拟杆菌作为预测自闭症疗效的客观指标

文档序号:30411736发布日期:2022-06-15 09:46阅读:281来源:国知局
拟杆菌作为预测自闭症疗效的客观指标

1.本发明涉及疾病诊断和治疗领域,具体的说,涉及孤独症谱系障碍病程相关微生物菌群丰度的诊断和药物治疗。


背景技术:

2.孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,asd)是一种高发病率的广泛性儿童神经发育障碍性疾病。主要包括狭义自闭症、亚斯伯格症、儿童崩解症、广泛性发育障碍等一系列症状共通而程度不一的疾病。
3.目前asd的病因和发病机制尚未完全明确,但有研究表明其与遗传和环境风险因素有关,其中,免疫失调和胃肠道紊乱是特别值得关注的,因为许多研究报告了asd患者的外周血、肠和神经免疫系统异常。asd患者死后的大脑显示小脑和大脑皮层的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活增加,同时脑脊液和大脑皮层区域的促炎细胞因子水平增加。此外,asd相关基因与免疫系统相关,并且这些基因的突变与asd表型相关,包括对社会交流功能重要的大脑区域的结构和功能连接的丢失。至于胃肠道紊乱,有平行研究显示,与对照组相比,asd人群中胃肠道疾病和紊乱的患病率更高。asd患者的胃肠道症状包括腹泻、便秘、腹痛和胃反流。肠道上皮缺乏完整性和肠通透性增加也有报道。
4.许多研究报告了asd与对照组肠道菌群的差异,但尚未确定asd明确的微生物特征。目前的研究也有不一致的结果。
5.一些研究发现asd中微生物群的多样性增加,而另一些研究则显示出相反的趋势,即多样性和丰富度降低,或多样性没有差异。多种因素可能导致这些差异,包括症状严重程度,合并症,生活方式,病史,实验研究方式和固有的异质性。
6.虽然全球已有多家临床机构已经完成或正在开展萝卜硫素(sulforaphane,sfn)对自闭症治疗效果的临床试验,然而,目前尚无可靠的客观指标能早期识别自闭症患者。另一方面,sfn对自闭症治疗的有效性也存在极大的个体差异,目前尚不清楚sfn治疗自闭症有效性的生物学机制。目前亟待寻找与疾病症状严重程度相关的客观指标,一方面有助于早期识别自闭症患者,预测其症状严重程度;另一方面为有效治疗自闭症提供新的方案。


技术实现要素:

7.本发明针对自闭症症状严重程度相关的客观指标,提供了与自闭症病症状病程相关的肠道菌群,通过16s rrna测序,检测asd患者病程相关的肠道菌群丰度差异,进而为判断asd病程以及为指导sfn用药,为精准治疗提供依据。
8.具体的,一方面本发明提供检测拟杆菌门(bacteroides)丰度的试剂在制备检测药物治疗孤独症进程的试剂盒或检测试剂中的应用。
9.另一方面,本发明提供检测拟杆菌门(bacteroides)丰度的试剂在制备指导药物治疗孤独症进程的试剂盒或药物检测试剂中的应用。
10.在一些实施方案中,所述拟杆菌门包括产碱杆菌科(alcaligenaceae),黄色单胞
菌科(xanthomonadaceae),生丝微菌科(hyphomicrobiaceae),毛螺菌科(lachonspiraceae)和拟杆菌科(bacteroidaceae)。
11.在一些实施方案中,检测拟杆菌门丰度的试剂包括针对拟杆菌的引物、抗体。
12.在一些实施方案中,检测拟杆菌门丰度的引物是扩增拟杆菌门16s rdna便于后续测序的扩增引物。
13.在一些实施方案中,所述药物为萝卜硫素(sulforaphane,sfn)。
14.在一些实施方案中,本发明提供了一种筛选与asd病程相关的肠道菌群的方法。通过比较与asd患者和性别年龄匹配的11例正常对照之间的肠道菌群差异。我们发现患者和正常对照之间的肠道菌群在α-多样性和β-多样性指标上均存在显著差异,说明asd患者存在肠道菌群的紊乱。
15.具体的,通过比较健康对照组、asd疾病组、药物治疗前后、药物治疗有效组和无效组之间肠道菌群的差异,寻找和症状改善程度显著相关的菌,找到能作为客观指标预测个体对药物治疗有效性的菌群。
16.所述筛选方法如下:
17.1)分组,粪便样本的采集;
18.2)粪便样本中肠菌基因组dna的提取;
19.3)肠道菌群16s rrna基因测序;
20.4)数据分析。
21.在一些实施方案中,本发明公开了与asd患者病程相关的具体肠道菌群种类,我们发现在2个门(拟杆菌门bacteroidetes、放线菌门actinobacteria)、1个纲、3个目、5个科、10个属的水平上存在显著差异。其中拟杆菌门在健康对照中相对丰度显著增加,而放线菌门在asd患者中相对丰度显著增加(p=0.0025and 0.0260,respectively)。在科水平上,假单胞菌科、棒状杆菌科、葡萄球菌科、天麻菌科在健康对照中的相对丰度显著升高(分别是p=0.0011,0.0044,0.0003,and 0.0004)。同时拟杆菌门/厚壁菌门(bacteroidetes/firmicutes)的比值在asd中是显著降低的(p=0.022)。
22.在一些实施方案中,本发明公开了一种萝卜硫素(sulforaphane,sfn)治疗肠道菌群失调的asd患者的方法。
23.对肠道11例asd患者中有9例进行了为期12周的萝卜硫素治疗,使用医生评定量表来评估患者治疗前后的临床症状变化。医生评定量表《osu孤独症评定量表—dsm-iv》(osu autism rating scale-dsm-iv,oars-4)(osu总分平均分是so社交障碍、co沟通障碍和st重复刻板行为评定的三者平均分)。此量表不仅有总分可以评估被试相应问题的总体严重程度,而且都包含丰富维度,适合应用于临床表型与生物特征的关联研究。我们发现,虽然总体而言,osu总分平均分在治疗前后有改变的趋势,但无显著差异。仅有5/9的患者在sfn治疗后出现了显著的症状改善,这些研究结果提示萝卜硫素对自闭症的治疗具有个体差异。
24.进一步根据osu总分变化情况,将9例asd患者分为sfn治疗有效的患者(responders)和治疗无效组(non-responders)。其症状改善在osu总分和so社交障碍分维度评分中治疗前(b)治疗后(e),以及治疗前后差值(osu change)出现显著差异。
25.在一些实施方案中,本发明公开了sfn治疗asd患者的肠道菌群的肠道变化。
26.分析sfn治疗有效的患者和治疗无效组之间的基线时,即sfn治疗前肠道菌群差
异,我们发现,拟杆菌和双歧杆菌在有效组和无效组之间存在显著差异。
27.进一步研究表明,产碱杆菌科、黄色单胞菌科、生丝微菌科、毛螺菌科、拟杆菌科的相对丰度和osu总分的变化呈显著相关性。提示肠道菌群的相对丰度变化与症状改善显著相关。其中拟杆菌很有可能是预测asd患者对sfn治疗有效性的一个重要指标。
28.本发明的有益效果包括:
29.肠道菌群的变化与asd症状改变显著相关,其中拟杆菌很有可能是预测asd患者对sfn治疗有效性的一个重要指标,拟杆菌显著增加的患者可能对sfn治疗有较好的疗效。这一结果对个体化治疗有效性进行预测,对节约医疗成本和患者的时间成本、对实现自闭症精准治疗具有重要的指导意义。
附图说明
30.为了更清楚的说明本技术实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图做简单的介绍,显而易见的下面描述中的附图,仅仅是本技术中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的技术方案以及相应的附图。
31.图1健康对照组和asd患者之间的肠道菌群差异分析,其中:(a)为稀释曲线;(b)为秩-丰度曲线;(c、d)为kruskal-wallis检验计算α-多样性;(e、f)为物种丰富度;(g)为物种间进化关系指数;(h)为均匀度;(i)为总测序物种覆盖率;(j、k)为未加权和加权的unifrac主坐标分析(l)为丰度量多维标度。
32.图2通过t-tests统计分析检测asd患者和健康对照组之间的肠道微生物群差异。(a-h)为在门、纲、目、科和属水平上比较asd患者和健康对照受试者的肠道微生物群;(i)为lefse分析进化分支图。
33.图3sfn治疗asd患者osu评分差异。
34.图4sfn治疗有效组评分。
35.图5sfn治疗asd与正常人的肠道菌群多样性比较。
36.图6拟杆菌门和双歧杆菌在sfn治疗asd有效和无效组以及正常人的肠道菌群中的丰度变化。
37.图7拟杆菌门不同菌科的丰度随sfn治疗asd的变化,其中,(a)为产碱菌科,(b)为黄色单胞菌科;(c)为生丝微菌科;(d)为毛螺菌科、(e、f)为拟杆菌科。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例,而不是全部实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
39.实施例1:检测asd患者和正常人之间的肠道菌群差异
40.步骤1:粪便样本的采集
41.按粪便样本采集管omnimet.gut tube(dna genotek,inc.)说明书指示新鲜采集粪便样本,充分与管中缓冲液混匀后室温尽快运输到实验室-80℃低温保存直至下一步实
验。
42.步骤2:粪便样本中肠菌基因组dna的提取
43.按照粪便样本全基因组dna提取试剂盒omega soil dna kit(d5625omega soil dna kit(d5625 01)omega bio tek,norcross,ga,usa)说明书指示进行提取,dna样本存放于-20℃。dna的浓度和质量通过nanodrop nd-1000spectrophotometer和琼脂糖凝胶电泳检测。
44.步骤3:肠道菌群16s rrna基因测序
45.肠道菌群16s rrna基因保守区v3-v4经过以下两引物通过聚合酶链反应(pcr)扩增:正向引物338f(5'-actcctacgggaggcagca-3')反向引物806r(5'-ggactachvgggtwtctaat-3')。pcr扩增产物通过vazyme vahtstm dna clean beads(vazyme,nanjing,china)纯化后,在illumina miseq测序平台上进行测序。
46.步骤4:数据分析
47.根据测序结果,首先分析微生物多样性,采用uparse软件比对rdp数据库,按序列相似性大于97%聚成一个otu(operational taxonomic units),得到out物种信息,分析组间out数目(out number)和out丰度(out abundance)差异,绘制样本的稀释曲线,以确认研究中测序深度的充分性。α多样性是指单个样品的物种多样性,常用物种丰富度(abserved-species、chao)和多样性指数(shannon、simpson)来度量,faith_pd评价物种间进化关系指数,pielou_e均匀度指数,good's coverage衡量测序量的覆盖率,即被检测到的物种的比例。健康对照和asd患者组间的差异通过kruskal-wallis rank-sum test和dunn's test进行统计分析,p《0.05提示有显著差异。β多样性分析,通过out数据进行多变量主坐标分析principal coordinates analysis(pcoa),直观评价不同样本中微生物组成的相似性和差异性。unifrac用于评估微生物群落样本间的进化距离,非加权unweighted unifrac仅考虑微生物成员在群落中存在与否,而不考虑其丰度高低,加权weighted unifrac兼顾群落成员之间的系统发育关系以及他们在各自群落中的丰度高低。
48.根据结果,绘制了样本稀释曲线、秩-丰度曲线、α-多样性检测、物种丰富度、物种间进化关系指数、均匀度、总测序物种覆盖率、未加权和加权unifrac主坐标分析(pcoa)和未加权unifrac绘制的丰度量多维标度(nmds)评估β多样性来比较正常人和asd患者之间肠道菌群的差异。
49.结果表明同等测序深度条件下,asd组检出的out数目显著降低,且物种丰富度(observed-species,p=0.0452)和α-多样性(shannon指数,p=0.0386)降低,其他指数的差异无显著性(参见图1a-i)

50.使用未加权和加权unifrac绘制的主坐标分析(pcoa)以及未加权unifrac绘制的丰度量多维标度(nmds)评估发现:健康对照组和asd患者的粪便微生物群分别聚集在一起,未加权pcoa和nmds图显示的聚集分布程度相似,这些结果一致表明asd患者和健康对照组的肠道微生物群之间存在不同的β-多样性(参见附图1j-l)。
51.实施例2与asd病程相关的肠道菌群的确定
52.比较正常患者和asd患者肠道菌群的差异,我们发现在2个门(拟杆菌门bacteroidetes、放线菌门actinobacteria)、1个纲、3个目、5个科、10个属的水平上存在显著差异。
53.其中拟杆菌门在健康对照中相对丰度显著增加,而放线菌门在asd患者中相对丰度显著增加(p=0.0025and 0.0260,respectively)。在科水平上,假单胞菌科、棒状杆菌科、葡萄球菌科、天麻菌科在健康对照中的相对丰度显著升高(分别是p=0.0011,0.0044,0.0003,and 0.0004)。同时拟杆菌门/厚壁菌门(bacteroidetes/firmicutes)的比值在asd中是显著降低的(p=0.022)(参见图2)。
54.实施例3:sfn治疗asd患者效果测定
55.sfn为已知的治疗asd患者药物,但其治疗效果仍未获得普遍的认可,本实施例通过给予asd患者sfn,观察其治疗效果。
56.选取9名asd患者进行为期12周的萝卜硫素治疗,使用医生评定量表来评估患者治疗前后的临床症状变化。医生评定量表《osu孤独症评定量表—dsm-iv》(osu autism rating scale-dsm-iv,oars-4)。治疗后测试结果如表1所示:
57.表1.在sfn治疗中的osu总分和分维度评分
[0058][0059]
我们发现,虽然总体而言,osu总分平均分在治疗前后有改变的趋势,但无显著差异。仅有5/9的患者在sfn治疗后出现了显著的症状改善,这些研究结果提示萝卜硫素对自闭症的治疗具有个体差异(图3)。
[0060]
进一步根据osu总分变化情况,将9例asd患者分为sfn治疗有效的患者(responders)和治疗无效组(non-responders)。其症状改善在osu总分和so社交障碍分维度评分中治疗前(b)治疗后(e),以及治疗前后差值(osu change)出现显著差异(图4)。
[0061]
实施例4sfn治疗asd病程相关肠道菌群的确定
[0062]
为更加准确的确定sfn治疗过程中,与asd病程相关的微生物种类,对sfn治疗过程中的肠道菌群进行检测,具体操作参见实施例1。
[0063]
结果如下:
[0064]
从宏观上肠道菌群的多样性指标来看,sfn并未显著改变肠道菌群的多样性指标(图5)。
[0065]
进一步分析sfn治疗有效的患者和治疗无效组之间的基线时,即sfn治疗前肠道菌群差异,我们发现,拟杆菌和双歧杆菌在有效组和无效组之间存在显著差异(图6)。
[0066]
接着就拟杆菌门的多个科进行分析,发现产碱杆菌科、黄色单胞菌科、生丝微菌科、毛螺菌科、拟杆菌科的相对丰度和osu总分的变化呈显著相关性(图7)。提示肠道菌群的相对丰度变化与症状改善显著相关。其中拟杆菌是预测asd患者对sfn治疗有效性的一个重要指标。
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