Periostin基因在制备诊断和治疗椎间盘退变的产品中的应用

periostin基因在制备诊断和治疗椎间盘退变的产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及periostin基因在制备诊断和治疗椎间盘退变的产品中的应用。


背景技术：

2.目前针对下腰痛的治疗主要依赖非甾体抗炎药、止痛类药物和物理治疗等对症治疗，辅以康复锻炼、运动或者针灸推拿等，严重者还需要手术治疗。许多研究表明，机械力负荷是导致椎间盘退变的重要诱因之一。所以探索椎间盘退变的发病机制及有效的治疗方法具有重要的意义。
3.骨膜蛋白(periostin)是由成骨细胞或成纤维细胞分泌的一种细胞外基质蛋白，属于束蛋白(fasciclin)家族成员，其参与许多生理过程，包括上皮-间质转化 (emt)、细胞-基质相互作用和炎症。根据目前的研究表明，periostin在多种病理情况下表达上调，包括结肠癌、乳腺癌的骨转移等。但是periostin在椎间盘退变中的作用尚未有相关报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供periostin基因在制备诊断和治疗椎间盘退变的产品中的应用。相对比传统的椎间盘退变的诊断和治疗方法，本发明通过对基因及其表达产物的检测来诊断和治疗椎间盘退变，更加的方便、高效和无创，同时，也发掘出了periostin基因及其表达产物新的医药价值。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：periostin基因或其表达产物在制备诊断椎间盘退变的试剂中的应用。
6.研究发现，在机械应力下激活髓核细胞nf-κb信号通路，促进periostin分泌，导致髓核细胞的衰老和基质分解代谢，从而引发椎间盘退变。而在基因层面上进行periostin的敲低，有效缓解了机械应力诱导的动物椎间盘退变模型，提示periostin有可能是治疗椎间盘退变的一种新的治疗靶点。
7.作为本发明所述的periostin基因或其表达产物在制备诊断椎间盘退变的试剂中的应用的优选实施方式，所述periostin基因或其表达产物在椎间盘退变组织中表达上调。
8.作为本发明所述的periostin基因或其表达产物在制备诊断椎间盘退变的试剂中的应用的优选实施方式，所述试剂包括基因水平诊断试剂和蛋白水平诊断试剂。
9.作为本发明所述的periostin基因或其表达产物在制备诊断椎间盘退变的试剂中的应用的优选实施方式，所述基因水平诊断试剂包括通过pcr方法或基因芯片方法检测基因表达水平的试剂；所述蛋白水平诊断试剂包括通过免疫学方法检测periostin基因表达产物的表达水平的试剂。
10.本发明还提供一种用于诊断椎间盘退变的试剂盒，所述试剂盒包括检测 periostin基因或其表达产物的试剂。
11.本发明还提供periostin基因在制备治疗椎间盘退变的药物中的应用。
12.作为本发明所述的periostin基因在制备治疗椎间盘退变的药物中的应用的优选实施方式，所述药物采用基因敲低降低periostin基因的表达。
13.本发明还提供一种治疗椎间盘退变的药物组合物，所述药物组合物包括 periostin基因或其表达产物的抑制剂。
14.作为本发明所述的药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
15.本发明还提供periostin中和抗体在制备治疗椎间盘退变的药物中的应用。
16.本发明的有益效果：本发明提供了periostin基因在制备诊断和治疗椎间盘退变的产品中的应用，证实periostin基因表达水平在椎间盘退变组织中表达上调。通过检测periostin基因或其表达产物能够快速高效的诊断椎间盘退变，且不会对躯体造成损害。本发明不仅为椎间盘退变的诊断与治疗提供新思路和新方法，同时也发掘出了periostin基因及其表达产物新的医药价值。
附图说明
17.图1：a：髓核细胞在1kpa和40kpa的水凝胶下培养24小时的β-半乳糖苷酶活性染色图；b：髓核细胞在1kpa和40kpa的水凝胶下培养24小时后细胞内 cdkn1a、cdkn2a、cdk4和cdk6的表达水平图；c：髓核细胞在1kpa和 40kpa的水凝胶下培养24小时后细胞内il1a、il1b、il6、cxcl8的表达水平图。
18.图2：a：髓核细胞rna差异表达基因kegg富集分析图；b：髓核细胞 dapi染色图；c：髓核细胞rna差异表达基因go分析图；d：髓核细胞相关 mrna表达量图；e：髓核细胞上清液中periostin分泌量图；f：atac测序nf-kb 通路分析图；g：atac测序periostin开放峰分析图；h:pbs组和tnf-α组髓核细胞的periostin蛋白、p65蛋白、p-p65蛋白和β-actin蛋白电泳图；i:pbs组和 tnf-α组髓核细胞periostin蛋白含量变化；j:dcas9-krab覆盖nf-κb p65结合的periostin启动子示意图；k：dcas9-krab覆盖nf-κb p65结合的periostin启动子后periostin的表达变化图。
19.图3：a：大鼠尾巴的静态加压装置及大鼠椎间盘磁共振影像图；b：大鼠椎间盘mri pfirrmann分级图。
20.图4：a：大鼠尾椎装静态加压装置后分别注射igg抗体或periostin中和抗体的椎间盘磁共振影像图；b：大鼠椎间盘mri pfirrmann分级。
具体实施方式
21.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
22.实施例1机械负荷对髓核细胞的影响
23.髓核是乳白色半透明胶状体，富于弹性，为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间。由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。髓核细胞的过早衰老与凋亡是导致椎间盘退行性变过程的主要原因之一，主要表
现为退变椎间盘内髓核细胞功能降低和数量减少，使得其ⅱ型胶蛋白聚糖等基质分泌量下降，最终导致椎间盘维持脊柱高度、承受各方应力等生物力学功能丧失。本实施例研究了机械负荷对髓核细胞的影响。
24.实验方法：(1)培养髓核细胞，将其分为两组(实验组a和实验组b)，分别将实验组a和实验组b置于1kpa和40kpa的水凝胶下培养24小时，采用β-半乳糖苷酶活性染色法对处理后的髓核细胞进行染色，并置于光学纤维镜下观察髓核细胞；(2)培养髓核细胞，将其分为两组(实验组a和实验组b)，分别将实验组a和实验组b置于1kpa和40kpa的水凝胶下培养24小时，提取两组髓核细胞的rna，进行qpcr检测基质分解代谢以及cdkn1a、cdkn2a、 il1a、il1b、il6、cxcl8、cdk4和cdk6的表达水平变化。
25.实验结果如图1所示。由图1a可知，实验组b的髓核细胞的体积增大，且细胞多呈现蓝色，表明40kpa的水凝胶下培养的髓核细胞衰老增加。由图1b和图1c可知，40kpa的水凝胶下培养的髓核细胞中衰老分泌相关分子cdkn2a、 il1a、il1b、il6和cxcl8的表达增加，而细胞周期相关分子cdk4、cdk6 的表达降低。综上可知，40kpa的水凝胶机械负荷下可诱导髓核细胞的衰老。
26.实施例2机械负荷对髓核细胞nf-κb信号通路的影响
27.nf-κb是一种常见的转录因子，可以被炎症因子、生长因子或趋化因子等激活。nf-κb由两类亚基形成同源或异源二聚体。一类亚基包括p65(也称rela)、 relb和c-rel；另一类亚基包括p50和p52。最常见的nf-κb亚基组成形式为 p65/p50或p65/p65。nf-κb未被激活时和iκb-α形成一个复合物，分布在细胞浆中。在炎症因子、生长因子或趋化因子等可以激活nf-κb的刺激存在的情况下，iκb-α会在ser32和ser36被磷酸化，随后被泛素-蛋白酶体途径降解。nf-κb 和iκb-α解聚后，其核定位序列被暴露，从而被转运到细胞核内促进nf-κb依赖的基因转录。通过免疫染色检测nf-κb的主要亚基p65是否被转移到细胞核内，就可以判断nf-κb是否被激活。本发明研究了机械负荷对髓核细胞nf-κb 信号通路的影响。
28.实验方法：(1)培养髓核细胞，将其分为两组(实验组a和实验组b)，分别将实验组a和实验组b置于1kpa和40kpa的水凝胶下培养24小时，提取两组髓核细胞的rna，进行rna测序,对测序的结果对测序获得的差异表达基因进行go分析和kegg富集分析。采用q-pcr对衰老相关的分子进行验证，采用免疫染色检测nf-κb的主要亚基p65是否被转移到细胞核内。(2)分别用 10ng/ml tnf-α和等量的pbs处理人的髓核细胞48小时，处理后，收取蛋白样品，进行western blot实验。(3)分别用10ng/ml tnf-α和等量的pbs处理人的髓核细胞，24小时后取培养基上清，用elisa检测上清中periostin的分泌量。
29.实验结果如图2所示。由图2a和图2c可知，应力促进细胞衰老，以及促进nf-κb信号通路的激活。由图2b可知，在40kpa的水凝胶下培养的髓核细胞的p65入核增加。由图2d和图2e可知，高应力下分泌蛋白periostin的表达量升高、分泌量增多。由图2f和图2g可知，机械负荷下髓核细胞的nf-kb通路显著上调以及periostin的开放峰明显增加。由图2h可知，相比与pbs组， tnf-α处理后periostin和磷酸化的p65蛋白表达量升高，而总的p65表达量差别不大。由图2i可知，用tnf-a处理的髓核细胞上清中periostin的分泌量相对于pbs组明显升高。由图2j可知，通过dcas9-krab覆盖nf-κb p65结合的 periostin启动子，结果发现periostin的表达明显降低。
30.实施例3sipostn及periostin中和抗体对机械负荷下的椎间盘退变的影响
31.实验方法：选取15只健康成年大鼠，分为3组，sham+gfp组：椎间盘注射sigfp病毒液后在大鼠尾椎装上静态加压装置，但不施压；op+gfp组：椎间盘注射sigfp病毒液后在大鼠尾椎装上静态加压装置给予施压；op+sipostn 组：椎间盘注射sipostn病毒液后在大鼠尾巴装上静态加压装置，给予施压。op: compression。所有组别均于注射病毒液3天后装上静态加压装置，2周后，对上述3组大鼠进行椎间盘磁共振检查，椎间盘磁共振影像结果如图3所示。表1 为pfirrmann椎间盘退变的mri分级标准。
32.表1
[0033][0034]
由图3可知，sham+gfp组的大鼠椎间盘无明显退变，说明装上加压装置和在椎间盘注射病毒液不会造成明显的椎间盘损伤；op+gfp组可见明显的椎间盘高度降低且信号变黑，说明椎间盘退变显著，然而在op+sipostn组中，椎间盘的高度和信号得到一定程度的缓解，表明敲低periostin可以缓解机械负荷下的椎间盘退变。
[0035]
实施例4
[0036]
选取10只健康成年大鼠，分别对大鼠进行手术，诱导其椎间盘退变。诱导成功后，将大鼠分为两组，一组为实验组，一组为对照组。实验组分别在每只大鼠的椎间盘中注射10ug/50ul periostin中和抗体，每隔2天注射1次，一共注射3次。对照组分别在每只大鼠的椎间盘中注射等量的igg抗体，每隔2天注射1次，一共注射3次。对上述两组大鼠进行椎间盘磁共振检查，椎间盘磁共振影像结果如图4所示。
[0037]
由图4可知，op+igg组可见明显的椎间盘高度降低且信号变黑，明显的椎间盘退变，而op+abs组可见大鼠的椎间盘的高度和信号得到一定程度的缓解，表明periostin中和抗体可以缓解机械负荷下的椎间盘退变。
[0038]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。