重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法及其应用与流程

本发明涉及生物工程，尤其是涉及一种重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法及其应用。

背景技术：

1、毕赤酵母(pichia pastoris)是近十年发展起来的真核表达体系，是目前较为成功的外源蛋白表达系统之一。与现有的其它表达系统相比，酵母具有表达菌株遗传性质稳定、表达量高、生物活性好、培养密度高、生产成本低、产物易于纯化、安全性风险低等优点，该系统已成功表达了多个病毒样颗粒疫苗，如乙肝疫苗、戊肝疫苗、hpv疫苗等均获得了较好的应用。

2、相比于其他酵母表达系统毕赤酵母具有以下特殊的优点：(1)具有醇氧化酶aox基因启动子，aox是目前调控机理最严格的启动子之一；(2)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(3)菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高；(4)毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解。

3、毕赤酵母天然无游离质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达，包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。表达质粒为穿梭质粒，先在大肠杆菌中复制扩增后导入宿主酵母细胞中。为使产物分泌至胞外，表达载体还需带有信号肽序列。胞内表达载体可以将目的基因表达在胞内，可避免酵母的糖基化，适合于通常在胞浆表达或不含-s-s-的非糖基化蛋白以及组装类蛋白(vlp)，较胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。

4、在毕赤酵母表达系统中，乙醇氧化酶有两种基因编码，即aox1和aox2。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力由aox1提供，菌株利用甲醇的速度主要由aox1基因表达的aox1蛋白提供。当aox1缺失，只存在aox2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，这种细胞利用甲醇能力低，在甲醇培养基上生长缓慢的菌株表现型为muts。存在aox1时，细胞利用甲醇正常生长，在甲醇培养基上生长较快，这种菌株表现型为mut+。毕赤酵母的最适生长温度为28～30℃，诱导期间超过32℃，不利于蛋白表达，并可能导致细胞死亡。muts和mut+菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率一样，存在甲醇的情况下，aox1启动子被强烈诱导，mut+较muts生长更快(4～5倍)。

5、在转化外源基因时，质粒载体上的paox位点(aox启动子)或paox转录终止子tt或下游3’aox1三个位点与酵母宿主菌基因发生同源重组。在酵母宿主菌基因组的下游或者上游插入一个或多个质粒载体基因。如插入的质粒载体不破坏酵母宿主菌基因本身的aox1，此重组转化子的表现型不变，仍为mut+，反之为muts。在某些情况下，转化质粒/载体基因会多次插入至基因组中，形成多拷贝的串联表达盒，不过此类多拷贝自然发生概率较低，需要通过高通量等手段来加大筛选通量来提高筛选概率。

6、常规的转化子筛选方法是观察转化子在培养皿上的生长情况判断mut+和muts，并通过小体积诱导培养后检测目的蛋白的表达情况(western blot或elisa)确定表达株。此方法操作步骤繁多，时间周期较长，不适宜作为高通量筛选的手段。因此简化筛选mut+和muts的操作步骤，缩短筛选时间，提高筛选通量是目前有待解决的问题。

7、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法，该方法缓解了现有技术中重组毕赤酵母高产表达株筛选操作复杂，通量低的技术问题。

2、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法在制备外源蛋白、病毒样颗粒或疫苗中的应用。

3、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

4、根据本发明的一个方面，本发明提供了一种重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法，包括：

5、(a)采用荧光定量pcr方法获取经诱导表达的重组毕赤酵母转化子的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、醇氧化酶基因aox1和目的基因的扩增循环数ct，分别记为ct(gapdh)、ct(target)和ct(aox1)；

6、(b)按照如下方获取x值；

7、(b1)ct(target)≥ct(gapdh)同时ct(aox1)≤ct(gapdh)的转化子判定为基因插入位置失败的转化子；

8、(b2)ct(target)≤ct(gapdh)同时ct(aox1)＞ct(gapdh)的转化子判定为muts表现型；

9、(b3)ct(target)＜ct(gapdh)同时ct(aox1)≤ct(gapdh)的转化子判定为mut+表现型a类，计算x值，x＝ct(aox1)-ct(target)；

10、(b4)ct(target)＞ct(gapdh)同时ct(aox1)≥ct(gapdh)的转化子判定为mut+表现型b类，计算x值，x＝ct(aox1)-ct(target)；

11、(c)按降序排列各转化子的x值：

12、若存在mut+表现型a类的转化子，仅比较判定为mut+表现型a类的转化子的x值，取x值最大的转化子为重组毕赤酵母高产表达株；

13、若不存在mut+表现型a类的转化子，仅比较判定为mut+表现型b类的转化子的x值，取x值最大的转化子为重组毕赤酵母高产表达株。

14、根据本发明的另一个方面，本发明还提供了重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法在制备外源蛋白、病毒样颗粒或疫苗中的应用。

15、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

16、本发明提供的重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法通过采用荧光定量pcr的方法获取经诱导表达的重组毕赤酵母转化子的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gapdh)、醇氧化酶基因aox1和目的基因的扩增循环数ct，通过比较ct(gapdh)、ct(aox1)和ct(target)的大小关系可快速筛选获得mut+高产表达株。

17、本发明通过利用gapdh基因来表征转化子的代谢状态，利用aox1基因表征表现型，根据gapdh、aox1和目的基因三者的瞬时表达关系一次性评估各转化子的表现型和表达能力。本发明提供的筛选方法可在微量体积培养的候选转化子中直接完成mut+和muts突变株的筛选和目的蛋白表达量的确认，从而大大提高筛选通量，更加快速的获得重组毕赤酵母高产表达株。

18、将本发明提供的重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法应用于制备外源蛋白、病毒样颗粒或疫苗中，可简化操作步骤，提高生产效率，降低生产成本。

技术特征：

1.重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，将培养至对数生长期的重组毕赤酵母转化子使用甲醇诱导表达，然后提取重组毕赤酵母转化子的总rna，经逆转录得到cdna作为所述荧光定量pcr的模板。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，经甲醇诱导表达20～25h后，提取重组毕赤酵母转化子的总rna；

4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，使用液体培养基培养重组毕赤酵母转化子，甲醇的添加量为重组毕赤酵母转化子培养物总体积的1～2％。

5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，用于扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的引物序列如seq_1和seq_2所示。

6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，用于扩增醇氧化酶基因aox1的引物序列如seq_3和seq_4所示。

7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述荧光定量pcr的反应条件为：预变性95℃2min，变性：95℃15s，退火/延伸：60℃30s，35～40cycles。

8.根据权利要求1-7任一项所述的筛选方法，其特征在于，用于构建所述重组毕赤酵母转化子的毕赤酵母选自smd1168株、gs115株或x-33株。

9.根据权利要求1-7任一项所述的筛选方法，其特征在于，用于构建所述重组毕赤酵母转化子的表达载体选自ppic9，ppic9k、phil-s1、ppiczαa、ppiczαb、ppiczαc、pyam75p、ppic3、ppicz、ppsc3k、phil-d2或pa0815。

10.权利要求1-9任一项所述的重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法在制备外源蛋白、病毒样颗粒或疫苗中的应用。

技术总结
本发明提供了一种重组毕赤酵母高产表达株的筛选方法及其应用，涉及生物工程的技术领域，包括采用荧光定量PCR的方法获取经诱导表达的重组毕赤酵母转化子的GAPDH、AOX1和目的基因的Ct值，通过比较GAPDH、AOX1和目的基因的Ct值的大小关系可快速筛选获得Mut<supgt;+</supgt;高产表达株，缓解了现有技术中重组毕赤酵母高产表达株筛选操作复杂，通量低的技术问题。

技术研发人员：张建城,陈晓雨,易晓男,曹玉锋,史力
受保护的技术使用者：怡道生物科技(苏州)有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13