水稻Os12g0594200基因在提高水稻耐盐性方面的应用

水稻os12g0594200基因在提高水稻耐盐性方面的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，具体涉及水稻os12g0594200基因在提高水稻耐盐性方面的应用。


背景技术：

2.植物的生长发育受各种环境因子介导调控，不利的环境因素抑制植物的生长发育。在植物的生长过程中，会经常遭受各种生物和非生物胁迫，其中，盐渍是严重危害植物生长发育的一种非生物胁迫。
3.水稻(oryza sativa l.)是我国重要的粮食作物之一，其可持续生产对保障我国粮食安全具有重要意义。水稻属于沼生植物，其特殊的栽培方式使其成为盐渍化土地开发利用的先锋作物。而水稻又是对盐胁迫高度敏感的作物，在不同的生长发育过程中对盐的敏感性不同(munns r,tester m.mechanisms of salinity tolerance[j].annual review plant biology.2008,59(1):651-681)，不同基因型水稻对盐胁迫响应也存在差异(ali m n,yeasmin l,gantait s,et al.screening of rice landraces for salinity tolerance at seedling stage through morphological and molecular markers[j].physiology and molecular biology of plants.2014,20(4):411-423)。因此，挖掘水稻耐盐相关基因，探究水稻耐盐机理，培育耐盐水稻新品种，提高水稻的耐盐性，对保障我国粮食安全具有重要意义。
[0004]
关于水稻耐盐基因或qtl的鉴定，国内外已有大量研究报道。井文等(井文,章文华.水稻耐盐基因定位与克隆及品种耐盐性分子标记辅助选择改良研究进展[j].中国水稻科学，2017,31(2):111-123)统计分析了47个水稻耐盐qtl研究，共检测到964个耐盐相关qtl。水稻各生长发育时期的耐盐qtl在水稻12条染色体上均有分布，其中幼苗期耐盐qtl有514个，超过总数的50％，占比最多。但检测到的大部分qtl表型贡献率较小，表型贡献率在20％以上的耐盐qtl只有101个，因此，水稻耐盐性相关基因精细定位和克隆难度较大，目前在育种上利用的耐盐qtl主要是位于水稻第1染色体上的qskc-1和saltol两个位点(ren z,gao j,li l,et al.arice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter[j].nature genetics.2005,37(10):1141-1146)。利用突变体来分离耐盐基因已成为水稻耐盐新基因挖掘的有效途径之一，筛选鉴定利用t-dna、转座子(ac/ds)和逆转座子(tos17)等插入元件构建的水稻插入突变体，可以大大节省后期的突变基因分离时间，为挖掘新的耐盐水稻相关基因提供新的理论依据。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供水稻os12g0594200基因在提高水稻耐盐性方面的应用，首次证明了基因os12g0594200在调控水稻耐盐性中具有重要作用。
[0006]
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0007]
水稻os12g0594200基因在提高水稻耐盐性方面的应用。
[0008]
本发明通过对os12g0594200基因的t-dna插入突变体株系进行鉴定，获得os12g0594200基因功能缺失的纯合突变体。使用150mm nacl对突变体和野生型dj进行盐胁迫处理10d后，发现os12g0594200基因功能缺失突变体的存活率显著高于野生型。基因os12g0594200在提高水稻耐盐性上具有潜在的应用价值，可利用分子改良技术在生产中加以利用，对水稻高产、稳产和抗逆育种具有重要的实践意义。
[0009]
优选地，水稻os12g0594200基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；水稻os12g0594200基因编码蛋白质具有seq id no:2所示的氨基酸序列。
[0010]
进一步优选地，调控水稻中os12g0594200基因功能缺失或低表达，提高水稻耐盐性。
[0011]
优选地，所述应用为培育耐盐水稻品系。
[0012]
进一步优选地，对水稻os12g0594200基因进行敲除或调控水稻os12g0594200基因低表达，获得耐盐性水稻。基因os12g0594200在调控水稻耐盐性中具有重要作用，本发明为提高水稻耐盐胁迫能力和培育耐盐水稻新品系提供了理论依据，可利用分子改良技术在生产中加以利用，对我国农业生产具有重要的应用价值。
[0013]
进一步优选地，选用水稻os12g0594200基因功能缺失突变体参与杂交，选育耐盐性水稻。
附图说明
[0014]
图1为本发明中t-dna插入突变体鉴定电泳图；
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图2为本发明中os12g0594200基因t-dna插入位点示意图；
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图3为本发明中野生型dj和突变体os12g0594200基因表达量分析；
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图4为本发明中正常条件下野生型dj和突变体幼苗表型；标尺：13cm；
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图5为本发明中150mm nacl胁迫10d野生型dj和突变体幼苗表型；标尺：13cm；
[0019]
图6为本发明中150mm nacl胁迫10d野生型dj和突变体幼苗存活率统计；**p《0.01。
具体实施方式
[0020]
本发明主要提供了os12g0594200基因(水稻数据库the rice annotation project(rap)的登录号)在调控水稻耐盐性方面的应用，提供了培育耐盐水稻品系的新思路。os12g0594200基因具有seq id no:1所示的核苷酸序列，其编码蛋白质具有seq id no:2所示的氨基酸序列。
[0021]
下面结合具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。
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实施例
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本实施例的水稻os12g0594200基因在提高水稻耐盐性方面的应用，具体说明如下：
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1、os12g0594200基因突变体
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os12g0594200基因突变体购买于韩国水稻t-dna突变体库(rice t-dna insertion seqence database)，编号为pfg_4a-00132.r，遗传背景为粳稻品种dongjin(dj)。将种子用10％h2o2消毒10min，蒸馏水冲洗5-6次，置于培养箱30℃催芽萌发2d。将露白
的种子播于pcr板孔(底部有小孔)中，固定在泡沫板上，泡沫板漂于水培盒子中，用清水培养生长至1叶1心，取新鲜叶片，保存于-80℃低温冰箱备用。
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2、os12g0594200基因突变体的鉴定
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使用ctab法提取水稻幼苗新鲜叶片的dna，ctab提取液配制方法如下表1所示：
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表1ctab提取液
[0029][0030]
依据t-dna突变体库中，编号pfg_4a-00132.r突变体株系t-dna插入位点附近侧翼序列信息和pga2715载体序列信息，设计t-dna插入位置两侧序列的引物rp(seq id no:4)和lp(seq id no:3)，外源t-dna边界引物rb(seq id no:5)，引物序列见表2。
[0031]
表2引物列表
[0032][0033]
以dna为模板，依据两轮pcr原理进行pcr扩增(扩增体系如下表3所示)，第一轮：鉴定有无t-dna插入，以lp+rp为一对引物进行pcr扩增；第二轮：鉴定突变体纯合突变或杂合突变，以rp+rb为一对引物进行扩增。然后，取10μl pcr产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，120v电泳25min，用凝胶成像系统观察并拍照。
[0034]
如图1所示，与野生型dj相比，突变体mutant16-3用lp+rp引物扩增无目的条带，表明mutant16-3含有t-dna插入；而用rp+rb引物扩增有明显条带，表明突变体mutant16-3为纯合突变体。
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表3扩增体系
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将所鉴定的纯合体pcr产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序
结果比对分析显示，突变体mutant16-3中t-dna插入在基因os12g0594200第1外显子区域，在atg下游25bp处插入(如图2所示)。由于t-dna插入载体pga2715靠近rb端不含有启动子，因此t-dna插入不会导致插入位点附近的转录本表达升高。
[0038]
采用trizol试剂(invitrogen)提取突变体和dj的总rna，采用mmlv逆转录酶(transgen biotech)试剂盒进行rna的反转录，采用go taq qpcr反应混合体系(promega)进行实时荧光定量pcr，定量引物os12g0594200-f(seq id no:6)和os12g0594200-r(seq id no:7)见表2。
[0039]
结果如图3所示，与野生型dj相比，突变体mutant16-3株系os12g0594200基因表达量几乎为0。因此os12g0594200基因t-dna插入突变体mutant16-3属于功能缺失型纯合突变体。
[0040]
3、耐盐实验
[0041]
选取野生型dj和纯合突变体mutant16-3株系饱满一致的种子，用10％h2o2消毒10min，蒸馏水冲洗5-6次，置于培养箱28℃催芽萌发2d。将露白的种子播于pcr板孔(底部有小孔)中，固定在泡沫板上，泡沫板漂于水培盒子中。先用清水培养5d，再用1/4全营养液培养2d，用1/2全营养液培养2d，之后采用全营养液培养。水培营养液配方参照国际水稻所营养液等方法：1.5mm nh4no3,0.3mm nah2po4,0.5mm k2so4,1.0mm cacl2,1.6mm mgso4,0.5mm nasio3,20μm fe-edta,0.075μm(nh4)6mo7o
24
,18.9μm h3bo3,9.5μm mncl2,0.1μm cuso4,0.2μm znso4,70.8μm citric acid,ph 5.5。营养液ph值保持在5.2-5.5，每2d更换一次营养液。
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苗龄15d后，挑选长势一致的水稻幼苗，用海绵固定于有孔的漂浮板上，用全营养液继续培养。待水稻幼苗生长至5叶1心时，在营养液中加入150mm nacl(终浓度)进行盐胁迫处理，以正常营养液培养作为对照。每3d更换营养液及nacl处理液，盐胁迫处理10d后观察野生型dj和突变体mutant16-3株系生长状况。
[0043]
在正常营养液培养条件下，和野生型dj和突变体mutant16-3株系生长状况均良好(图4)，而经150mm nacl处理10d后，突变体mutant16-3的绿叶数明显多于野生型dj，表明其生长状况明显优于野生型dj(图5)。
[0044]
对盐胁迫处理后水稻幼苗存活率进行统计分析，结果表明，正常条件下野生型dj和突变体mutant16-3株系存活率均为100％，而150mm nacl处理10d后，突变体mutant16-3株系存活率高达94.44％，而野生型dj的存活率仅为69.44％，差异达极显著水平(图6)。表明os12g0594200基因的功能缺失可显著提高水稻耐盐胁迫的能力。
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因此，在实际应用中，可通过基因编辑技术如crispr-cas9等分子改良技术对os12g0594200基因进行敲除或低表达，获得高耐盐性水稻。也可选用水稻os12g0594200基因功能缺失突变体参与杂交，选育耐盐性水稻。本发明为快速创制耐盐水稻新品系提供了理论依据和一种简单有效的技术手段。