获得血小板衍生的线粒体的方法及其用途与流程

本公开涉及从冷冻血小板获得活性线粒体的方法和所获得的线粒体的用途。更具体地，本发明涉及一种从冷冻血小板获得活性线粒体的方法和一种包括来自所述方法的线粒体作为活性成分的药物组合物及其用途。

背景技术：

1、线粒体是参与三磷酸腺苷(atp)合成与调控的真核生物的细胞器，三磷酸腺苷是细胞内的能量来源。线粒体与体内各种代谢途径的控制有关，如细胞信号传导、细胞分化、凋亡以及细胞周期和细胞生长。

2、据报道，由于线粒体的功能的退化导致的能量产量减少会导致各种疾病。当电子传递链反应的功能由于线粒体的基因组和蛋白质组的突变而降低时，会导致atp产量的下降、活性氧的过量产生、钙调节功能的退化等。在这种情况下，线粒体可能会发生其膜通透性的变化并诱导细胞凋亡功能异常，这可能会相应地导致癌症和顽固性疾病。

3、据报道，由线粒体的功能障碍引起的人类疾病的实例包括线粒体相关遗传疾病、自身免疫性炎症性疾病(例如类风湿性关节炎)、缺血性疾病、传染性疾病、心脏病、肌肉疾病、退行性疾病(例如帕金森病和阿尔茨海默病)、以及各种癌症的发生和转移等。

4、为了治疗此类线粒体功能障碍相关疾病，可用于保护线粒体或恢复线粒体功能障碍的物质或这些物质的有效靶向递送的研究一直在进行中。然而，治疗范围受到一定的限制或存在副作用的问题，目前还没有开发出线粒体相关疾病的突破性治疗方法。

5、线粒体的细胞膜通透性和细胞-细胞移动性已被确认为线粒体的起源和信号传导的一种手段。利用这种流动性，目前正在各种疾病模型中进行线粒体移植，以正常线粒体替换受损线粒体的研究，其安全性和有效性已经在心脏病的临床阶段得到证实(mccully etal.,clin trans med.,5(16):1-13,2016)。

6、用于这种线粒体移植的线粒体的分离是通过额外的手术或大量培养的人类细胞从自体组织和肌肉中进行的。然而，这种利用人类资源的分离方法面临一个问题，即由于手术的负担和细胞培养限制导致的有限资源，难以将分离的线粒体作为治疗剂进行商业化。

7、此外，在血液这种易于捐献和移植的人类资源中，线粒体存在于除红细胞之外的所有血细胞成分中，利用从血小板分离的线粒体治疗疾病的尝试到目前为止还没有报道。

8、血小板是血液中最小的血细胞成分，正常人每1μl血液中的血小板数量在150,000至400,000之间。血小板在血管周围移动，以维持血流而不失血，并在发生出血时作出反应，它们在聚集和止血方面起着作用。还已知其含有大量蛋白质、细胞因子和生物活性因子，因此能够启动和调节伤口愈合。

9、血小板产生于骨髓，在体内存活约7天。然而，一旦采集血液，血小板的储存期通常比其它血液制品的储存期短，目前已知在室温下血小板只能在搅拌器中最多储存5天。与红细胞等其他血液制品相比，血小板的储存稳定性进一步恶化的原因之一是因为这些血小板中存在的线粒体的代谢持续发生，并且随着储存时间的推移，atp随着ph值的降低而减少。特别是，当血小板在低温下储存以抑制代谢时，它们不能维持其细胞骨架并且变形以诱导聚集，当冷冻后解冻时不能预期血小板的功能。

10、此外，从血液中分离血小板大约需要24至48小时，除去分离时间，血小板的实际储存期仅为3至4天。这些血小板制剂用于预防或治疗患者的出血带来的血小板突然减少，因此，其用途有限。因此，从血液中采集的血小板有25％会在有效期后丢弃。

11、因此，通过开发一种能够稳定地从血小板中分离用于疾病治疗的活性线粒体的技术所产生的效果预计是非常大的，所述血小板比自体组织和干细胞更容易获得，但是储存和使用有限。

技术实现思路

1、技术问题

2、在这种情况下，本发明人做了大量的努力来开发用于获得线粒体的突破性方法，为作为线粒体相关疾病治疗的一部分的移植治疗稳定地供应线粒体。结果，证实了从通过解冻冷冻固定和储存的血小板中获得的线粒体不仅稳定地维持膜电位，而且具有能够极好地治疗线粒体功能障碍相关疾病，特别是炎症性疾病的活性，从而完成了本公开。

3、技术方案

4、为了实现上述目的，根据示例性实施方案，本公开提供了一种获得血小板衍生的线粒体的方法，其包括冷冻或储存从血液分离的血小板；解冻冷冻的血小板；和破坏解冻的血小板。

5、根据另一个示例性实施方案，本发明还提供了一种用于预防或治疗线粒体功能障碍相关疾病的药物组合物，其包括通过上述方法获得的血小板衍生的线粒体作为活性成分。

6、有益效果

7、根据本公开的用于从冷冻的血小板获得线粒体的方法不仅可以促进血小板的破坏从而能够获得具有稳定活性的线粒体，而且还可以为在短时间冷藏后被丢弃的供体血小板提供商业价值。此外，通过上述方法获得的含有血小板衍生的线粒体的药物组合物预期具有高商业适用性，因为其可广泛应用于治疗由线粒体功能障碍引起的各种疾病。

技术特征：

1.一种通过冷冻血小板稳定地储存线粒体的方法。

2.一种获得血小板衍生的线粒体的方法，包括：

3.如权利要求2所述的方法，进一步包括去除除线粒体之外的裂解物。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述解冻在0℃至37℃下进行。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述解冻进行1分钟至1小时。

6.如权利要求3所述的方法，其中通过离心或使用过滤器、网或珠子对所述裂解物进行去除。

7.如权利要求2所述的方法，其中所述冷冻的血小板是那些通过冷冻从受试者获得的血小板而获得的。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述冷冻在-1℃至-200℃温度范围内进行。

9.如权利要求2所述的方法，其中在破坏所述血小板之前，进一步对血小板进行至少一次冷冻和解冻。

10.一种用于预防或治疗疾病的药物组合物，其包括如权利要求2-9中任一项所述的获得方法获得的血小板衍生的线粒体作为活性成分。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述疾病是一种线粒体功能障碍疾病，选自由慢性炎症性疾病、急性炎症性疾病、缺血性疾病、神经系统疾病、心脏病、肌肉疾病、退行性疾病、代谢性疾病、纤维化疾病、关节疾病、眼病、脱发和免疫相关疾病组成的组。

12.如权利要求2-9中任一项所述的获得方法获得的血小板衍生的线粒体在制备用于预防或治疗线粒体功能障碍相关疾病的药物中的用途。

13.如权利要求10所述的药物组合物用于预防或治疗线粒体功能障碍相关疾病的用途。

14.一种预防或治疗线粒体功能障碍相关疾病的方法，包括：向受试者施用如权利要求10所述的药物组合物。

技术总结
本发明涉及一种通过冷冻储存的血小板获得活性线粒体的方法和分离的线粒体的用途，更具体地，涉及一种通过冷冻血小板后解冻血小板获得线粒体的方法以及包括通过所述方法获得的线粒体作为活性成分的药物组合物。本发明提供一种通过在保存溶液中解冻处于冷冻状态的血小板来获得线粒体的方法，由此可以容易获得其中具有保持稳定活性的线粒体，而且能够为在短时间冷藏后被丢弃的供体血小板提供商业价值。此外，通过上述方法获得的含有血小板衍生的线粒体的药物组合物可有效地用于治疗由线粒体功能障碍引起的各种疾病。

技术研发人员：姜荣哲,韩圭范,河钟千
受保护的技术使用者：白雁生物技术公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12