活细胞数计测方法和活细胞数计测装置与流程

本发明涉及将因细胞的死活状态而变化的电容的测定结果用于活细胞数等的演算的活细胞数计测方法和活细胞数计测装置。

背景技术：

1、目前，培养细胞而生产有用物质的方法已经在酿造业、食品工业、化学工业、医药品工业等领域中利用。例如作为抗体医药等生物医药品，开发了大量以细胞所产生的物质为主成分的制品。这样的生物医药品通过在培养液中培养细胞并对分泌至培养液中的目标物质进行分离精制而生产。

2、在利用细胞的有用物质的生产中，要求用于生产效率化的培养控制、和关于产物的适当的品质管理。在培养中，希望避免因细胞死亡等而造成的杂质增加，并且保持高的细胞数，因此实时监测细胞数和细胞的死活状态是至关重要的。

3、目前，作为适于生产有用物质的培养方法，已知流加培养法、连续培养法等。在这些培养方法中，一边维持营养素的浓度和培养环境一边进行培养。需要根据细胞的比增殖速度来控制谷氨酸等的添加量，因此活细胞数的监测特别重要。

4、通常，作为计测细胞数的方法，有离线的方法和在线的方法。离线的细胞数计测方法以从培养体系取样来的细胞为对象。另一方面，在线的细胞数计测方法在培养体系内以培养中的细胞为对象，适于实时监测和降低污染。

5、作为离线的细胞数计测方法，有如下方法：利用显微镜观察间歇地从培养体系取样来的培养液，在显微镜视野内通过目测进行观察，利用血细胞计算盘对所观察的细胞进行计数的方法；通过图像处理自动地对显微镜图像中的细胞进行计数的方法等。在这些方法中，能够利用台盼蓝的染色来判定细胞的死活，能够单独地对活细胞和死细胞进行计数。

6、作为在线的细胞数计测方法，有如下方法：根据培养液中的氧消耗量推定细胞数的方法；根据培养液的静电容量、阻抗或介电常数推定细胞数的方法等。在基于氧消耗量的方法中，以溶存氧浓度的降低是因活细胞的氧消耗而引起的为前提，对活细胞进行定量。在基于静电容量等的方法中，以活细胞和死细胞对电场的响应不同、只有活细胞在细胞内外产生极化为前提，对活细胞进行定量。

7、在专利文献1中记载了一种基于培养液的阻抗高精度地推定活细胞数的细胞检查装置。该细胞检查装置具有：计测培养液的阻抗的阻抗传感器；存储系数的存储部，该系数用于：从细胞的培养开始至死亡的培养期间内的规定期间被分为多个期间，在所分成的上述多个期间的每个期间，利用上述阻抗，推定在上述规定期间内在培养液中生存的活细胞数；和活细胞数推定部，其取得上述阻抗，对于上述阻抗使用上述存储部所存储的上述每个期间的系数中的至少1个，推定活细胞数。

8、现有技术文献

9、专利文献

10、专利文献1：日本特开2019－124594号公报

技术实现思路

1、发明所要解决的技术问题

2、需求以生产有用物质时的培养液等为对象，以高精度对细胞悬浮液所含的活细胞数进行定量的技术。然而，需要取样的现有的离线的方法和基于静电容量等的现有的在线的方法存在以下问题。

3、在离线的方法中，能够通过利用台盼蓝的染色进行细胞死活的判定，但需要将培养液取至培养槽外。在这样的方法中，存在在暂时打开培养槽时培养槽内被杂菌污染的风险。利用台盼蓝的染色对活细胞是侵入性的，因此在在线的方法中难以使用。

4、另外，在进行取样的方法中，为了防止杂菌向取样后的培养槽侵入，必须利用高温高压的蒸气等对取样用配管进行灭菌。在进行蒸气灭菌时，需要对配管内进行加热的时间、灭菌时间和将配管内冷却至室温的时间。灭菌时间通常需要20分钟以上，因此取样间隔为1小时左右以上，无法合适地进行实时监测。

5、在在线的方法中，由于不采取培养液，因此不会出现耗费灭菌时间等问题，但对应于测定方式，仍存在一些问题。

6、在基于氧消耗量的方法中，在测定溶存氧浓度时，需要停止氧量的控制，因此培养液暂时成为低氧浓度的状态，存在有用物质的生产效率和品质变差的问题。另外，在现有的基于静电容量等的方法中，有时无法区分活细胞和残留有细胞膜的死细胞，残留有细胞膜的死细胞也被定量，因此存在无法以高精度计测活细胞数的问题。

7、因此，本发明的目的在于提供一种污染风险小、能够以非侵入性的方式对细胞高精度地计测活细胞数的活细胞数计测方法和活细胞数计测装置。

8、用于解决技术问题的技术方案

9、为了解决上述技术问题，本发明所涉及的活细胞数计测方法包括：测定细胞悬浮液所含的悬浮质的量的工序；测定因细胞的死活状态而变化的上述细胞悬浮液的电容的工序；以及基于预先求得的每单位活细胞的电容、预先求得的每单位死细胞的电容、上述悬浮质的量和上述细胞悬浮液的电容，演算上述细胞悬浮液所含的活细胞数、死细胞数和细胞生存率中的一个以上的工序。

10、另外，本发明所涉及的活细胞数计测装置具有：测定细胞悬浮液所含的悬浮质的量的浊度传感器；测定因细胞的死活状态而变化的上述细胞悬浮液的电容的测定器；存储每单位活细胞的电容和每单位死细胞的电容的数据的存储部；和基于上述每单位活细胞的电容、上述每单位死细胞的电容、上述悬浮质的量和上述细胞悬浮液的电容，演算上述细胞悬浮液所含的活细胞数、死细胞数和细胞生存率中的一个以上的演算部。

11、发明效果

12、利用本发明，能够提供一种污染风险小、能够以非侵入性的方式对细胞高精度地计测活细胞数的活细胞数计测方法和活细胞数计测装置。

技术特征：

1.一种活细胞数计测方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的活细胞数计测方法，其特征在于，包括：

3.如权利要求1所述的活细胞数计测方法，其特征在于：

4.如权利要求3所述的活细胞数计测方法，其特征在于，包括：

5.一种活细胞数计测装置，其特征在于，具有：

6.如权利要求5所述的活细胞数计测装置，其特征在于：

7.如权利要求5所述的活细胞数计测装置，其特征在于：

8.如权利要求7所述的活细胞数计测装置，其特征在于，具有：

9.如权利要求8所述的活细胞数计测装置，其特征在于：

10.如权利要求5所述的活细胞数计测装置，其特征在于：

技术总结
本发明提供一种污染风险小、能够以非侵入性的方式对细胞高精度地计测活细胞数的活细胞数计测方法和活细胞数计测装置。活细胞数计测方法包括：测定细胞悬浮液所含的悬浮质的量的工序；测定细胞悬浮液的电容的工序；和基于预先求得的每单位活细胞的电容、预先求得的每单位死细胞的电容、悬浮质的量和细胞悬浮液的电容，演算细胞悬浮液所含的活细胞数、死细胞数和细胞生存率中的一个以上的工序。活细胞数计测装置(1)具有：浊度传感器(2)；测定细胞悬浮液的电容的测定器(3)；存储每单位活细胞的电容和每单位死细胞的电容的数据的存储部；和基于每单位活细胞的电容、每单位死细胞的电容、悬浮质的量和细胞悬浮液的电容，演算活细胞数、死细胞数和细胞生存率中的一个以上的演算部。

技术研发人员：涩谷启介,冈宪一郎
受保护的技术使用者：株式会社日立成套设备服务
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14