一种隐性核不育水稻种质的构建方法及其应用

1.本发明属于水稻育种领域，涉及一种隐性核不育水稻种质的构建方法及其应用。


背景技术：

2.crispr/cas9技术作为最新一代基因编辑技术具有简单、高效、分离后代可剔除转基因成分等优势。在水稻遗传改良育种中，该技术已成功实现了对抗性、品质和育性等相关功能基因的定点编辑，如xu等(rice,7(1)，2014)利用crispr/cas9技术对抗除草剂基因bel为靶点进行定点突变，成功获得对除草剂-苯达松敏感的突变体水稻材料；张安宁等(cn107828794a)提出了通过crispr/cas9技术定向编辑位于osrr22第1个cds区的预期靶标位点创制突变体的方法，并筛选出了在0.75％氯化钠浓度胁迫下耐盐性提高的突变体wdr58-cas-1。
3.三系杂交水稻的研究和应用极大的推进了我国水稻育种事业的发展，三系不育系的选育是三系杂交水稻应用的关键，高配合力不育系能够产生更多的杂交组合，利用潜力大。三系不育系选育周期长，工作量大，盲目性强，最终培育出的不育系可能由于配合力差等缺点不能在生产上推广应用。
4.水稻育种中间材料是新品种选育的骨干材料，是现代种业发展的物质基础。传统育种材料的创制一般通过杂交、回交或复交的方式从后代中选育，虽然材料选择类型较为丰富，但不能将多个亲本的优异特性快速聚合。目前市场品种更新换代速度快，但材料创制周期长，为了适应市场需求，迫切需要创制更多的优异种质，如何快速增加育种材料的遗传多样性成为关键。
5.基于上述内容，我们提出一种隐性核不育水稻种质的构建方法及其应用。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种隐性核不育水稻种质的构建方法及其应用，并拓展其在水稻育种中的应用。
7.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
8.本发明提供了一种隐性核不育水稻种质的构建方法，包括以下步骤：
9.(1)以如seq id no.3所示的水稻ostkpr1基因序列为模板，根据crispr-cas9技术要求，以所述序列的第3434位点为靶位点，根据该靶位点及其上下游序列设计sgrna序列，将含有编码所述sgrna序列的dna片段连接至crispr-cas9基因编辑载体上，获得重组载体；
10.(2)将重组载体转入农杆菌感受态细胞中，利用农杆菌介导侵染水稻愈伤组织，培养获得水稻植株；将水稻植株移栽至基质中，继续培养至开花结穗时期，筛选出只开花不结穗的植株即为所述隐性核不育水稻种质；
11.(3)获得的隐性核不育水稻种质利用稻桩进行无性繁殖保存。
12.进一步地，构建获得的隐性核不育水稻种质的ostkpr1基因序列经crispr-cas9技术编辑后，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，为水稻ostkpr1基因的截短突变体。
13.进一步地，所述sgrna的核苷酸序列为：caaggacaggcgatgcagtg。
14.本发明还提供了一种上述隐性核不育水稻种质的构建方法在水稻三系不育系的选育中的应用。
15.进一步地，水稻三系不育系的选育方法，包括以下步骤：
16.(1)以所述隐性核不育水稻种质作为母本，选择多种常规水稻三系恢复系为父本，分别进行杂交；
17.(2)杂交后代经自交后，选择花粉不育且与父本农艺性状接近的单株为母本，与父本回交，回交后代再自交，选择花粉不育且与父本农艺性状接近的单株，经多次回交和自交后，再次回交，至bcmf1时，构建获得含有父本农艺性状接近的多种花粉不育系导入系；
18.(3)将花粉不育系导入系经自交分离，获得多种不育单株，利用多种不育单株测定待选育水稻品种保持系的配合力，具体为：以多种不育单株为母本，以待选育水稻品种保持系为父本分别进行测交，获得的f1代测定配合力，淘汰配合力差的保持系株系，再利用常规方法选育获得不育系。
19.本发明还提供了一种上述隐性核不育水稻种质的构建方法在在创制优异水稻种质中的应用。
20.进一步地，创制优异水稻种质的方法，包括以下步骤：
21.(1)以所述隐性核不育水稻种质作为母本，选择多个含有不同优异遗传性状的水稻品种为父本，将母本与父本杂交，混合授粉，得f1代；
22.(2)将f1代自交，得f2代，选择综合农艺性状优良且花粉不育的f2代单株为母本，继续与多个含有不同优异遗传形状的水稻品种作为父本回交，混合授粉，得bc1f1代，重复上述步骤，得bc2f1代，bc2f1代经自交，得bc2f2代；
23.(3)bc2f2代中，选择综合农艺性状优良的单株，利用多个步骤(1)父本中含有的优异遗传性状调控基因为分子标记基因，进行分子标记检测，筛选纯合的含有优异遗传性状调控基因的单株；
24.(4)将筛选的bc2f2代单株连续自交，筛选综合农艺性状优良的后代，至bc2fn代，n》6，即得到含有多个优异遗传性状的水稻育种中间材料，利用该中间材料，通过常规育种方法创制优异水稻种质。
25.本发明的原理：水稻隐性核不育基因的dna全长序列如seq id no.1所示，命名为ostkpr1-4，相比较seq id no.3所示的ostkpr1基因，水稻隐性核不育基因第3434位点的碱基g突变为a，导致ostkpr1肽链合成提前终止，具体可从seq id no.5所示的cds看出，编码序列原本从起始密码子atg开始，到第1101位终止密码子taa结束，经过定点突变后，在第600位的碱基g突变为a，使得第598-600的序列变为tga，tga为终止密码子，水稻隐性核不育基因的编码蛋白序列如seq id no.2所示，ostkpr1基因编码的蛋白氨基酸序列如seq id no.4所示。
26.本发明的有益效果在于：本发明利用常规crispr-cas9基因定点突变技术对水稻ostkpr1基因进行定向改造，使得水稻ostkpr1基因的第3434位点的碱基g突变为a，获得突变体植株作为水稻隐性核不育植株，利用该水稻隐性核不育植株可以完成高配合水稻三系不育系的快速选育和优异水稻种质的快速创制，大大加速优异水稻品种的构建周期，在育种方面具有重要应用价值。
附图说明
27.图1为野生型和隐性核不育突变植株的表型，a和b为野生型和突变植株的田间表型，c和d为野生型和突变植株的结实情况，e、f、h和g、i分别为野生型和突变植株的花药形成和花粉染色表型。
28.图2为三系不育系水稻的选育技术路线图；
29.图3为快速创制水稻育种材料技术路线图。
具体实施方式
30.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
31.1.材料
32.本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。所用到的水稻品种，若无特别说明，均为常规市售品种。
33.2.方法
34.2.1隐性核不育水稻种质的构建方法
35.2.1.1获得crispr/cas9基因编辑突变体
36.(1)以如seq id no.1所示的水稻ostkpr1基因序列为模板，根据crispr-cas9技术要求，以所述序列的第3434位点为靶位点，根据该靶位点及其上下游序列设计sgrna序列(caaggacaggcgatgcagtg)，将含有编码所述sgrna序列的dna片段连接至crispr-cas9基因编辑载体上，获得重组载体；
37.(2)将重组载体转入农杆菌感受态细胞中，利用农杆菌介导侵染水稻愈伤组织，培养获得水稻植株；将水稻植株移栽至基质中，继续培养至开花结穗时期，筛选出只开花不结穗的植株即为所述隐性核不育水稻种质。
38.上述步骤(1)、(2)中，水稻品种选用镇恢084，如图1所示，图1为野生型和隐性核不育突变植株的表型，a和b为野生型和突变植株的田间表型，c和d为野生型和突变植株的结实情况，e、f、h和g、i分别为野生型和突变植株的花药形成和花粉染色表型，利用crispr/cas9技术对镇恢084进行基因编辑，获得纯合隐性核不育突变植株rns(ostkpr1-4)，与野生型相比，该不育株完全不育，花药收缩变小，无正常花粉，成熟期不结实。
39.(3)获得的隐性核不育水稻种质利用稻桩进行无性繁殖保存，具体由安徽省农业科学院水稻研究所完成。
40.2.2利用上述隐性核不育水稻种质选育水稻三系不育系的方法
41.如图2所示，本实施例提供了一种水稻三系不育系的快速选育方法，其步骤包括水稻不育系导入系的获得、稳定的水稻保持系的选育、稳定保持系水稻的配合力筛选和三系不育系水稻的选育。
42.2.2.1获得不育系导入系bc5f1
43.i)利用2.1方法获得crispr/cas9基因编辑突变体植株作为母本(命名为rns；
44.ii)利用rns分别与华占、联恢9号、成恢177、五山丝苗、r0128、蜀恢527、成恢047、
泸恢615、先恢207、华恢2号、绵恢725、申恢254、盐恢559、宜恢1577、皖恢3404、蓉恢906、常恢117、内恢182、明恢100、泸恢602等20个三系恢复系杂交，获得可育后代f1，杂交后代f1经自交后选择出农艺性状接近恢复系的不育植株f2，与父本进行回交得可育后代bc1f1，回交后代再进行多次自交、回交，获得与父本性状基本一致的bc5f1代导入系，每个导入系种子量为500粒以上，保存备用，将花粉不育系导入系经自交分离，获得20种不育单株bc5f2。
45.2.2.2选育稳定保持系植株f6
46.2007年春季于海南陵水利用协青早b为母本，早籼14为父本，进行杂交，收获54粒杂交种；2007年正季于合肥种植f1代20株，抽穗期与宜香1b进行复交，收获36粒杂交种；2007年冬季于海南陵水种植复交f1代18株，混收全部种子；2008年正季于合肥种植f2群体1000株，农艺性状筛选优良单株85个；2008年冬季—2011年正季，1年2代，通过农艺性状筛选和米质检测系谱法选育符合育种目标且较为稳定的f6代保持系株系31个。
47.2.2.3筛选高配合力保持系株系
48.i)2011年冬季于海南陵水种植步骤2)获得的31个保持系株系和20个步骤1)构建的利用rns与三系恢复系构建的bc5f1代导入系；将bc5f1代自交分离出的不育单株bc5f2为母本，分别与31个稳定保持系株系f6测交，共计20个导入系*31个保持系株系＝620个组合，每个组合收获f1代杂交种20粒以上；
49.ii)2012年正季于合肥种植测交f1，每个组合2行，每行10株，观察农艺性状、室内考种、米质检测，最终筛选出综合农艺性状和米质优良、配合力较好的保持系株系1个，命名为徽15b。
50.2.2.4选育三系不育系株系
51.2013年冬季于海南陵水以协青早a为供体亲本，徽15b为轮回亲本，杂交、回交，每一代成对种植不育系和保持系父本，直至2016年冬季获得bcnf1代稳定不育系，命名为徽15a，同时获得稳定的保持系徽15b。
52.2017年冬季于海南陵水利用徽15a与自选恢复系进行测交50余对，2018年正季在合肥种植并进行杂种优势鉴定，所配组合均表现出株高、熟期适中，穗型较大、结实率高，抗性强、米质较优等特点；其中较对照ii优838增产幅度在5％以上的有8个组合，在每亩移栽2万穴条件下，单株有效穗数9.3～15.5个，每穗总粒数178.6～211.5粒，结实率79.2％～87.3％，千粒重28.8～34.1g，产量645.2～689.0kg/亩，比对照ii优838增幅在7.6％～14.0％，米质均达部颁三等食用稻等级以上。
53.2.3利用上述隐性核不育水稻种质创制优异水稻种质的方法
54.如图3所示，本实施例提供了一种快速创制优异水稻种质的方法。
55.2.3.1获得优质中间材料
56.(1)2015年正季，利用2.1方法获得crispr/cas9基因编辑突变体植株rns作为母本，12个优异水稻种质为父本，包括华占(含抗稻瘟病pi2基因、配合力好)、75-1-127(含抗稻瘟病pi9基因)、m630(国审品种徽两优630父本，株型好)、谷梅4号(含抗稻瘟病pigm基因)、五山丝苗(含抗稻瘟病pi2基因、配合力好、优质米)、ir72(含抗褐飞虱bph3基因)、kdml105(含抗白叶枯病xa21基因)、b5(含抗褐飞虱bph14和bph15基因)、m2628(配合力好、优质)、02428(含广亲和s5n基因)、katy(美国引进品种，综合性状优良)和玉针香(优质米)，杂交，混合授粉，得f1代杂交种153粒。
57.(2)2015年冬季于海南陵水种植f1代杂交种，收获f2代种子；
58.2016年正季于合肥种植f2代1380株，开花期选择分蘖较好、株型适中等综合农艺性状优良且花粉不育的单株48株，继续与12个父本回交，混合授粉，得bc1f1种子500粒以上；
59.(3)2016年冬季于海南陵水种植bc1f1代80株，随机混收bc1f2种子；
60.2017年正季于合肥种植bc1f2群体2000株，开花期选择分蘖较好、株型适中等综合农艺性状优良且花粉不育的单株44株，继续与12个父本回交，混合授粉，得bc2f1种子300粒以上；
61.2017年冬季于海南陵水种植bc2f1代124株，随机混收全部bc2f2种子。
62.(4)种植bc2f2代群体38000株，筛选株高适中、株型较好等综合农艺性状优良的单株1532份，收种，编号，一一对应取叶片，室内提取dna进行分子标记检测，同时进行米质检测，按照食用稻品种品质农业行业标准ny/t593-2013检测；
63.分子标记检测具体步骤如下：
64.①
dna的提取：
65.将1532份水稻单株叶片剪成2-4cm大小，放入1ml八连管中，每板96个样品，加入钢珠，液氮冷冻后利用磨样器磨成粉末；向样品中加入200μl的2
×
ctab提取液(提取液配方为：ctab 20g，nacl 81.9g，0.5m edta40 ml(ph 8.0)，1m tris-hcl100ml(ph 8.0)，加ddh2o定容至1l，灭菌后使用)，65℃温浴30min，每10min摇晃一次；加入200μl的24：1(氯仿：异戊醇，v/v)，震荡混匀，3000g离心10min；吸取100μl上清至96孔pcr板中，加入70μl预冷的异丙醇，轻摇混匀，3000g离心30min，去上清，加入100μl 70％乙醇，去上清，沉淀室温晾干，加入100μl灭菌ddh2o溶解2h以上，4℃保存备用。
66.②
分子标记检测过程如下：
67.分子标记：分子标记检测所用引物均为分子标记辅助选择常用引物，名称及序列分别为pi9(pb9-1，f:5
’‑
tagactccttccaagtttgact-3’，r:5
’‑
tgtgattttcagaattttcgt-3’)，pigm(gm587，f:5
’‑
acttgctgggagaaggatt-3’，r:5
’‑
agttcgtacttttcaggct-3’)，pi2(ap22，f:5
’‑
gtgcatgagtccagctcaaa-3’，r:5
’‑
gtgtactcccatggctgctc-3’)，xa21(pxa21，f:5
’‑
cgatcggtataacagcaaaac-3’，r:5
’‑
atagcaactgattgcttgg-3’)，bph14(mrg2329，f:5
’‑
gcacatacagaaatggtgaa-3’，r:5
’‑
ggcaagggacatgtagtaac-3’)，bph15(ms5，f:5
’‑
ttgtgggtcctcatctcctc-3’，r:5
’‑
tgacaacttgtgcaagatcaaa-3’)，bph3(rm8213，f:5
’‑
agcccagtgatacaaagatg-3’，r:5
’‑
gcgaggagataccaagaaag-3’)和s5n(indel-s5n，f:5'-aacccatttcctttcctacg-3'，r:5
’‑
caggcagagtatgtaatgtag-3')；
68.反应体系：pcr反应体系为10μl，其中包括dna模板2μl(约20-100ng)，10
×
pcr缓冲液1μl，前后引物各0.5μl，1mm的dntp混合液0.3μl，25mm的mgcl20.6μl，rtaq 0.1μl，ddh2o补至10μl；pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃5min，4℃5min。
69.凝胶电泳：100ml的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳工作液配置：40％丙烯酰胺20ml，5
×
tbe 20ml，ddh2o 70ml，10％(质量)ap 1.2ml，temed 100μl。凝胶工作液制备好后，倒入胶槽，插入80齿梳子，放置30min以上；加入0.5
×
tbe缓冲液，pcr产物中加入指示剂，排枪上样2μl，230v电泳70min。配置千分之一浓度的agno3染色液500ml(现配现用)；将胶块卸入染色
液中，30rpm轻摇染色12min；倒去染色液，ddh2o漂洗2-3次，去除残液，加入与染色液等体积的显色液(100ml显色液配方为：naoh 1.5g，甲醛溶液1ml，ddh2o补至100ml)，30rpm轻摇显色，直到出现条带为止；去除显色液，自来水清洗胶块2-3次，读取数据。
70.根据米质分析和分子标记检测结果，共获得二级以上优质米材料18份，含纯合pi9基因材料36份，含纯合pi2基因材料65份，含纯合pigm基因材料23份，含纯合xa21基因材料25份，含纯合bph14基因材料19份，含纯合bph15基因材料22份，含纯合bph3基因材料36份，含纯合s5n基因材料54份，含有两个或两个以上纯合基因材料48份。
71.(5)将上述筛选获得的单株继续自交，系谱选择，至bc2f6代，获得稳定的育种中间材料，利用不同的两系或三系不育系对这些材料进行配合力测定，获得配合力较好的材料16份，该16份材料可以直接作为恢复系或不育系或优异种质利用。
72.2.3.2品种改良和新品种创建
73.利用这16份材料为稳定的育种中间材料，通过常规杂交育种方法，将整合在该稳定育种中间材料中的多种优质基因导入常规水稻品种中，实现水稻品种的改良和新品种的创建，极大丰富了后代的类型。
74.以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。