来自古柯的芽子酮甲基转移酶EnEMT1和EnEMT2及其基因和应用

本发明属于植物分子生物学，具体涉及来自古柯的芽子酮甲基转移酶enemt1和enemt2及其基因和应用。

背景技术：

1、托品烷生物碱(tropane alkaloids)是一类含有8-氮杂双环[3.2.1]辛烷为骨架的生物碱，主要分布于古柯科(erythroxylaceae)，茄科(solanaceae)，旋花科(convolvulaceae)，红树科(rhizophoraceae)，十字花科(brassicaceae)等植物，现已鉴定出300多种托品烷生物碱。植物源托品烷生物碱具有很好的生理活性，如：古柯科中分离得到的可卡因能阻断神经纤维之间的传导及具有术后血管收缩作用，可作为鼻、喉咙和下呼吸道等区域外科手术的局部麻醉药；茄科中分离得到的莨菪碱和东莨菪碱可阻断副交感神经或抑制中枢神经系统等，从而用于止痛、解痉等。

2、托品烷生物碱因其结构具有多个手性中心，直接通过化学手段合成工艺复杂且成本高，现阶段医疗使用的托品烷生物碱多是从植物中分离；而可卡因等托品烷生物碱的生物合成途径不清楚，无法解除可卡因等托品烷生物碱体内合成的限速步骤，限制了植物中托品烷生物碱产量的提高。此外，通过植物分离托品烷生物碱受到植物生长、气候变动等各种因素影响，也限制了可卡因等托品烷生物碱的供应。现代分子生物学和合成生物学的发展，使得可卡因等药用天然产物脱离原植物，在微生物中生产成为了可能。可卡因生物合成途径的解析及生物合成基因的挖掘作为其进行代谢工程的基础，是微生物生产中最重要的基本元件。

3、基于现有同位素前体标记实验等推测可卡因的生物合成路径如下：由鸟氨酸起始，经历n-甲基吡咯阳离子、4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸、甲基芽子酮等中间体；最后，甲基芽子碱在cs酶的作用下与苯甲酰coa缩合形成可卡因。但在现有技术中，没有相关甲基芽子酮合成的酶enemt1和enemt2及其编码基因的鉴定，以及芽子酮甲基转移酶(enemt1和enemt2)相关应用的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供来自古柯的芽子酮甲基转移酶enemt1和enemt2及其基因和应用。

2、为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

3、提供芽子酮甲基转移酶，其具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

4、a)具有seq id no.4或seq id no.8所示的氨基酸残基序列的蛋白质；

5、b)将seq id no.4或seq id no.8中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有a)酶功能的由a)衍生的氨基酸序列；

6、c)与a)或b)限定的氨基酸序列具有80％以上的同源性，且具有a)酶功能的由a)衍生的蛋白质；

7、d)序列中含有a)、b)或c)氨基酸序列的衍生蛋白质。

8、提供芽子酮甲基转移酶基因，其具有下述核苷酸序列之一的多核苷酸：

9、a)核苷酸序列如seq id no.3或seq id no.7所示的多核苷酸；

10、b)编码如seq id no.4或seq id no.8所示的氨基酸序列的多核苷酸；

11、c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有80％以上的同源性且编码具有权利要求1所述芽子酮甲基转移酶功能的多核苷酸；

12、d)与a)、b)或c)序列互补的多核苷酸。

13、提供包含芽子酮甲基转移酶基因的重组表达载体。

14、进一步地，重组表达载体为将芽子酮甲基转移酶基因插入原核或真核表达载体得到表达芽子酮甲基转移酶的重组表达载体。

15、进一步地，将芽子酮甲基转移酶基因构建到pet28a载体而得。

16、提供包含芽子酮甲基转移酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系。

17、进一步地，转基因重组菌为细菌和真菌，细菌和真菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母。

18、提供芽子酮甲基转移酶在体内或体外催化生成甲基芽子酮及其衍生物的应用。

19、提供芽子酮甲基转移酶在体内或体外催化生产托品烷生物碱中的应用，托品烷生物碱包括但不限于可卡因。

20、提供包含芽子酮甲基转移酶基因的重组表达载体在不具有甲基芽子酮及其衍生物生物合成途径的原核生物或真核生物中构建甲基芽子酮及其衍生物合成途径，或是在提升甲基芽子酮及其衍生物在具有甲基芽子酮及其衍生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。

21、提供包含芽子酮甲基转移酶基因的重组表达载体在不具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物中构建托品烷生物碱的生物合成途径中或是在提升托品烷生物碱在具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。

22、提供包含芽子酮甲基转移酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系在催化芽子酮及其衍生物甲基化中的应用。

23、本发明的有益效果为：

24、本发明公开了芽子酮甲基转移酶，其氨基酸序列分别是，enemt1如seq id no.4所示，enemt2如seq id no.8所示，其编码的核苷酸分别是，enemt1如seq id no.3所示，enemt2如seq id no.7所示，将芽子酮甲基转移酶进行原核表达后能够催化芽子酮生成甲基芽子酮。芽子酮甲基转移酶的发现为天然产物的合成生物学提供了更多基础元件，并且为这类酶的理性设计提供了指导和依据，具有很好的工业化前景。

技术特征：

1.芽子酮甲基转移酶，其特征在于，具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

2.芽子酮甲基转移酶基因，其特征在于，具有下述核苷酸序列之一的多核苷酸：

3.含有权利要求2所述芽子酮甲基转移酶基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为将芽子酮甲基转移酶基因插入原核或真核表达载体得到表达芽子酮甲基转移酶的重组表达载体。

5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将芽子酮甲基转移酶基因构建到pet28a载体而得。

6.含有权利要求2所述芽子酮甲基转移酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系。

7.根据权利要求6所述的芽子酮甲基转移酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系，其特征在于，所述转基因重组菌为细菌和真菌，所述细菌和真菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母。

8.权利要求1所述芽子酮甲基转移酶在体内或体外催化生成甲基芽子酮及其衍生物的应用。

9.权利要求1所述芽子酮甲基转移酶在体内或体外催化生产托品烷生物碱中的应用，所述的托品烷生物碱包括但不限于可卡因。

10.权利要求3-5任一所述的重组表达载体在不具有甲基芽子酮及其衍生物生物合成途径的原核生物或真核生物中构建甲基芽子酮及其衍生物合成途径，或是在提升甲基芽子酮及其衍生物在具有甲基芽子酮及其衍生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。

11.权利要求3-5任一所述的重组表达载体在不具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物中构建托品烷生物碱的生物合成途径中或是在提升托品烷生物碱在具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。

12.权利要求6所述的转基因重组菌或转基因细胞系在催化芽子酮及其衍生物甲基化中的应用。

技术总结
本发明公开了来自古柯的芽子酮甲基转移酶EnEMT1和EnEMT2及其基因和应用。EnEMT1氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；EnEMT2氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。经大肠杆菌表达后的蛋白质能够催化芽子酮生成甲基芽子酮。芽子酮甲基转移酶的发现为天然产物的合成生物学提供了更多基础元件，并且为这类酶的理性设计提供了指导和依据，具有很好的工业化前景。

技术研发人员：黄胜雄,杨静,王永江,黄建萍,罗剑英,颜一军
受保护的技术使用者：中国科学院昆明植物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15