美洲大蠊PRP蛋白表达抑制剂及其编码基因与应用

美洲大蠊prp蛋白表达抑制剂及其编码基因与应用
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，具体涉及美洲大蠊prp蛋白表达抑制剂及其编码基因与应用。


背景技术：

2.根据化石证据显示，原始蟑螂约在4亿年前的志留纪出现于地球上，是这个星球上最古老的昆虫之一。亿万年来美洲大蠊的外貌和形态大小并没发生很大，它们有着棕褐色的体色，扁平的身体和头部，又长又细的触角以及发达的附肢，这些身体构造有利于它们快速的移动和寻找食物。美洲大蠊具有极强生命力和适应力以及繁殖力，在缺少食物和水源的情况还能正常存活15-30天。美洲大蠊总共有十四个龄期，从幼虫羽化到成虫后的寿命还有一年以上。一只成熟的雌蟑螂一生中可以多次产卵，每颗卵鞘可以孵化出大约16只幼虫。除此之外，美洲大蠊还可以在未受精的情况下进行孤雌生殖。美洲大蠊从亿万年前繁衍至今，经历了许多恶劣的环境变迁，仍没有灭绝并且还能在全球范围内广泛分布，其中还一个很重要的原因就是美洲大蠊能够产生一个高度硬化，且具有很强的保水性的卵鞘。卵鞘这种高度硬化以及高保湿的特性，能够使其能在恶劣的条件下仍具有一定的孵化能力。
3.美洲大蠊广泛分布，是世界公认卫生害虫之一。它们偏爱潮湿阴暗的生活环境，在下水道、仓库、厨房等角落随处可见。蟑螂作为多种细菌、病毒和寄生虫的携带者，通常通过对食物的污染把病原微生物传递给人类,给人们的生活和生命安全带来了严重的危害。由于以上的特性，蟑螂往往被认为是最难防治的卫生害虫之一。随着人们生活水平和生活质量的提升，越来越多人关注卫生害虫的防治。不同类型的蟑螂药在家庭为单位中大量的使用，这些蟑螂药往往具有一定的毒性，对生态环境具有一定的影响，随着长期大量的使用蟑螂可能了耐药性，甚至发生一些突变。卫生害虫与人们生活质量和食品安全息息相关。开发环境友好、高效、低毒的蟑螂防治方法是对于国家经济发展、社会进步和食品安全具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种蛋白质，能够用于防控美洲大蠊。
5.本发明还提出一种与上述蛋白质相关的生物材料。
6.本发明还提出一种上述蛋白质和生物材料的应用。
7.本发明还提出一种prp抑制剂。
8.本发明还提出上述prp抑制剂的应用。
9.本发明还提出一种防治美洲大蠊的方法。
10.在本发明的第一方面，提出了一种蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
11.a)氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白质；
12.b)氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合
蛋白质；
13.c)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
14.d)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
15.在本发明的一些实施方式中，所述蛋白质为prp蛋白。
16.在本发明的第二方面，提出了与上述蛋白质相关的生物材料，为下述1)至8)中的任一种：
17.1)编码上述的蛋白质的核酸分子；
18.2)含有1)所述核酸分子的表达盒；
19.3)含有1)所述核酸分子的重组载体；
20.4)含有2)所述表达盒的重组载体；
21.5)含有1)所述核酸分子的重组微生物；
22.6)含有2)所述表达盒的重组微生物；
23.7)含有3)所述重组载体的重组微生物；
24.8)含有4)所述重组载体的重组微生物。
25.在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
26.在本发明的第三方面，提出了上述蛋白质和生物材料的应用，所述应用为在降低美洲大蠊卵鞘保水性中的应用。
27.在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备防治美洲大蠊的产品中的应用。
28.在本发明的第四方面，提出了一种prp抑制剂。
29.在本发明的一些实施方式中，所述prp抑制剂为靶向上述蛋白质的dsrna、mirna、核酶或shrna。
30.一种dsrna，所述dsrna为由如seq id no.5所示的核苷酸序列作为正义链及由与seq id no.5所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列作为反义链组成的双链rna。
31.一种制备上述基因的dsrna的方法，包括以下步骤：以美洲大蠊卵鞘保水性相关的基因prp的cdna为模板，以干扰引物组为引物进行pcr扩增即得。
32.根据本发明的一些实施方式，所述干扰引物组包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
33.根据本发明的一些实施方式，所述制备方法具体为：将上述引物组用于扩增靶向沉默prp基因的dsrna靶向序列dna片段，将扩增得到的dna片段克隆到p18t载体，命名为p18t-prp，然后以p18t-prp为模板，设计两端含有t7启动子的引物，进行pcr扩增，得到dsrna靶向序列。
34.根据本发明的一些实施方式，所述两端含有t7启动子的引物的上游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；下游引物核苷酸序列如seq id no.7所示。
35.根据本发明的一些实施方式，所述dsrna靶向序列采用t7ribomax express rnai system转录合成即得。
36.在本发明的第五方面，提出了上述prp抑制剂的应用，所述应用为在降低美洲大蠊
no.4)。
55.美洲大蠊prp基因序列(seq id no.1)具体如下：
56.atgatactctcggtgttcatcggtctctcggcactttcagccgcttcagcagtcggtttcgggtacgtcccagtaccagagccgattccggttaagtacccagtggacagacccgttccatatcccgtgccaaagccagtgcctatccctgtggatcatccagtgttcaaagcatatccagtgcctatcactataccgaagctctacccgtatgctgtcgcaaaaccggttcctttcccagttaagattccaatacccaaaccgtatcctattccgattcctttaccaaaaccttatcctgtgcccgtacacatcaaagtaccgtttccagcaccctttcctgttcccgtaccaaagccttacccagttgtaattccgaaaaaagtaccatttcccttacctttccctgtgaaaatcccagtaccagctcctttcccgattaaaatcccagtcgctgtgccagttcccaaaccctaccctgtcataatcaaagtgccaattgatcgtccatacccagtaccaaaaccatacccagtgccagtaccggtgcccaaaccttacccagtaccaaaaccggtaccagtaccagtcgatcgtccctaccctgtgcctgtacccaaaccatatccagtgcaggttatcaagcaagtgcctgtgccagtaccatatcctaagccgtatcctgtagacaagccagtgccctaccccgttaagatcccagttgatcgcccatacccggtctctgtgcctaaaccttatgcagtgccagtggccaaaccagtgcctttcccaattgacaagccagtcccgttcccagttaaggtgccagtggagaagccagtgcctttcccagttgcgaagcctgtagcagtgcccgtgccttatccaatgaagagcaaatattactattaa。
57.美洲大蠊prp蛋白质序列(seq id no.2)具体如下：
58.milsvfiglsalsaasavgfgyvpvpepipvkypvdrpvpypvpkpvpipvdhpvfkaypvpitipklypyavakpvpfpvkipipkpypipiplpkpypvpvhikvpfpapfpvpvpkpypvvipkkvpfplpfpvkipvpapfpikipvavpvpkpypviikvpidrpypvpkpypvpvpvpkpypvpkpvpvpvdrpypvpvpkpypvqvikqvpvpvpypkpypvdkpvpypvkipvdrpypvsvpkpyavpvakpvpfpidkpvpfpvkvpvekpvpfpvakpvavpvpypmkskyyy*。
59.靶向沉默美洲大蠊prp基因的dsrna序列(由seq id no.5所示)，具体如下：
60.aaccgtatcctattccgattcctttaccaaaaccttatcctgtgcccgtacacatcaaagtaccgtttccagcaccctttcctgttcccgtaccaaagccttacccagttgtaattccgaaaaaagtaccatttcccttacctttccctgtgaaaatcccagtaccagctcctttcccgattaaaatcccagtcgctgtgccagttcccaaaccctaccctgtcataatcaaagtgccaattgatcgtccatacccagtaccaaaaccatacccagtgccagtaccggtgcccaaaccttacccagtaccaaaaccggtaccagtaccagtcgatcgtccctaccctgtgcctgtacccaaaccatatccagtgcaggttatcaagcaagtgcctgtgc。
61.(2)目的片段的克隆与载体的构建
62.使用trizol(lifetechnologies)方法提取美洲大蠊粘液腺总rna，然后使用prime script ii reverse transcriptase(takara bio，shiga，japan)合成cdna。以cdna为模板扩增得到含有靶向序列的dna片段，并将其克隆改到p18t载体(aidlab，china)中，测序验证序列是否存在碱基突变，挑选没有任何突变的克隆用于后续实验，载体命名为p18t-prp。
63.(3)重组载体的转化
64.将构建好的载体连接转化感受态细菌(dh5α)，制作成重组菌株。筛选出阳性克隆，扩大培养后提取重组质粒。
65.(4)合成prp dsrna
66.采用pcr在dsrna靶向序列两侧引入t7启动子，具体方法为用设计两端含有t7启动子的引物，taatacgactcactataggaaccgtatcctattccgattcc(seq id no.6)和taatacgactc
actatagggcacaggcacttgcttga(seq id no.7)。以p18t-prp载体为模板进行扩增，得到两端含有t7启动子的pcr产物，然后利用t7ribomaxtm express rnai system(promega corporation)来合成双链rna。
67.实施例2 dsrna对prp基因干扰影响
68.为了验证本发明制备的靶向prp基因的dsrna对美洲大蠊卵鞘保水能力的影响，对美洲大蠊行dsrna注射的方式来实现。
69.挑选刚羽化的美洲大蠊进行饲养，分为实验组和对照组(注射无法靶向美洲大蠊任何基因的dsck)，在其羽化后的第四天和第六天将其co2麻醉后，然后使用显微注射方法将靶向prp基因的dsrna注射2μl(500ng/μl)到美洲大蠊腹部内。第十天收集产的卵，卵鞘至于温度37℃，湿度75％，统计失水率和孵化率。其中，实验组和对照组各三个生物学重复，每个重复使用的美洲大蠊为25只。
70.1、dsrna对prp基因干扰效果验证
71.注射dsrna后的48h，解剖美洲大蠊雌性粘液腺，提取总rna，rna反转录得到cdna。利用primer premier5引物设计软件设计qpcr引物。荧光定量pcr检测所用到引物如下所示：gcttcagcagtcggtttcgg(seq id no.8)和actggctttggcacgggata(seq id no.9)。使用sybr green qpcr mix(yisheng，china)进行基因表达定量检测，反应体系如下：2
×
hiefftm qpcr green master mix 10μl，forward primer(10μm)1μl，reverse primer(10μm)1μl，cdna 2μl，rnase-free ddh2o 6μl反应程序如下：95℃1min；95℃10sec，60℃20sec，72℃30sec，共40个循环，通过对定量结果进行分析，检测靶基因干扰效果，
72.结果如图1所示，从图1中可以看出，dsrna具有可以显著干扰靶基因prp的表达。(图中“***”代表p《0.001，表明处理组和对照组之间相对表达量有显著差异。
73.2、dsrna靶向沉默prp后卵鞘的保水率的统计
74.dsrna靶向沉默prp基因后雌虫产的卵失水率和卵的形态的结果如图2和图3所示，其中，图2中为实验组和对照组失水率的对比结果图，图3为实验组和对照组卵的形态的对比结果图，从图中可以看出，dsrna靶向沉默prp基因后能够有效影响卵鞘的保水率导致卵鞘干瘪，进而导致蟑螂后代数量显著的减少。
75.基于dsrna技术的害虫防治策略具有专一性，对非靶标生物安全，且无毒无污染，是一种绿色的卫生害虫的生物学防治手段。
76.雌性美洲大蠊在羽化之后，随着发育过程逐渐成熟，在第七天达到性成熟，与雄性交配。交配后的雌虫在两三天后就能够正常的产卵。雌虫粘液腺分泌物在产卵时候一起被排出，裹着卵形成卵鞘。基因prp在美洲大蠊的雌性粘液腺中高表达，dsrna特异沉默基因prp会导致卵鞘的保水和孵化率显著的下降。通过这种机制可以有效的控制蟑螂的数量，为蟑螂的生物防治带来了契机，一种理想的控制蟑螂数量的策略。
77.综上所述，通过dsrna干扰技术靶向沉默prp基因能够有效影响美洲大蠊的卵的保水率使得卵鞘干瘪，使得美洲大蠊卵无法正常孵化进而导致蟑螂后代数量显著的减少，达到防治美洲大蠊的目的。
78.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。