一种酪醇-β-半乳糖苷的制备方法及其应用

本发明涉及一种酪醇-β-半乳糖苷的制备方法及其应用，属于生物医药。

背景技术：

1、神经炎症包括病理条件下中枢神经系统中的多种炎症事件，是一种涉及中枢神经系统内所有细胞的反应。典型的神经退行性疾病如阿尔兹海默症、多发性硬化症、帕金森氏症均与神经炎症的发生密切相关。小胶质细胞是参与发生神经炎症的主要细胞类型之一，其功能紊乱会导致炎症因子及超氧化物等释放，进而严重损害神经元功能。

2、药用植物红景天在亚洲和欧洲国家通常被用作医疗保健的“食品补充剂”，以防止或缓解疲劳和虚弱等。目前在欧洲食品安全局的第13条健康声明综合清单中，红景天的功能声明被表述为“有助于优化精神和认知活动”。红景天在我国也具有悠久的使用历史，已经被广泛应用于保健品及护肤品中，应用潜力巨大。红景天苷(即酪醇-β-葡萄糖苷)是红景天的主要活性组分，具有重要的药理学功能，如神经保护、心血管保护、延缓衰老、抗疲劳、抗氧化等。人工合成的酪醇-β-半乳糖苷是红景天苷类似物，对脑缺血再灌注的保护作用和抗氧化作用更优于红景天苷，但其对于神经炎症的影响目前未见报道。

3、酪醇-β-半乳糖苷，即对羟基苯乙基-o-β-半乳糖苷，分子式为c14h20o7，化学结构式如下：

4、

5、酪醇-β-半乳糖苷的合成方法报道有化学法和酶法。其中，化学法合成步骤繁多且需要多种有机溶剂的使用；酶法能催化一步合成糖苷，反应步骤简单，绿色环保。酶法中采用β-半乳糖苷酶以乳糖为糖基供体、以酪醇为糖基受体通过转糖基作用合成糖苷，反应过程中存在乳糖水解副反应，副产物较多，不利于产物纯化。目前未有报道以单糖为糖基供体酶法合成酪醇衍生物的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种酪醇-β-半乳糖苷的制备方法及其应用。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种酪醇-β-半乳糖苷的制备方法，包括步骤如下：

4、构建半乳糖浓度为0.25～2m、酪醇浓度为50～400mm、β-半乳糖苷酶浓度为5～50u/ml的反应体系，然后在40～75℃条件下反应6～24h，再升温至90～100℃终止反应，离心，将上清液真空冷冻干燥后，经分离制得酪醇-β-半乳糖苷；

5、所述β-半乳糖苷酶的氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、根据本发明优选的，所述反应体系中半乳糖浓度为1m。

7、根据本发明优选的，所述反应体系中酪醇浓度为100mm。

8、根据本发明优选的，所述反应体系中β-半乳糖苷酶浓度为40u/ml。

9、根据本发明优选的，所述分离具体过程为：用硅胶柱进行色谱分离，以甲醇和乙酸乙酯为流动相，体积比例为1:6，样品上样量为5g冻干样品，洗脱流速为4～6ml/min，收集80min后的洗脱样品，再通过薄层层析检测合并产物，得到酪醇-β-半乳糖苷。

10、根据本发明优选的，所述β-半乳糖苷酶的制备方法如下：

11、(1)将如seq id no.1所示的β-半乳糖苷酶基因序列克隆到大肠杆菌表达载体pet-22b中，构建重组表达载体pet-22-bga，然后将表达载体转化到大肠杆菌中，用氨苄青霉素抗性筛选出含β-半乳糖苷酶的重组菌株；

12、(2)将步骤(1)筛选出的重组菌株接种于lb液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，获得种子液；将种子液按照体积比0.5～1.5％接种于lb液体培养基中，待生长到od600为0.6时，加入终浓度为0.5～1.5mm的iptg进行诱导，得到诱导后的菌细胞；

13、(3)收集步骤(2)诱导后获得的菌细胞，超声破碎后，离心去除沉淀，获得粗酶液；粗酶液通过镍亲和层析柱进行纯化，获得β-半乳糖苷酶。

14、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述iptg的终浓度为1mm，诱导温度为16℃，诱导时间为12h。

15、一种根据上述制备方法所制得的酪醇-β-半乳糖苷。

16、本发明还提供上述酪醇-β-半乳糖苷在制备缓解神经炎症药物中的应用。

17、有益效果

18、1、本发明首次采用特定的β-半乳糖苷酶，以半乳糖单糖为糖基供体合成酪醇-β-半乳糖苷。相比于现有以乳糖为糖基供体的制备酪醇-β-半乳糖苷的方法，本发明的整个制备过程中不存在水解副反应，无水解副产物，反应体系产物种类较少，反应混合物仅含有糖苷产物与剩余底物，反应产物容易纯化，产物分离所进行的硅胶柱层析填料为硅胶粉，价格低廉，远低于常用的糖分离填料bio-gel p2，大大降低了生产成本，应用前景广阔。

19、2、本发明提供的酪醇-β-半乳糖苷对于神经炎症具有抑制作用，能降低炎症因子水平、减少ros的产生，缓解神经炎症，可作为新的治疗神经炎症的先导化合物。

技术特征：

1.一种酪醇-β-半乳糖苷的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系中半乳糖浓度为1m。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系中酪醇浓度为100mm。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系中β-半乳糖苷酶浓度为40u/ml。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离具体过程为：用硅胶柱进行色谱分离，以甲醇和乙酸乙酯为流动相，体积比例为1:6，样品上样量为5g冻干样品，洗脱流速为4～6ml/min，收集80min后的洗脱样品，再通过薄层层析检测合并产物，得到酪醇-β-半乳糖苷。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶的制备方法如下：

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述iptg的终浓度为1mm，诱导温度为16℃，诱导时间为12h。

8.权利要求1所述酪醇-β-半乳糖苷的制备方法所制得的酪醇-β-半乳糖苷。

9.权利要求8所述的酪醇-β-半乳糖苷在制备缓解神经炎症药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种酪醇‑β‑半乳糖苷的制备方法及其应用。所述方法包括：构建半乳糖浓度为0.25～2M、酪醇浓度为50～400mM、β‑半乳糖苷酶浓度为5～50U/mL的反应体系，然后在40～75℃条件下反应6～24h，升温至90～100℃终止反应，离心，将上清液真空冷冻干燥后，经分离制得酪醇‑β‑半乳糖苷；所述β‑半乳糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明首次采用特定的β‑半乳糖苷酶，以半乳糖单糖为糖基供体合成酪醇‑β‑半乳糖苷。相比于现有以乳糖为糖基供体的制备酪醇‑β‑半乳糖苷的方法，本发明的整个制备过程中不存在水解副反应，无水解副产物，糖苷产物分离方便，应用前景广阔。

技术研发人员：卢丽丽,孙桐
受保护的技术使用者：华中科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12