的线402、404、406、408的图表400，这些实验电穿孔过程用于用包含对α-ctla4/txm-b融合蛋白质(例如，负载物)进行编码的dna的表达质粒通过不同数量的脉冲转染cho-s细胞，如本文在实施例2中所描述的。具体地，线402(具有实线配置)表示在电穿孔过程p1期间的电场，线404(具有短划-短划配置)表示在电穿孔过程p2期间的电场，线406(具有短划-点-短划配置)表示在电穿孔过程p3期间的电场，并且线408(具有点-点线配置)表示在电穿孔过程p4期间的电场。参见本文中的实施例2。
39.如图4和下文表1中所示出的，当在电极102、104之间通过的流体的体积增大时，有效电场经历更大的减小。流体的体积与在每个电穿孔过程p1、p2、p3、p4期间接收到的电脉冲数量相关。例如，当过程p1在线410处结束时，电穿孔过程p1处理120微升(μl)的流体(例如，大约60次脉冲的持续时间)；当过程p2在线412处结束时，电穿孔过程p2处理240μl的流体(例如，大约83次脉冲的持续时间)；当过程p3在线414处结束时，电穿孔过程p3处理400μl的流体(例如，大约125次脉冲的持续时间)；以及当过程p4在线416处结束时，电穿孔过程p4处理600μl的流体(例如，大约155次脉冲的持续时间)。
[0040][0041][0042]
如图4中所示出的，与电穿孔过程p1、p2、p3、p4相关联的有效电场(线402、404、406、408)在大约第20次脉冲至第25次脉冲处开始降级。在这个时间处的每个有效电场的值是大约1.31kv/cm，如上文在表1中所示出的。当电穿孔过程p1、p2、p3、p4结束时，与过程p1相关联的电场(即，线402)是0.9kv/cm，与过程p2相关联的电场(即，线404)是0.71kv/cm，与过程p3相关联的电场(即，线406)是0.54kv/cm，并且与过程p4相关联的电场(即，线408)是0.46kv/cm，如在图4中和上文在表1中所示出的。如此，在电穿孔过程p1期间经历的电场具有31％的百分比变化，在电穿孔过程p2期间经历的电场具有46％的百分比变化，在电穿孔
过程p3期间经历的电场具有58％的百分比变化，并且在电穿孔过程p4期间经历的电场具有65％的百分比变化，如上文在表1中所示出的。因此，随着使更多流体在电极102、104之间通过，有效电场经历更大的减小。
[0043]
另外，随着在电极102、104之间通过的流体的体积增大(例如，电脉冲的数量增加)，与电穿孔过程p1、p2、p3、p4相关联的产率可能减小。例如，并且如上文在表1中所示出的，电穿孔过程p1的滴度在第4天是34.5μg/ml，电穿孔过程p2的滴度在第4天是24.7μg/ml，电穿孔过程p3的滴度在第4天是27.2μg/ml，并且电穿孔过程p4的滴度在第4天是22μg/ml。如此，当与电穿孔过程p1、p2、p3、p4相关联的电场降级时，用α-ctla4/txm-b蛋白质转染的cho-s细胞的浓度减小，如在图4中所示出的。因此，转染效率可能随着电场e减小而降低。
[0044]
然而，通过确保跨流体的有效电场是足够的，可以贯穿电穿孔过程将转染效率维持在期望的水平。例如，并且参考图1，控制电路108可以用电流传感器114监测经过电极102、104的所产生电流i
芯片
。在这样的示例中，控制电路108可以监测电流i
芯片
以检测电流峰值。当检测到电流i
芯片
的减小时(例如，当电流i
芯片
达到电流峰值并且下降时)代表有效电场e的降级，控制电路108控制dc电源106以将电流i
芯片
增大并维持在定义值，比如电流峰值、低于电流峰值的期望值等。因此，在这个特定示例中，响应于检测到由dc电源106提供的电流减小，控制电路108控制dc电源106以将电流i
芯片
维持在定义值(例如，开始补偿过程)。
[0045]
在其他示例中，控制电路108可以用电压传感器116监测跨电极102、104的电压v
芯片
，并且响应于电压v
芯片
等于或大于定义电压阈值而控制dc电源106以将电流i
芯片
维持在定义值。例如，当发生有效电场e的降级时，电压v
芯片
可以开始增大，如上文所解释的。在这样的示例中，控制电路108可以通过将电压与定义的进行电压阈值比较来检测电压v
芯片
何时开始增大。响应于电压v
芯片
达到或超过定义的电压阈值，控制电路108可以控制dc电源106以将电流i
芯片
维持在定义值，如本文所解释的。
[0046]
所产生电流i
芯片
可以通过主动补偿电流损失来维持。例如，电流i
芯片
可以通过调整由dc电源106提供的电压v
ps
和/或所产生电流i
芯片
来维持。可以在电穿孔过程期间一次或多次地(例如，基于感测到的参数随机地或周期性地等)调整电压v
ps
和/或电流i
芯片
。在一些示例中，可以将电压v
ps
和/或电流i
芯片
调整到固定常数值。在其他示例中，可以根据期望的正/负斜率、根据数学表达式(例如，多项式函数)等调整电压v
ps
和/或电流i
芯片
。例如，可以控制dc电源106以提供不同(例如，更高)电流以补偿减小的电流。在其他示例中，可以控制dc电源106以提供不同电压以补偿减小的电流。在这样的示例中，可以改变由dc电源106提供的电压。例如，控制电路108可以控制dc电源106将电压增大到电压峰值，将电压调节为处于不同设置值等。
[0047]
例如，在给出供应给芯片的芯片电压v
芯片
的情况下，流动经过图1的芯片的所产生电流i
芯片
是总芯片电阻r
芯片
的函数。在这样的示例中，下文中的等式(1)表示这个关系。如上文所解释的，电阻r
芯片
可以作为由dc电源106提供的电脉冲数量的函数而增大，如下文在等式(2)中所示出的。由于电阻r
芯片
增大，因此电流i
芯片
随时间减小。
[0048]
等式(1)v芯片＝i芯片
·
r芯片
[0049]
等式(2)r芯片＝r(脉冲数量)
[0050]
可以基于定义的参数来控制dc电源106以补偿减小的电流i
芯片
。例如，当控制电路108检测到电流i
芯片
的减小时，控制电路108可以控制dc电源106以将电流i
芯片
维持在定义值，
比如峰值电流i
峰值
，如下文在等式(3)中所示出的。在这样的示例中，如果期望dc电源106提供处于峰值的电流i
芯片
，则等式(3)可以被修改成下文的等式(4)。当电流i
芯片
维持在其峰值(例如，常数)时，需要电压随着电阻增大而增大。在一些示例中，控制电路108可以控制dc电源106以将电脉冲的电压增大到电压峰值v
峰值
或另一合适的值。
[0051]
等式(3)v
峰值
＝i
峰值
·
r0
[0052]
等式(4)v
峰值
/r0＝i
峰值
＝v(脉冲数量)/r(脉冲数量)
[0053]
因此，为了将电流i
芯片
维持在其常数峰值，由dc电源106提供的经调节电压v
ps
可以基于作为电脉冲的数量和定义的电流水平(例如，电流峰值)的函数而变化的电阻来增大到设置值v
set
，如下文在等式(5)中所示出的。
[0054]
等式(5)v
set
＝i
峰值
·
r(脉冲数量)
[0055]
图5展示了示出随时间变化的图1的所产生电流i
芯片
的图表500。例如，图表500被划分成五个阶段：(1)电穿孔过程的开始，(2)流体在电极102、104之间流动，(3)降级，(4)电流补偿，以及(5)电穿孔过程的完成。如图5中所示出的，当流体在电极102、104之间流动时，电流i
芯片
增大到峰值。当控制电路108检测到电流i
芯片
的减小时(在降级阶段的开始)，由dc电源106提供的电压v
ps
增大到设置值v
set
。因此，在补偿阶段期间，电流i
芯片
增大到峰值并且维持在峰值(或另一合适的定义值)并且直到电穿孔过程结束，如在图5中所示出的。如果电压v
ps
未增大，则电流i
芯片
减小，如上文所解释的。
[0056]
可能需要所产生电流i
芯片
在补偿开始之前超过阈值。例如，并且如在图5中所示出的，可能需要所产生电流i
芯片
在控制电路108控制dc电源106以增大电流芯片之前超过补偿阈值，如本文所解释的。这可以防止控制电路108当所产生电流i
芯片
由于在流体进入腔室时的噪声而达到峰值时过早地开始补偿阶段。
[0057]
在一些示例中，电流i
芯片
可以基于响应补偿技术来增大和/或维持在定义值(例如，电流峰值)。在这样的示例中，图1的控制电路108可以确定电阻r
芯片
的增大并且然后基于电极102、104之间的电阻的确定增大来控制dc电源106以增大和/或维持所产生电流i
芯片
。确定电阻变化并且基于该电阻变化来控制dc电源106的这个过程可以根据需要进行重复。例如，当期望将电流i
芯片
维持在其电流峰值时，可以基于系统电压v
sys
和系统电阻r
sys
(例如，电阻r
芯片
和任何寄生电阻)来确定电流峰值，如下文在等式(6)中所示出的。在这样的示例中，如果电阻r
sys
由于降级而增大(如上文所解释的)，则电压v
sys
增大并且电流i
芯片
保持恒定在电流峰值。可以基于电压和电流的测量值来确定电阻r
sys
，如下文在等式(7)中所示出的。
[0058]
等式(6)v
sys
＝i
峰值
·rsys
[0059]
等式(7)r
sys
＝v
meas
/i
meas
[0060]
如上文所解释的，控制dc电源106以将电流i
芯片
维持在电流峰值。例如，可以改变电压vsys以维持电流i
芯片
。在这样的示例中，当使用上文的等式(6)和(7)时，可以基于变化的电阻来确定新系统电压v
sys
，new，如下文在等式(8)中所示出的。当电阻r
sys
继续随时间变化时，可以多次地改变电压v
sys
(例如，v
sys
，new1、v
sys
，new2等)。
[0061]
等式(8)v
sys
，new＝i
峰值
·
(v
meas
/i
meas
)
[0062]
在一些示例中，在控制电路108开始电流补偿阶段之前，电流i
芯片
可能呈向下趋势，如在图5中所示出的。在这样的示例中，投影的电压和电流可以用于第一补偿值(而不是电压和电流的测量值)，如下文在等式(9)中所示出的。
[0063]
等式(9)v
sys
，new＝i
峰值
·
(vprojected/iprojected)
[0064]
另外地，可以引入反馈增益因子以考虑系统的运动学。例如，可以用下文的等式(10)确定新电压v
sys
，new的值与电压v
sys
，previous的先前值之间的电压差δv。在这样的示例中，可以控制dc电源106以提供基于电压差δv和反馈增益因子g来设置的设置电压v
sys
，set，如下文在等式(11)中所示出的。反馈增益因子g可以是固定值或可变值，比如从先前补偿结果(基于线上计算、线下数据库等)机器学习到的值等。
[0065]
等式(10)δv＝v
sys
，new-v
sys
，previous
[0066]
等式(11)v
sys
，set＝g
·
δv
[0067]
在其他示例中，所产生电流i
芯片
可以基于预测性补偿技术来增大和/或维持在定义值(例如，电流峰值)。在这样的示例中，图1的控制电路108可以预测电极102、104之间的电阻r
芯片
的未来值，并且然后基于电阻的所预测值来控制dc电源106以将电流i
芯片
增大和/或维持在定义值(例如，电流峰值)。例如，控制电路108可以多次地确定电极102、104之间的电阻r
芯片
(例如，变化电阻的值)，并且在确定的电阻之间应用线性投影以预测电阻的未来值。可以基于例如
‘
全部数据’线性投影或
‘
移动窗口’线性投影来应用线性投影，如下文中进一步地解释的。
[0068]
例如，图6展示了包括芯片电阻r
芯片
(线602)的测量值以及基于
‘
全部数据’线性投影来应用的线性投影(线604)的图表600。在这个示例中，假设芯片电阻r
芯片
在整个降级周期中作为由dc电源106提供的电脉冲的数量的函数线性地增大。在这个特定示例中，控制电路108在检测到两个连续脉冲处的电流减小之后确定电流峰值。在峰值电流处，确定芯片电阻r
芯片
的值(在线602的点606处)。例如，可以基于电流和电压的测量值来确定峰值电流处的芯片电阻r
芯片
的值，如上文所解释的。这个电流峰值与芯片电阻r
芯片
在开始增大之前在降级期间的最小值相对应。在峰值电流(并且最小电阻)处，脉冲点值p被设置为等于0。在电流减小的两个连续脉冲之后，再次确定芯片电阻r
芯片
的值(在线602的点608处)。在这个电流处，脉冲点值p被设置为等于n。
[0069]
接下来，可以从点606处的脉冲点值p＝0(峰值电流)到点608处的脉冲点值p＝n(最近脉冲点)应用(例如，线性地拟合)线性投影(虚线604)。这个线性投影可以用于预测由于电极降级导致的下一个脉冲(例如，脉冲点值p＝n+1)处的电阻(r_n+1)的未来值。这被示出为线性投影线604上的点610。在预测电阻(r_n+1)之后，可以基于所预测的电阻值和电流i
芯片
的定义值(例如，电流峰值)来控制电源106以提供新电压v
sys
，new，如下文在等式(12)中所示出的。
[0070]
等式(12)v
sys
，new＝i
峰值
·
r_n+1
[0071]
可以根据需要来重复
‘
全部数据’线性投影过程(例如，直到电穿孔过程的结束)，以预测下一个脉冲处的电阻(r_n+2、r_n+3)并且确定将电流i
芯片
维持在定义值所需要的电压。例如，图7展示了示出应用多个线性投影(例如，虚线702a至702n)以预测未来脉冲处的电阻值的图表700。通过使用图6和图7中示出的
‘
全部数据’线性投影，所应用的线性投影以及因此电阻的所预测值可以更不容易受到由于当确定电阻值时经历的噪声导致的不稳定电压变化影响。然而，如果芯片电阻r
芯片
非线性地变化(例如，非线性降级)，则使用
‘
全部数据’线性投影方法可能无法提供准确的预测。
[0072]
图8展示了包括芯片电阻r
芯片
的测量值(线802)以及基于
‘
移动窗口’线性投影来应
用的线性投影(线804)的图表800。在这个示例中，假设芯片电阻r
芯片
在局部间隔内线性地增大(例如，分段线性增大)。在
‘
移动窗口’投影方法中，图1的控制电路108在检测到两个连续脉冲处的电流减小之后确定电流峰值。在峰值电流处，确定(例如，测量等)芯片电阻r
芯片
的值。线802上的这个电阻值被识别为点806。在峰值电流处，脉冲点值p被设置为等于0。在初始电阻值之后(例如，在p＝0之后)一次或多次地确定芯片电阻r
芯片
的值。在图8的特定示例中，控制电路108确定在线802的点808处的芯片电阻r
芯片
的值(与脉冲点值p＝n-1相对应)，以及在线802的点810处的芯片电阻r
芯片
的值(与脉冲点值p＝n相对应)。在其他示例中，控制电路108可以确定芯片电阻的更多或更少值。
[0073]
接下来，可以从脉冲点值p＝n-m到脉冲点值p＝n(最近的脉冲点)应用(例如，线性地拟合)线性投影(线804)，其中，m是分段的数据长度(例如，在局部间隔内的定义数量的电脉冲)。在图8的示例中，m等于3(例如，点806、808、810)，并且点810是最近的脉冲点。因此，在这个特定示例中，线性投影线性地拟合在点806(例如，p＝n-m)与点810(例如，p＝n)之间，如在图8中所示出的。这个线性投影然后可以用于预测下一个脉冲处的电阻(r_n+1)的未来值(例如，脉冲点值p＝n+1)。这被示出为线性投影线804上的点812。在预测电阻(r_n+1)之后，可以基于所预测电阻值和电流i
芯片
的定义值(例如，电流峰值)来控制电源106以提供新电压v
sys
，new，如上文在等式(12)中所示出的。
[0074]
可以根据需要来重复
‘
移动窗口’线性投影过程(例如，直到电穿孔过程的结束)，以预测下一个脉冲处的电阻并且确定将电流i
芯片
维持在定义值所需要的电压。例如，图9展示了示出应用多个线性投影(例如，线902a至902n)以预测未来脉冲处的电阻的图表900。每个线性投影的分段的数据长度(m)可以是相同的或不同的。通过使用图8和图9中示出的
‘
移动窗口’线性投影，当芯片电阻r
芯片
非线性地变化时(例如，非线性降级)，控制电路108可以用积极的补偿方法作出响应。然而，使用
‘
移动窗口’线性投影方法可能在预测过程期间引入不期望的噪声。
[0075]
当采用上文所解释的预测性补偿技术时，图1的控制电路108可以采用各种部件和/或方法。例如，
‘
全部数据’和
‘
移动窗口’线性投影技术是基于用于反馈控制的线性回归。在这样的示例中，简单增益因子g可以与反馈控制一起被采用。
[0076]
在其他示例中，控制电路108可以包括用于反馈控制的特定控制器。例如，控制电路108可以包括比例积分微分(pid)控制器、比例积分(pi)控制器、比例微分(pd)控制器、和/或比例(p)控制器。另外，可以引入pid控制器、pi控制器、pd控制器和/或p控制器的增益因子以考虑系统的运动学。反馈增益因子可以是固定值或可变值。
[0077]
在一些示例中，反馈增益因子可以是从先前补偿结果(基于线上计算、线下数据库等)机器学习到的等。例如，预测性补偿技术可以针对被转染的相同细胞线或相同应用(例如，蛋白质生产)基于在实验中获得的已知数据点、历史数据库等来使用机器学习方法。
[0078]
测试已表明，使用
‘
移动窗口’线性投影可以在降级周期期间比其他补偿技术产生更好的补偿结果。例如，图10展示了包括表示在对齐时间段内的归一化电场值的线1002、1004、1006、1008的图表1000。具体地，线1002(具有点-点配置)表示当应用
‘
移动窗口’线性投影时的电场，线1004(具有点-短划-点配置)表示当应用
‘
全部数据’线性投影时的电场，线1006(具有短划-短划配置)表示当应用响应补偿技术时的电场，并且线1008(具有实线配置)表示当未应用补偿技术时的电场。降级在10秒标记之后(例如，当归一化电场值达到峰
值时)开始，并且
‘
移动窗口’线性投影、
‘
全部数据’线性投影和响应技术的补偿在检测到降级之后开始。如图10中所示出的，与
‘
移动窗口’线性投影技术相对应的电场(线1002)在降级周期期间维持在大约1的归一化值，与
‘
全部数据’线性投影技术相对应的电场(线1004)在降级周期期间维持在大约0.95的归一化值，并且与响应补偿技术相对应的电场(线1006)在降级周期期间维持在大约0.85的归一化值。如此，在图10的示例中，
‘
移动窗口’线性投影技术比
‘
全部数据’线性投影和响应补偿技术提供更好的转染效率。
[0079]
另外，使用
‘
移动窗口’线性投影技术的电穿孔过程可以比常规电穿孔过程经历更大的产率。参见本文中的实施例3。例如，图11展示了包括表示当使用不同电穿孔过程用α-ctla4/txm-b融合蛋白质转染cho-s细胞时的生物性能结果的线1102、1104、1106、1108、1110的图表1100。在图11的示例中，使用具有由本文所描述的
‘
移动窗口’线性投影技术应用的补偿的电穿孔过程或不具有补偿的常规电穿孔过程用包含对α-ctla4/txm-b融合蛋白质进行编码的dna的表达质粒转染cho-s细胞。具体地，线1102、1104、1106与在补偿期间采用
‘
移动窗口’线性投影技术的电穿孔过程相关联，线1108与不具有补偿的电穿孔过程相关联，并且线1100是不具有补偿的常规电穿孔过程。
[0080]
如所示出的，当将1.45kv/cm的电场施加到10ml双相样本时，滴度线1102(具有点-点配置)达到335.3μg/ml；当将1.45kv/cm的电场施加到10ml样本时，滴度线1104(具有短划-短划配置)达到306μg/ml；并且当将1.3kv/cm的电场施加到10ml样本时，滴度线1106(具有短划-点-短划线配置)达到276.9μg/ml。另外，100ml样本的滴度线1108(具有短划-点-点-短划配置)达到214.2μg/ml，并且10ml样本的滴度线1110(具有实线配置)达到160.9μg/ml。如此，当基于
‘
移动窗口’线性投影技术(例如，线1102、1104、1106)应用补偿时，转染效率与当未应用补偿时(例如，线1108、1110)相比较可以是基本上更高的。
[0081]
在一些示例中，控制电路(例如，图1的控制电路108)可以监测在电极之间流动的流体，并且响应于检测到与流体相关联的一个或多个参数而控制其相关联的dc电源以生成和/或停止生成电脉冲。例如，图12展示了用于用负载物电穿孔细胞的装置1200，并且包括电极1202、1204、1210、1212以及耦合到电极1210、1212的传感器1206。电极1202、1204基本上类似于图1的电极102、104。如此，电极1202、1204可以彼此间隔开并且为包括细胞和负载物的流体在其间流动限定路径1208，如由虚线箭头所示出的。路径1208可以具有蛇形配置或任何其他合适的配置。
[0082]
如在图12中所示出的，电极1210、1212定位在电极1202、1204的相对侧上、在路径1208(例如，流体通道)的入口和出口处。例如，并且如在图12中所示出的，电极1210(用虚线所示出的)定位在电极1202、1204的底部侧上、在入口和出口处，并且电极1212(用实线所示出的)定位在电极1202、1204的顶部侧上、在入口和出口处。可以采用电极1210、1212来检测进入和离开电极1202、1204之间的流体路径1208的流体。
[0083]
在图12的示例中，传感器1206可以与控制电路或其部分(未示出)通信，以控制dc电源(未示出)补偿电场降级，如本文所解释的。传感器1206可以是电流传感器或阻抗传感器。
[0084]
在图12的特定示例中，当将电压施加到电极1210、1212时，通过感测流动经过电极1210、1212的电流和/或跨电极1210、1212的电阻来检测经过路径1208的流体。例如，流体流动经过电极1202、1204之间的路径1208可能导致通过电极1210、1212的电流的变化，和/或
跨电极1210、1212的电阻的变化。在这样的示例中，传感器1206可以检测这个电流和/或电阻变化，并且向控制电路发送指示电穿孔过程已经开始(例如，流体正在电极1210、1212之间流动)、结束等的信号。
[0085]
例如，图13展示了五个阶段的流体流动以及在五个阶段中与电极1210、1212相关联的感测到的参数(例如，电流或电阻)的图表。在第一阶段中，流体还没有到达电极1210、1212，并且感测到的参数保持在初始状态(例如，没有流体的稳定状态值)。在第二阶段中，流体在路径1208的入口处通过电极1210、1212，从而导致感测到的参数增大。在第三阶段中，流体在路径1208的入口和出口处通过电极1210、1212，从而导致感测到的参数再次增大。在第四阶段中，流体在路径1208的出口处通过电极1210、1212，从而导致感测到的参数减小。在第五阶段中，流体已通过了电极1210、1212，从而导致感测到的参数再次减小(例如，回到其稳定状态值)。如此，控制电路可以基于增大的参数(例如，当在阶段2至阶段4中存在流体时)控制dc电源以生成电脉冲，并且基于稳定状态参数(例如，在阶段5中)来停止生成电脉冲。另外，如果已知电场开始降级的时间与流体存在的时间相关，则控制电路可以在腔室充满流体(例如，阶段3)时开始控制dc电源以补偿电场降级。这可以允许控制电路在与基于例如检测到由dc电源提供的电流的减小的其他技术相比较更早的时间点开始其补偿过程。
[0086]
图14展示了另一装置1400，该另一装置可以监测在电极之间流动的流体，并且响应于检测到与流体相关联的一个或多个参数而控制其相关联的dc电源以生成和/或停止生成电脉冲。例如，并且如在图14中所示出的，装置1400包括流体路径1420、1422、1424、在流体路径1422中的止回阀1426、与路径1420、1422、1424流体连通的传感器1406a至1406d、以及限定路径1208的图12的电极1202、1204。如所示出的，流体路径1208(在电极1202、1204之间)耦合在流体路径1420、1424之间，并且流体路径1422(例如，横向路径)从流体路径1420延伸。在图13的示例中，传感器1406a至1406d可以与控制电路或其部分(未示出)通信，以控制dc电源(未示出)以补偿电场降级，如本文所解释的。
[0087]
一旦电穿孔过程已经开始，则流体开始流动经过路径1208、1420、1422、1424，如由虚线箭头所示出的。具体地，流体流动经过路径1420(例如，入口路径)，进入路径1208，并且经过路径1424(例如，出口路径)离开。在这样的示例中，一个或两个传感器1406a至1406b可以感测流动进入路径1208(例如，进入芯片)的流体并且向控制电路发送信号。这允许控制电路检测指示电穿孔过程已经开始的流体的存在。如此，控制电路可以基于流体的存在来控制dc电源以生成电脉冲。然后，控制电路可以响应于传感器1406a至1406c中的任一个检测到流体的存在而开始控制dc电源以补偿电场降级。这可以在与基于例如检测到由dc电源提供的电流的减小的其他技术相比较更早的时间点开始补偿过程。
[0088]
另外，控制电路可以基于与流体相关联的参数来停止电穿孔过程。例如，传感器1406c可以感测指示流体已通过路径1208(例如，通过芯片)的流体减小和/或流体不存在，并且电穿孔过程已经结束。在这样的示例中，传感器1406c可以向控制电路发送信号，并且控制电路可以控制dc电源以停止生成电脉冲(例如，停止电穿孔过程)和/或控制流体泵关闭。
[0089]
在一些示例中，止回阀1426可以用作闭塞检测器以感测在路径1208、1420、1424中的一个中的流体的堵塞。例如，如果存在流体的堵塞，则压力可能在止回阀1426的入口侧积
聚。如果压力超过止回阀1426的定义跳闸阈值(例如，20psi至40psi)，则止回阀1426可以打开，从而允许流体流动经过路径1422并且越过定位在阀1426的出口侧上的传感器1406d。在这样的示例中，传感器1406d检测流体(指示路径1208、1420、1424中的一个中的堵塞)并且向控制电路发送信号以停止生成电脉冲和/或使流体泵停下来。在其他示例中，止回阀1426可以基于阀1426的状态(例如，打开或关闭)来向控制电路发送信号以指示是否存在堵塞。在这样的示例中，可以不采用传感器1406d。
[0090]
传感器1406a至1406d可以是任何合适的传感器。例如，传感器1406a至1406d中的任一个可以是超声传感器、光传感器(例如，红外传感器)等。在这样的示例中，可以通过从流体反射波和/或光、行进穿过流体等来检测流体。光传感器可以提供和/或检测可见或不可见光。在一些示例中，一个或多个光源(比如led、激光器、红外灯等)可以与传感器1406a至1406d结合采用和/或成为传感器1406a至1406d的一部分。另外，在图13的特定示例中，四个传感器1406a至1406d定位在电极1202、1204外侧。在其他示例中，如果期望，则传感器1406a至1406d中的任一个可以沿着路径1208(例如，在电极1202、1204之间)定位。进一步地，在一些示例中，可以利用仅一个传感器(例如，传感器1406a、传感器1406b等)，可以利用多于四个传感器等。
[0091]
本文中披露的电极可以是任何合适类型的导电电极。例如，电极102、104、1202、1204、1210、1212中的任一个可以包括具有允许包括细胞和负载物的流体通过的孔隙度的网状板、固体板等。
[0092]
另外，本文中披露的电源和控制电路可以包括各种合适的部件。例如，图15展示了包括图1的dc电源106和控制电路108的装置1500。在图15的示例中，dc电源106包括功率转换器1502和脉冲电路1504。功率转换器1502可以包括具有任何合适转换器拓扑的dc-dc功率转换电路和/或ac-dc功率转换电路。例如，功率转换器1502可以接收dc或ac电力，并且向脉冲电路1504输出经调节dc电压。在一些示例中，电源106可以包括ac-dc整流器以及耦合到ac-dc整流器的dc-dc降压转换电路、升压转换电路等。
[0093]
图15的脉冲电路1504从功率转换器1502接收经调节dc电压，并且将dc电压转换成dc电脉冲。然后将电脉冲提供给电极(例如，图1的电极102、104、图12的电极1202、1204等)，如本文所解释的。例如，脉冲电路1504可以包括一个或多个开关装置，用于解释来自功率转换器1502的dc电压并且形成电脉冲。
[0094]
在图15的示例中，控制电路108包括控制器1506以及耦合到控制器1506的脉冲发生器1508。如所示出的，控制器1506接收表示功率转换器1502的输出参数(例如输出电压)的反馈信号，并且向功率转换器1502提供一个或多个控制信号，以基于反馈信号来控制功率转换器1502中的一个或多个开关装置。在一些示例中，控制器1506可以基于由图1的电压传感器116感测到的电压v
芯片
和/或由图1的电流传感器114感测到的所产生电流i
芯片
来控制功率转换器的开关装置以将功率转换器的输出电压调节成处于不同设置值。如此，控制器1506可以控制电脉冲的幅度。在这样的示例中，控制器1506可以控制功率转换器1502的输出以补偿电场降级，如本文中所解释的。
[0095]
控制器1506向脉冲发生器1508提供信号，并且脉冲发生器1508向脉冲电路1504提供一个或多个控制信号，以基于从控制器1506接收到的信号来控制其(多个)开关装置以生成电脉冲。在一些示例中，脉冲发生器1508可以基于从控制器1506接收的信号来调整电脉
冲的频率、脉冲宽度、工作周期等。
[0096]
实施例
[0097]
实施例1(图2和图3)
[0098]
细胞制备：在实验之前，gibco
tm cho-s
tm
细胞(thermofisher类别a11557-01)在cd-cho培养基(thermofisher类别10743029)+8mm l-谷氨酰胺中扩增。以《2e6个细胞/ml的浓度培养和收获cho-s细胞。在实验的第0天，在37℃条件下存在5％的自制钠基电穿孔缓冲液，并且在实验的第1天，加入1mm的丁酸钠并且将5％的自制钠基电穿孔缓冲液改变到32℃。在实验的第4天和第8天馈送自制钠基电穿孔缓冲液。在电穿孔过程期间，存活率和vcd(存活细胞密度)遵循类似的趋势线。
[0099]
细胞是用自制钠基电穿孔缓冲液(钠浓度8mm/l，电导率＝10-14ms/cm，渗透浓度＝265-300mosm/l，ph 7.2-7.4)来收获和清洗的并且重新悬浮于细胞密度为100e6个细胞/ml的相同自制钠基电穿孔缓冲液中。下文在表2中示出了自制钠基电穿孔缓冲液的示例：
[0100]
表2
[0101][0102][0103]
电导率＝12ms/em
[0104]
渗透浓度＝～278mosm/l
[0105]
α-ctla-4/txm-b融合蛋白质(n-844-2)dna制备：n-844-2是抗ctla-4/txm分子，其中，抗ctla-4scfv附接到il-15rαsu部分。在wo 2018/075989中披露了抗ctla-4scfv/il-15rαsu分子的制备和披露，该wo 2018/075989通过援引以其全文并入本文。将n-844-2的dna序列克隆到哺乳动物表达质粒中。然后以毫克量使用endo free dna giga试剂盒(qiagen类别编号12391)制备包含n-844-2序列的dna质粒。刚好在电穿孔过程之前将包含对α-ctla4/txm-b融合蛋白质进行编码的dna的表达质粒在水中稀释并且与细胞悬浮液混合。
[0106]
电穿孔：将混合的细胞和dna悬浮液放置在50ml离心管中并且用蠕动泵和管泵送到电穿孔芯片中。脉冲波形是40v，脉冲宽度是450μs，脉冲间隔是2.7秒，流动速率是2ml/min。记录整个实验的电压v(p)和电流i(p)作为每个脉冲(p)的函数，并且将电阻r(p)计算为r(p)＝v(p)/i(op)。r0＝min(r(p))是当流体完全填充电穿孔腔室时，其被设置为图1中的初始电极-流体界面电阻ri。有效电场被计算为e＝v(p)*r0/(r(p)*d)，d是电极对之间的距离。图2和图3：然后，v、i、r、e被绘制为脉冲数量p的函数。
[0107]
实施例2(图4)
[0108]
细胞制备和α-ctla-4/txm-b融合蛋白质(n-844-2)dna制备与实施例1相同。
[0109]
电穿孔：将混合的细胞和dna悬浮液放置在1.5ml的管中并且用蠕动泵和试管泵送到电穿孔芯片中。在本实验中测试了细胞和dna混合物的四个不同总体积：120gl、240μl、400μl和600vl。脉冲波形是38v，脉冲宽度是450μs，脉冲间隔是0.27秒，并且流动速率是1ml/min。记录整个实验的电压v(p)和电流i(p)作为每个脉冲(p)的函数，并且将电阻r(p)计算为r(p)＝v(p)/i(op)。r0＝min(r(p))是当流体完全填充电穿孔腔室时，其被设置为图1中的初始电极-流体界面电阻ri。有效电场被计算为e＝v(p)*r0/(r(p)*d)，d是电极对之间的距离。图4：然后，有效电场e被绘制为脉冲数量p的函数。
[0110]
实施例3(图11)
[0111]
细胞制备和α-ctla-4/txm-b融合蛋白质(n-844-2)dna制备与实施例1相同。
[0112]
电穿孔：将混合的细胞和dna悬浮液放置在50ml的管中并且用蠕动泵和管泵送到电穿孔芯片中。将五种不同电穿孔条件与如上文所描述的相同细胞制备进行比较。下文在表3中示出了五种不同条件：
[0113]
表3
[0114][0115]
图11示出了在使用补偿方法的情况下蛋白质生产滴度结果得以改善。在使用n-601(单克隆igg1抗体)制备的具有标准曲线的octet red 96e上使用蛋白质a生物传感器测量滴度。
[0116]
为了展示和描述的目的已经提供了对实施例的上述描述。这并不旨在是详尽的或限制本披露内容。特定实施例的单个元件或特征通常不限于该特定实施例，而是在适用的情况下是可互换的并且可以用于选定实施例中，即使这没有被具体示出或描述。同样也可以以多种方式变化。这样的变型不应当被认为是脱离本披露内容，并且所有这样的修改旨在被包括在本披露内容的范围内。