一种新型冠状病毒S蛋白的表达方法与流程

一种新型冠状病毒s蛋白的表达方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是一种新型冠状病毒s蛋白的表达方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒（sars-cov-2）是引发新型冠状病毒肺炎的病原体。其中，新型冠状病毒的s蛋白通过不同的受体结合结构域与宿主细胞结合，是宿主中和抗体重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。如何高效大规模生产新型冠状病毒s蛋白成为了本领域的研究热点之一。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是提供一种新型冠状病毒s蛋白的表达方法，提高了新型冠状病毒s蛋白表达的效率，本发明所采取的技术方案如下。
4.一种新型冠状病毒s蛋白，其由seq id no.1的氨基酸序列表示。
5.一种seq id no.1的氨基酸序列表示的新型冠状病毒s蛋白的编码基因，其由seq id no.2的核苷酸序列表示。
6.一种seq id no.2的核苷酸序列表示的编码基因的上游引物，其由seq id no.3的核苷酸序列表示。
7.一种seq id no.2的核苷酸序列表示的编码基因的下游引物，其由seq id no.4的核苷酸序列表示。
8.一种重组质粒，其包括seq id no.2的核苷酸序列所表示的编码基因。
9.一种重组大肠杆菌，其包含有seq id no.2的核苷酸序列所表示的编码基因。
10.一种上述新型冠状病毒s蛋白的表达方法，包括以下步骤：a、pcr扩增；50μl反应体系中，加入1.5μl的由seq id no.2的核苷酸序列表示的新型冠状病毒s蛋白编码基因，50 μmol/l的由seq id no.3的核苷酸序列表示的上游引物1μl，50 μmol/l的由seq id no.4的核苷酸序列表示的下游引物1μl，1μl的15mmol/l的dntp，5
×
缓冲液 10μl，pfu dna聚合酶 0.5μl，其余用双蒸水补齐，pcr反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性40s，56℃退火45s，72℃延伸65s，共45个循环；b、将步骤a得到的扩增产物进行电泳纯化，将纯化后的新型冠状病毒s蛋白编码基因和ppic9质粒分别进行ecorⅰ和xhoⅰ双酶切，然后使用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒；c、将重组质粒热激转化bl21(de3)大肠杆菌，然后使用80μg/ml卡那霉素lb培养板进行筛选，得到重组大肠杆菌；d、配置培养基；培养基的成分为，葡萄糖 6.5 g/l、甘油 12g/l、d-山梨醇 10 g/l、蛋白胨 5 g/l、磷酸二氢钾 2.5g/l、氯化铵 5g/l、硫酸镁 5 g/l、硫酸亚铁1.5 g/l、柠檬酸钠 2.0 g/l、酵母粉 1g/l、三甲基甘氨酸 3.0 g/l；培养基的ph值为7.3；
e、将重组大肠杆菌的种子液按照3%接种量接种到培养基中，培养温度为35～36℃，ph值维持在7.3～7.5，培养3小时；f、加入诱导剂iptg至终浓度为0.5 mmol/l，诱导表达蛋白，然后离心收集菌体，并使用超声波进行菌体破碎，然后使用洗脱纯化得到新型冠状病毒s蛋白。
11.采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明可实现高效率的新型冠状病毒s蛋白表达，在大规模量产条件下新型冠状病毒s蛋白表达水平可达311.24mg/l,便于对于新型冠状病毒的研究和相关疫苗的后续研发。
附图说明
12.图1是洗脱纯化后得到的新型冠状病毒s蛋白的电泳分析图。
具体实施方式
13.以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
14.bl21(de3)大肠杆菌、内切酶ecorⅰ和xhoⅰ、pfu dna聚合酶、dna连接酶、ppic9质粒、lb培养板等实验材料均购自赛默飞世尔公司。
实施例
15.a、pcr扩增；50μl反应体系中，加入1.5μl的由seq id no.2的核苷酸序列表示的新型冠状病毒s蛋白编码基因，50 μmol/l的由seq id no.3的核苷酸序列表示的上游引物1μl，50 μmol/l的由seq id no.4的核苷酸序列表示的下游引物1μl，1μl的15mmol/l的dntp，5
×
缓冲液 10μl，pfu dna聚合酶 0.5μl，其余用双蒸水补齐，pcr反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性40s，56℃退火45s，72℃延伸65s，共45个循环；b、将步骤a得到的扩增产物进行电泳纯化，将纯化后的新型冠状病毒s蛋白编码基因和ppic9质粒分别进行ecorⅰ和xhoⅰ双酶切，然后使用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒；c、将重组质粒热激转化bl21(de3)大肠杆菌，然后使用80μg/ml卡那霉素lb培养板进行筛选，得到重组大肠杆菌；d、配置培养基；培养基的成分为，葡萄糖 6.5 g/l、甘油 12g/l、d-山梨醇 10 g/l、蛋白胨 5 g/l、磷酸二氢钾 2.5g/l、氯化铵 5g/l、硫酸镁 5 g/l、硫酸亚铁1.5 g/l、柠檬酸钠 2.0 g/l、酵母粉 1g/l、三甲基甘氨酸 3.0 g/l；培养基的ph值为7.3；e、将重组大肠杆菌的种子液按照3%接种量接种到培养基中，培养温度为35～36℃，ph值维持在7.3～7.5，培养3小时；f、加入诱导剂iptg至终浓度为0.5 mmol/l，诱导表达蛋白，然后离心收集菌体，并使用超声波进行菌体破碎，然后使用洗脱纯化得到新型冠状病毒s蛋白（seq id no.1）。
16.上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。


技术特征：
1.一种新型冠状病毒s蛋白，其特征在于由seq id no.1的氨基酸序列表示。2.一种seq id no.1的氨基酸序列表示新型冠状病毒s蛋白的编码基因，其特征在于由seq id no.2的核苷酸序列表示。3.一种seq id no.2的核苷酸序列表示的编码基因的上游引物，其特征在于由seq id no.3的核苷酸序列表示。4.一种seq id no.2的核苷酸序列表示的编码基因的下游引物，其特征在于由seq id no.4的核苷酸序列表示。5.一种重组质粒，其特征在于包括seq id no.2的核苷酸序列所表示的编码基因。6.一种重组大肠杆菌，其特征在于包含有seq id no.2的核苷酸序列所表示的编码基因。7.一种权利要求1所述新型冠状病毒s蛋白的表达方法，其特征在于包括以下步骤：a、pcr扩增；50μl反应体系中，加入1.5μl的由seq id no.2的核苷酸序列表示的新型冠状病毒s蛋白编码基因，50 μmol/l的由seq id no.3的核苷酸序列表示的上游引物1μl，50 μmol/l的由seq id no.4的核苷酸序列表示的下游引物1μl，1μl的15mmol/l的dntp，5
×
缓冲液 10μl，pfu dna聚合酶 0.5μl，其余用双蒸水补齐，pcr反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性40s，56℃退火45s，72℃延伸65s，共45个循环；b、将步骤a得到的扩增产物进行电泳纯化，将纯化后的新型冠状病毒s蛋白编码基因和ppic9质粒分别进行ecorⅰ和xhoⅰ双酶切，然后使用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒；c、将重组质粒热激转化bl21(de3)大肠杆菌，然后使用80μg/ml卡那霉素lb培养板进行筛选，得到重组大肠杆菌；d、配置培养基；培养基的成分为，葡萄糖 6.5 g/l、甘油 12g/l、d-山梨醇 10 g/l、蛋白胨 5 g/l、磷酸二氢钾 2.5g/l、氯化铵 5g/l、硫酸镁 5 g/l、硫酸亚铁1.5 g/l、柠檬酸钠 2.0 g/l、酵母粉 1g/l、三甲基甘氨酸 3.0 g/l；培养基的ph值为7.3；e、将重组大肠杆菌的种子液按照3%接种量接种到培养基中，培养温度为35～36℃，ph值维持在7.3～7.5，培养3小时；f、加入诱导剂iptg至终浓度为0.5 mmol/l，诱导表达蛋白，然后离心收集菌体，并使用超声波进行菌体破碎，然后使用洗脱纯化得到新型冠状病毒s蛋白。

技术总结
本发明涉及一种新型冠状病毒S蛋白的表达方法，包括以下步骤：A、PCR扩增；B、将步骤A得到的扩增产物进行电泳纯化后与制粒连接；C、将重组质粒热激转化BL21(DE3)大肠杆菌；D、配置培养基；E、将重组大肠杆菌的种子液按照3%接种量接种到培养基中培养；F、诱导表达蛋白，然后离心收集菌体，并使用超声波进行菌体破碎，然后使用洗脱纯化得到新型冠状病毒S蛋白。本发明提高了新型冠状病毒S蛋白表达的效率。提高了新型冠状病毒S蛋白表达的效率。提高了新型冠状病毒S蛋白表达的效率。


技术研发人员：李红臣 寇佳琳
受保护的技术使用者：河北佑仁生物科技有限公司
技术研发日：2022.02.22
技术公布日：2022/4/22