1.本发明涉及一种生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法及定标品，属于生物技术领域。
背景技术：
2.蛋白质的翻译后修饰是蛋白质状态的重要指标，对于蛋白质的功能也经常起到重要的作用。若干已知的特定蛋白质位点的修饰是重要的诊断标志物，如阿尔茨海默症中tau蛋白181，217以及231位点的磷酸化以及血栓中wasp蛋白239 位点磷酸化。陆续地，还有许多新的蛋白修饰标志物被发现。
3.生成带有特定位点修饰的蛋白，尤其是其他位点均不修饰的单位点修饰蛋白对翻译后修饰，对于标志物的开发与定量有核心的意义，但现有的技术手段尚不可能做到。
技术实现要素：
4.为克服上述缺点，本发明的目的在于提供一种生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法及定标品。以解决背景技术中提到的问题。
5.为了达到以上目的，本发明采用的技术方案是：一种生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法，特定位点修饰为m，m周围的连接若干氨基酸为xxx，形成xxx-m-xxx；所述方法包括以下步骤：
6.(1)在蛋白质p的羧基端或氨基端添加酶学识别模块a或a，制得p-a或a-p；
7.(2)通过多肽合成，使酶学识别模块a或a与xxx-m-xxx反应生成a-xxx-m-x xx或者xxx-m-xxx-a；
8.(3)通过酶学反应，使用蛋白连接酶催化，在氨基端或羧基端进行连接，使p-a或a-p与a-xxx-m-xxx或xxx-m-xxx-a反应，得到p-a-a-xxx-m-xxx，或xxx
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m-xxx-a-a-p；
9.所述a和所述a为带有特定互补酶识别序列的两个多肽片段。
10.本发明进一步的设置为：所述a为连接在蛋白质p的羧基端的具有lpexg模块的蛋白或多肽，所述a为连接在蛋白质p的氨基端上具有ggg的蛋白或多肽。
11.本发明进一步的设置为：所述步骤(1)的产物p-a或a-p是通过dna改造，在蛋白质p的羧基端或氨基端添加酶学识别模块a或a制得的。
12.本发明进一步的设置为：所述步骤(1)的产物p-a或a-p是在蛋白连接酶的催化下合成的。
13.本发明还提供了一种定标品，所述定标品是上述任一项所述的p-a-a-xxx-m
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xxx，或xxx-m-xxx-a-a-p。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：由于两个带有特定互补酶识别序列的多肽片段直接共价连接，本方法可适用于任何蛋白，任何特定位点，任何修饰单位。经过验证，此类定标品可以和相关检测试剂进行很好的反应，并且没有明显的交叉反应，有极好的特异性。生成的定标品和体内蛋白非常可比的反应性，而无显著的彼此之间的交叉反应，是非
常理想的试剂开发中间产物。
15.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
16.下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
17.实施例1：一种生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法，特定位点修饰为m，m周围的连接若干氨基酸为xxx，形成xxx-m-xxx；所述方法包括以下步骤：
18.(1)在蛋白质p的羧基端或氨基端添加酶学识别模块a或a，制得p-a或a-p；
19.(2)通过多肽合成，使酶学识别模块a或a与xxx-m-xxx反应生成a-xxx-m-x xx或者xxx-m-xxx-a；
20.(3)通过酶学反应，使用蛋白连接酶催化，在氨基端或羧基端进行连接，使p-a或a-p与a-xxx-m-xxx或xxx-m-xxx-a反应，得到p-a-a-xxx-m-xxx，或xxx
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m-xxx-a-a-p；
21.所述a和所述a为带有特定互补酶识别序列的两个多肽片段。
22.由于两个带有特定互补酶识别序列的多肽片段直接共价连接，本方法可适用于任何蛋白，任何特定位点，任何修饰单位。经过验证，此类定标品可以和相关检测试剂进行很好的反应，生成的定标品和体内蛋白非常可比的反应性，而无显著的彼此之间的交叉反应，是非常理想的试剂开发中间产物。
23.具体地，所述a为连接在蛋白质p的羧基端的具有lpexg模块的蛋白或多肽，所述a为连接在蛋白质p的氨基端上具有ggg的蛋白或多肽。例如，转肽酶sortas e就可以把带有lpexg模块(a)的蛋白或多肽和氨基端带有ggg(a)的蛋白或多肽共价连接。
24.本发明进一步的设置为：所述步骤(1)的产物p-a或a-p是通过dna改造，在蛋白质p的羧基端或氨基端添加酶学识别模块a或a制得的。
25.本发明进一步的设置为：所述步骤(1)的产物p-a或a-p是在蛋白连接酶的催化下合成的。比如，在蛋白质p的羧基端加上被转肽酶sortase识别的序列lpe xg，或氨基端加上被转肽酶sortase识别的序列ggg。
26.本发明还提供了一种定标品，所述定标品是上述任一项所述的p-a-a-xxx-m
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xxx，或xxx-m-xxx-a-a-p。
27.经测试，以一类重要的阿尔茨海默症标志物tau蛋白181，217和231位磷酸化为例，相应生成的定量修饰类似物有和体内蛋白非常可比的反应性而无显著的彼此之间的交叉反应，是非常理想的试剂开发中间产物，以及定标品。
28.以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
技术特征：
1.一种生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法，特定位点修饰为m，m周围的连接若干氨基酸为xxx，形成xxx-m-xxx；其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)在蛋白质p的羧基端或氨基端添加酶学识别模块a或a，制得p-a或a-p；(2)通过多肽合成，使酶学识别模块a或a与xxx-m-xxx反应生成a-xxx-m-xxx或者xxx-m-xxx-a；(3)通过酶学反应，使用蛋白连接酶催化，在氨基端或羧基端进行连接，使p-a或a-p与a-xxx-m-xxx或xxx-m-xxx-a反应，得到p-a-a-xxx-m-xxx，或xxx-m-xxx-a-a-p；所述a和所述a为带有特定互补酶识别序列的两个多肽片段。2.根据权利要求1所述的生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法，其特征在于，所述a为连接在蛋白质p的羧基端的具有lpexg模块的蛋白或多肽，所述a为连接在蛋白质p的氨基端上具有ggg的蛋白或多肽。3.根据权利要求1所述的生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)的产物p-a或a-p是通过dna改造，在蛋白质p的羧基端或氨基端添加酶学识别模块a或a制得的。4.根据权利要求1所述的生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤(1)的产物p-a或a-p是在蛋白连接酶的催化下合成的。5.一种定标品，其特征在于，所述定标品是权利要求1-4中任一项所述的p-a-a-xxx-m-xxx，或xxx-m-xxx-a-a-p。
技术总结
本发明公开了一种生成带有任意特定位点修饰的蛋白质的方法，特定位点修饰为M，M周围的连接若干氨基酸为XXX，形成XXX-M-XXX；方法包括以下步骤：(1)在蛋白质P的羧基端或氨基端添加酶学识别模块A或a，制得P-A或a-P；(2)通过多肽合成，使酶学识别模块a或A与XXX-M-XXX反应生成a-XXX-M-XXX或者XXX-M-XXX-A；(3)通过酶学反应，使用蛋白连接酶催化，在氨基端或羧基端进行连接，使P-A或a-P与a-XXX-M-XXX或XXX-M-XXX-A反应，得到P-A-a-XXX-M-XXX，或XXX-M-XXX-A-a-P；A和a为带有特定互补酶识别序列的两个多肽片段。由于A和a直接共价连接，本方法可适用于任何蛋白，任何特定位点，任何修饰单位。经过验证，此类定标品可以和相关检测试剂进行很好的反应，并且没有明显的交叉反应，有极好的特异性。有极好的特异性。
技术研发人员：岳斌 陈韬
受保护的技术使用者：苏州有诺真生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.27
技术公布日：2022/12/5