制备肽的方法与流程

背景技术：

技术实现思路

1、根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：

2、(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而得到偶联到树脂上的线性肽；

3、(b)将线性肽从树脂上裂解，从而获得游离的线性肽；

4、(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及

5、(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐；

6、其中：

7、(i)所述偶联步骤是使用二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)组合进行的；

8、(ii)通过使与所述树脂偶联的所述线性肽与包含三氟乙酸(trifluoroaceticacid,tfa)和选自二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)和二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)的清除剂的溶液接触来实现所述裂解步骤；

9、(iii)所述方法还包括在裂解后沉淀所述游离的线性肽，而不在沉淀之前通过蒸发浓缩所述游离的线性肽；

10、(iv)通过使包含浓度至少5毫克/毫升的线性肽的水溶液与过氧化氢接触来实现所述氧化步骤；

11、(v)所述分离步骤包括将环肽以不超过40克环肽/每千克所述柱的浓度加载到反相色谱柱上，并从所述柱上洗脱环肽；

12、(vi)所述分离具有seq id no:1的环肽的步骤包括冷冻干燥，并且所述方法进一步包括在所述冷冻干燥之后研磨所述环肽；和/或

13、(vii)所述树脂的取代度为每克至少0.3毫当量，和/或所述树脂为rink氨基甲基苯乙烯(aminomethylstyrene,ams)树脂。

14、根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：

15、(a)使用二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)组合，通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoicacid)依次偶联到树脂上，从而获得偶联到树脂上的线性肽；

16、(b)从树脂上裂解线性肽，从而获得游离的线性肽；

17、(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及

18、(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐。

19、根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：

20、(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而得到偶联到树脂上的线性肽；

21、(b)通过使与树脂偶联的线性肽与包含三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)和选自二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)和二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)的清除剂的溶液接触，从树脂上裂解线性肽，从而获得游离的线性肽；

22、(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及

23、(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐。

24、根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：

25、(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而得到偶联到树脂上的线性肽；

26、(b)将线性肽从树脂上裂解，从而获得游离的线性肽，并在裂解后沉淀游离的线性肽，而不在沉淀之前通过蒸发浓缩游离的线性肽；

27、(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及

28、(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐。

29、根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：

30、(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而得到偶联到树脂上的线性肽；

31、(b)从树脂上裂解线性肽，从而获得游离的线性肽；

32、(c)氧化所述线性肽的半胱氨酸残基，形成分子内二硫键，所述氧化步骤是通过将浓度至少为5毫克/毫升的所述线性肽的水溶液与过氧化氢接触来实现的，从而在溶液中获得具有seq id no:1的环肽；以及

33、(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐。

34、根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：

35、(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，从而得到偶联到树脂上的线性肽；

36、(b)从树脂上裂解线性肽，从而获得游离线性肽游离的线性肽；

37、(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及

38、(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐，其中所述分离步骤包括以不超过40克环肽/每千克柱的浓度将所述环肽加载到反相色谱柱上，并从所述柱洗脱所述环肽。

39、根据本发明一些实施例的一个目的，提供了一种大规模制备具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括：

40、(a)通过固相肽合成将氨基酸和4-氟苯甲酸(4-fluorobenzoic acid)依次偶联到树脂上，其中所述树脂的取代度为至少0.3毫当量/克和/或所述树脂为rink氨基甲基苯乙烯(aminomethylstyrene,ams)树脂，从而获得偶联到所述树脂上的线性肽；

41、(b)从树脂上裂解线性肽，从而获得游离线性肽游离的线性肽；

42、(c)将线性肽的半胱氨酸残基氧化，形成分子内二硫键，从而得到溶液中的具有seq id no:1的环肽；以及

43、(d)分离具有seq id no：1的环肽或其药学上可接受的盐。

44、根据本文描述的任何相应实施例中的一些，所述偶联步骤使用二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide,dic)与氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethylcyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)组合来实现。

45、根据本文描述的涉及与dic(diisopropylcarbodiimide)和氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethyl cyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)偶联的任何实施例中的一些，所述dic(diisopropylcarbodiimide)和所述氰基羟基亚氨基乙酸乙酯(ethylcyanohydroxyiminoacetate)和/或n-羟基苯并三唑(n-hydroxybenzotriazole)以约两倍的摩尔过量使用。

46、根据本文描述的任何相应实施例中的一些，所述裂解步骤是通过使与所述树脂偶联的所述线性肽与包含三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)和清除剂的溶液接触来实现的，所述清除剂选自二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)和二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)所组成的群组中。

47、根据本文描述的涉及用包含选自二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)和二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)的清除剂的溶液裂解的任何实施例中的一些，所述溶液中的所述清除剂的浓度在10毫克/毫升至500毫克/毫升的范围内。

48、根据本文描述的涉及用包含二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)的溶液裂解的任何实施例中的一些，溶液中二硫苏糖醇(dithiothreitol,dtt)的浓度为约50毫克/毫升。

49、根据本文描述的任何相应实施例中的一些，所述方法进一步包括在所述裂解步骤后沉淀所述游离的线性肽，而不在所述沉淀前通过蒸发浓缩所述游离的线性肽。

50、根据本文描述的与沉淀线性肽有关的任何实施例中的一些，所述沉淀通过加入叔丁基甲基醚(tert-butyl methyl ether,mtbe)和己烷的混合物来实现，所述混合物的体积为每克所述树脂约45毫升所述混合物。

51、根据本文所述的任何相应实施例中的一些，氧化是通过使线性肽与过氧化氢接触来实现的。

52、根据本文所述的涉及使线性肽与过氧化氢接触的任何实施例中的一些，通过使包含浓度至少5毫克/毫升的线性肽的水溶液与过氧化氢接触来实现接触。

53、根据本文描述的任何相应实施例中的一些，所述分离步骤包括以不超过40克环肽/每千克柱的浓度将所述环肽加载到反相色谱柱上，并从所述柱洗脱所述环肽。

54、根据本文描述的涉及反相色谱柱的任何实施例中的一些，所述柱是c18柱。

55、根据本文描述的涉及洗脱的任何实施例中的一些，用磷酸三乙铵(triethylammonium phosphate)溶液进行洗脱。

56、根据本文描述的任何相应实施例中的一些，所述分离具有seq id no:1的环肽的步骤包括冷冻干燥，并且所述方法进一步包括在所述冷冻干燥之后研磨所述环肽。

57、根据本文描述的任何相应实施例中的一些，固相肽合成树脂的取代度为至少0.3毫当量/克和/或树脂为rink氨基甲基苯乙烯(aminomethylstyrene,ams)树脂。

58、除非另有定义，否则本文使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本发明实施例的实施或测试中可以使用与本文所述方法和材料类似或等同的方法和材料，下面描述的方法及/或材料为例示性的。如果发生矛盾，专利说明书包括其定义，将受到限制。另外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的，并非用以限制。

59、本发明实施例的方法及/或系统的实现可以关于手动地、自动地或者其组合地执行或完成选择的任务。而且，根据本发明方法及/或系统的实施例的实际仪器和设备，可以通过硬件、通过软件、或通过韧体或其组合通过使用操作系统来实现几个选择的任务。

60、例如，根据本发明的实施例执行选定任务的硬件可以被实现为芯片或电路。作为软件，根据本发明实施例的选定任务可以被实现为由使用任何合适的操作系统的计算器执行的多个软件指令。在本发明例示性实施例中，根据本文描述的方法及/或系统的例示性实施例的一个或多个任务由诸如用于执行多个指令的计算平台的数据处理器执行。可选地，数据处理器包括用于存储指令及/或数据的挥发性内存和/或用于存储指令和/或数据的非挥发性内存，例如磁性硬盘和/或可移动介质。可选地，也提供网络连接。更可选地提供显示器及/或用户输入设备，例如键盘或鼠标。