一种高灵敏度探针及其制备方法和应用

本发明涉及基因检测，具体涉及一种高灵敏度探针、其制备方法和应用。

背景技术：

1、northernblot(rna印迹)是生物化学、分子生物学中常用的实验方法，通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段，是一种常用的rna定性和定量分析方法。northern印迹法中rna样品经过凝胶电泳后会按照分子量大小分离，然后将样品从凝胶转印到膜上，然后用于目标序列互补的标记探针进行杂交，通过对探针信号的显影来检测目的基因的表达情况。

2、目前，northern blot所用的探针方法主要有两类：一类是基于同位素的放射性标记，其具有灵敏度高、特异性好、分辨率强的优点，但是放射性同位素对人体有害，探针半衰期短，而且还需要特定的实验室及相应的试验保护设施，以及经过专门培训的人员操作，要求较高，从而导致检测成本也极高；二类是通过酶促、光化学和化学手段等掺入报告基团，这种报告基团可通过高灵敏的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统来检测。而在small rna的检测过程中，由于所检测的small rna长度较短，一般只有20多个核苷酸，所以相应的探针的长度也较短，对于较短的探针一般采用合成的寡核苷酸作为探针，然后对其3’末端或5’末端进行标记，此时一般是只标记一两个基团，可检测基团的数量直接影响了检测灵敏度。

技术实现思路

1、针对现有技术所存在的技术问题，本发明的目的之一在于提供了新的探针，该探针含有多个标记，检测灵敏度极高。

2、所提供的高灵敏度探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，所述检测探针链从5’到3’端依次为待测目的序列互补配对区、连接碱基、模板探针互补配对区和标记区，所述标记区含有标记碱基；

3、所述模板探针链从3’到5’端依次为检测探针链互补配对区和检测探针链标记区互补配对区，且所述检测探针链标记区互补配对区不含连接碱基；

4、所述模板探针链和检测探针链形成检测探针链5’端为单链的部分双链探针。

5、本发明采用双探针进行融合的方法，在其融合过程中掺入多个标记基团，其检测灵敏度可达到放射性同位素检测水平。

6、在本发明的一种实施方式中，标记为生物素标记或者地高辛标记。

7、本发明的目的之二在于提供上述高灵敏度探针的制备方法，包括以下步骤：

8、分别合成模板探针链和不含有标记区的检测探针链；

9、将模板探针链和不含有标记区的检测探针链在退火体系中退火形成部分双链探针前体；

10、将部分双链探针前体在扩增体系中扩增，即得；

11、其中，扩增体系中含有标记碱基且不含有与连接碱基互补的碱基。

12、在本发明的一种实施方式中，所述连接碱基为c，所述扩增体系的底物不含dgtp及其标记物；或所述连接碱基为a，所述扩增体系的底物不含dttp及其标记物；或所述连接碱基为g时，所述扩增体系的底物不含dctp及其标记物；或所述连接碱基为t时，所述扩增体系的底物不含datp及其标记物。

13、在本发明的一种实施方式中，退火条件为：70℃保温5min，之后以0.1℃/s的降温速率降温至22℃保温5min。

14、本发明的目的之三还在于保护上述高灵敏度探针在核酸检测中的应用。

技术特征：

1.一种高灵敏度探针，其特征在于，所述高灵敏度探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，

2.根据权利要求1所述的高灵敏度探针，其特征在于，标记为生物素标记或者地高辛标记。

3.权利要求1～2任一项所述的高灵敏度探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的高灵敏度探针的制备方法，其特征在于，所述连接碱基为c，所述扩增体系的底物不含dgtp及其标记物；

5.根据权利要求3所述的高灵敏度探针的制备方法，其特征在于，退火条件为：70℃保温5min，之后以0.1℃/s的降温速率降温至22℃保温5min。

6.权利要求1所述的高灵敏度探针在核酸检测中的应用。

技术总结
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种高灵敏度探针、及其制备方法和应用。该探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，所述检测探针链从5’到3’端依次为待测目的序列互补配对区、连接碱基、模板探针互补配对区和标记区，所述标记区含有标记碱基；所述模板探针链从3’到5’端依次为检测探针链互补配对区和检测探针链标记区互补配对区，且所述检测探针链标记区互补配对区不含连接碱基；所述模板探针链和检测探针链形成检测探针链5’端为单链的部分双链探针。本发明所提供的探针含有多个标记，其检测灵敏度可达到放射性同位素检测水平。

技术研发人员：李峰,王红征,王玉丹,张熙
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11