一种在PCR反应体系中提高链霉亲和素磁珠活性的方法与流程

一种在pcr反应体系中提高链霉亲和素磁珠活性的方法
技术领域
1.本发明涉及技术领域，具体为一种在pcr反应体系中提高链霉亲和素磁珠活性的方法。


背景技术：

2.链霉亲和素磁珠作为分子诊断中探针捕获等实验的重要原材料，为其实现高回收率、自动化发挥了重要的作用，不同实验的洗脱效率对最终核酸分子的回收率有很大的影响(尤其在探针捕获领域)。因此，为降低洗脱不完全以及洗脱试剂造成的污染，将捕获了核酸的磁珠直接进行pcr扩增，成为越来越多分子诊断与测序中常用的实验手段。但是不少研究者发现，带磁珠进行pcr扩增，会对pcr产生抑制作用。本发明公开了一种提高链霉亲和素磁珠在pcr反应体系的增强剂，属于分子生物学领域。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种在pcr反应体系中提高链霉亲和素磁珠活性的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
4.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
5.一种在pcr反应体系中提高链霉亲和素磁珠活性的方法，包括以下步骤：
6.s1：将链霉亲和素磁珠室温静置；
7.s2：使用前，将磁珠置于涡旋振荡器上重悬，得到磁珠液，将磁珠液加入到ep管中，将ep管置于磁性分离器上，静置，用移液器小心去除上清液，再加入等体积的漂洗液2，重悬，孵育，再将ep管置于磁性分离器上，静置，用移液器小心去除上清液，再加入增强剂，孵育，最后将ep管置于磁性分离器上，静置，用移液器小心去除上清液，取80％的无水乙醇在磁性分离器上漂洗2遍，最后取漂洗液1重悬，得到处理重悬好的磁珠a；
8.s3：将处理重悬好的磁珠a与等体积的生物素化核酸进行常温孵育；
9.s4：孵育后将ep管置于磁性分离器上，静置，去上清液，将提前预热的漂洗液2加入磁珠中，混匀，置于磁性分离器上，静置，去上清液，总计漂洗3次，得到捕获了核酸的磁珠b；
10.s5：加入去离子水进行洗脱，将捕获了核酸的磁珠b直接进行pcr扩增且在pcr反应体系中添加增强剂。
11.进一步的，所述增强剂的组分为mgcl2，mgso4，tris-hcl，bsa。
12.进一步的，所述增强剂的组分为1-4mm的mgcl2，1-3mm的mgso4，0.03-0.1m的tris-hcl，0.4-0.6mg/ml的bsa混合溶液；tris-hcl的ph为8.0。
13.进一步的，所述漂洗液1的组分为tris-hcl，edta，nacl。
14.进一步的，所述漂洗液1的组分为8-12mm的tris-hcl，0.5-1.5mm的edta，1-3m的nacl的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
15.进一步的，所述漂洗液2的组分为tris-hcl，edta，nacl，吐温20。
16.进一步的，所述漂洗液2的组分为4-6mm的tris-hcl，0.2-0.8mm的edta，0.5-1.5m
的nacl，0.01-0.1％吐温20的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
17.进一步的，所述步骤s2中，磁珠液加入量为10μl，增强剂加入量为50μl；漂洗液1加入量为20μl；步骤s4中，提前预热温度为65℃；步骤s5中，增强剂加入量为2μl。
18.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明提出了一种在pcr反应体系中提高链霉亲和素磁珠活性的方法，提高核酸分子的回收率，利用漂洗液2清洗封闭和增强剂的封闭作用，使链霉亲和素磁珠减少非特异性吸附并且降低磁珠本身对后续pcr反应体系的抑制作用；最后在pcr反应体系中添加2μl的增强剂工作液，进一步封闭未与生物素化核酸结合的游离链霉亲和素磁珠，减小非特异性信号，提高检测灵敏度。
具体实施方式
19.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.以下实施例中pcr扩增体系如下：
[0021][0022]
其中，2
×
taq master mix:诺唯赞生物科技有限公司(货号：p111/p112)
[0023]
实施例1
[0024]
增强剂的组分为1mm的mgcl2，1mm的mgso4，0.03m的tris-hcl，0.4mg/ml的bsa混合溶液；tris-hcl的ph为8.0。
[0025]
漂洗液1的组分为8mm的tris-hcl，0.5mm的edta，1m的nacl的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0026]
漂洗液2的组分为4mm的tris-hcl，0.2mm的edta，0.5m的nacl，0.01％吐温20的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0027]
s1：将链霉亲和素磁珠室温静置30min；
[0028]
s2：使用前，将磁珠置于涡旋振荡器上重悬30s，得到磁珠液，将10μl磁珠液加入到ep管中，将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入等体积的
漂洗液2，重悬，孵育30min，再将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入50μl增强剂，孵育2h，最后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，取80％的无水乙醇在磁性分离器上漂洗2遍，最后取20μl漂洗液1重悬，得到处理重悬好的磁珠a；
[0029]
s3：将处理重悬好的磁珠a与等体积的生物素化核酸进行常温孵育30min；
[0030]
s4：孵育后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，将提前预热至65℃的漂洗液2加入磁珠中，混匀，置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，总计漂洗3次，得到捕获了核酸的磁珠b；
[0031]
s5：加入去离子水进行洗脱，将捕获了核酸的磁珠b直接进行pcr扩增且在pcr反应体系中添加2μl增强剂。
[0032]
实施例2
[0033]
增强剂的组分为2mm的mgcl2，2mm的mgso4，0.07m的tris-hcl，0.5mg/ml的bsa混合溶液，tris-hcl的ph为8.0。
[0034]
漂洗液1的组分为10mm的tris-hcl，1.0mm的edta，2m的nacl的混合溶液，tris-hcl的ph为7.5。
[0035]
漂洗液2的组分为5mm的tris-hcl，0.5mm的edta，1.0m的nacl，0.05％吐温20的混合溶液，tris-hcl的ph为7.5。
[0036]
s1：将链霉亲和素磁珠室温静置30min；
[0037]
s2：使用前，将磁珠置于涡旋振荡器上重悬30s，得到磁珠液，将10μl磁珠液加入到ep管中，将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入等体积的漂洗液2，重悬，孵育30min，再将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入50μl增强剂，孵育2h，最后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，取80％的无水乙醇在磁性分离器上漂洗2遍，最后取20μl漂洗液1重悬，得到处理重悬好的磁珠a；
[0038]
s3：将处理重悬好的磁珠a与等体积的生物素化核酸进行常温孵育30min；
[0039]
s4：孵育后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，将提前预热至65℃的漂洗液2加入磁珠中，混匀，置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，总计漂洗3次，得到捕获了核酸的磁珠b；
[0040]
s5：加入去离子水进行洗脱，将捕获了核酸的磁珠b直接进行pcr扩增且在pcr反应体系中添加2μl增强剂。
[0041]
实施例3
[0042]
增强剂的组分为4mm的mgcl2，3mm的mgso4，0.1m的tris-hcl，0.6mg/ml的bsa混合溶液，tris-hcl的ph为8.0。
[0043]
漂洗液1的组分为12mm的tris-hcl，1.5mm的edta，3m的nacl的混合溶液，tris-hcl的ph为7.5。
[0044]
漂洗液2的组分为6mm的tris-hcl，0.8mm的edta，1.5m的nacl，0.1％吐温20的混合溶液，tris-hcl的ph为7.5。
[0045]
s1：将链霉亲和素磁珠室温静置30min；
[0046]
s2：使用前，将磁珠置于涡旋振荡器上重悬30s，得到磁珠液，将10μl磁珠液加入到
ep管中，将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入等体积的漂洗液2，重悬，孵育30min，再将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入50μl增强剂，孵育2h，最后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，取80％的无水乙醇在磁性分离器上漂洗2遍，最后取20μl漂洗液1重悬，得到处理重悬好的磁珠a；
[0047]
s3：将处理重悬好的磁珠a与等体积的生物素化核酸进行常温孵育30min；
[0048]
s4：孵育后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，将提前预热至65℃的漂洗液2加入磁珠中，混匀，置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，总计漂洗3次，得到捕获了核酸的磁珠b；
[0049]
s5：加入去离子水进行洗脱，将捕获了核酸的磁珠b直接进行pcr扩增且在pcr反应体系中添加2μl增强剂。
[0050]
对比例1
[0051]
增强剂的组分为1mm的mgcl2，1mm的mgso4，0.03m的tris-hcl，0.4mg/ml的bsa混合溶液；tris-hcl的ph为8.0。
[0052]
漂洗液1的组分为8mm的tris-hcl，0.5mm的edta，1m的nacl的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0053]
s1：将链霉亲和素磁珠室温静置30min；
[0054]
s2：使用前，将磁珠置于涡旋振荡器上重悬30s，得到磁珠液，将10μl磁珠液加入到ep管中，将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入等体积的漂洗液1，重悬，再将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入50μl增强剂，孵育2h，最后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，取80％的无水乙醇在磁性分离器上漂洗2遍，最后取20μl漂洗液1重悬，得到处理重悬好的磁珠a；
[0055]
s3：将处理重悬好的磁珠a与等体积的生物素化核酸进行常温孵育30min；
[0056]
s4：孵育后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，将提前预热至65℃的漂洗液1加入磁珠中，混匀，置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，总计漂洗3次，得到捕获了核酸的磁珠b；
[0057]
s5：加入去离子水进行洗脱，将捕获了核酸的磁珠b直接进行pcr扩增且在pcr反应体系中添加2μl增强剂。
[0058]
对比例2
[0059]
增强剂的组分为1mm的mgcl2，1mm的mgso4，0.03m的tris-hcl混合溶液；tris-hcl的ph为8.0。
[0060]
漂洗液1的组分为8mm的tris-hcl，0.5mm的edta，1m的nacl的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0061]
漂洗液2的组分为4mm的tris-hcl，0.2mm的edta，0.5m的nacl，0.01％吐温20的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0062]
s1：将链霉亲和素磁珠室温静置30min；
[0063]
s2：使用前，将磁珠置于涡旋振荡器上重悬30s，得到磁珠液，将10μl磁珠液加入到ep管中，将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入等体积的
漂洗液2，重悬，孵育30min，再将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入50μl增强剂，孵育2h，最后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，取80％的无水乙醇在磁性分离器上漂洗2遍，最后取20μl漂洗液1重悬，得到处理重悬好的磁珠a；
[0064]
s3：将处理重悬好的磁珠a与等体积的生物素化核酸进行常温孵育30min；
[0065]
s4：孵育后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，将提前预热至65℃的漂洗液2加入磁珠中，混匀，置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，总计漂洗3次，得到捕获了核酸的磁珠b；
[0066]
s5：加入去离子水进行洗脱，将捕获了核酸的磁珠b直接进行pcr扩增且在pcr反应体系中添加2μl增强剂。
[0067]
对比例3
[0068]
增强剂的组分为1mm的mgcl2，1mm的mgso4，0.03m的tris-hcl，0.4mg/ml的bsa混合溶液；tris-hcl的ph为8.0。
[0069]
漂洗液1的组分为8mm的tris-hcl，0.5mm的edta，1m的nacl的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0070]
漂洗液2的组分为4mm的tris-hcl，0.2mm的edta，0.5m的nacl，0.01％吐温20的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0071]
s1：将链霉亲和素磁珠室温静置30min；
[0072]
s2：使用前，将磁珠置于涡旋振荡器上重悬30s，得到磁珠液，将10μl磁珠液加入到ep管中，将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入等体积的漂洗液2，重悬，孵育30min，再将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，取80％的无水乙醇在磁性分离器上漂洗2遍，最后取20μl漂洗液1重悬，得到处理重悬好的磁珠a；
[0073]
s3：将处理重悬好的磁珠a与等体积的生物素化核酸进行常温孵育30min；
[0074]
s4：孵育后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，将提前预热至65℃的漂洗液2加入磁珠中，混匀，置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，总计漂洗3次，得到捕获了核酸的磁珠b；
[0075]
s5：加入去离子水进行洗脱，将捕获了核酸的磁珠b直接进行pcr扩增且在pcr反应体系中添加2μl增强剂。
[0076]
对比例4
[0077]
增强剂的组分为1mm的mgcl2，1mm的mgso4，0.03m的tris-hcl，0.4mg/ml的bsa混合溶液；tris-hcl的ph为8.0。
[0078]
漂洗液1的组分为8mm的tris-hcl，0.5mm的edta，1m的nacl的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0079]
漂洗液2的组分为4mm的tris-hcl，0.2mm的edta，0.5m的nacl，0.01％吐温20的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0080]
s1：将链霉亲和素磁珠室温静置30min；
[0081]
s2：使用前，将磁珠置于涡旋振荡器上重悬30s，得到磁珠液，将10μl磁珠液加入到ep管中，将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入等体积的
漂洗液2，重悬，孵育30min，再将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入50μl增强剂，孵育2h，最后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，取80％的无水乙醇在磁性分离器上漂洗2遍，最后取20μl漂洗液1重悬，得到处理重悬好的磁珠a；
[0082]
s3：将处理重悬好的磁珠a与等体积的生物素化核酸进行常温孵育30min；
[0083]
s4：孵育后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，将提前预热至65℃的漂洗液2加入磁珠中，混匀，置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，总计漂洗3次，得到捕获了核酸的磁珠b；
[0084]
s5：加入去离子水进行洗脱，将捕获了核酸的磁珠b直接进行pcr扩增。
[0085]
对比例5
[0086]
漂洗液1的组分为8mm的tris-hcl，0.5mm的edta，1m的nacl的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0087]
漂洗液2的组分为4mm的tris-hcl，0.2mm的edta，0.5m的nacl，0.01％吐温20的混合溶液；tris-hcl的ph为7.5。
[0088]
s1：将链霉亲和素磁珠室温静置30min；
[0089]
s2：使用前，将磁珠置于涡旋振荡器上重悬30s，得到磁珠液，将10μl磁珠液加入到ep管中，将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，再加入等体积的漂洗液2，重悬，孵育30min，再将ep管置于磁性分离器上，静置3min，用移液器小心去除上清液，取80％的无水乙醇在磁性分离器上漂洗2遍，最后取20μl漂洗液1重悬，得到处理重悬好的磁珠a；
[0090]
s3：将处理重悬好的磁珠a与等体积的生物素化核酸进行常温孵育30min；
[0091]
s4：孵育后将ep管置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，将提前预热至65℃的漂洗液2加入磁珠中，混匀，置于磁性分离器上，静置3min，去上清液，总计漂洗3次，得到捕获了核酸的磁珠b；
[0092]
s5：加入去离子水进行洗脱，将捕获了核酸的磁珠b直接进行pcr扩增。
[0093]
实验：定量分析
[0094][0095]
结论：实施例1～3有效提高了pcr反应体系中的链霉亲和素磁珠的活性。
[0096]
对比例1中，没有漂洗液2的漂洗，漂洗液2中浓度较高的tris-hcl和氯化钠能够清洗去除杂质，且漂洗液2中的吐温20具有封闭作用，能够使链霉亲和素磁珠减少非特异性吸附并且降低磁珠本身对后续pcr反应体系的抑制作用，能够减小非特异性信号，提高检测灵敏度。
[0097]
对比例2中，增强剂中未加入bsa，bsa的加入可以防止酶分解和非特异性吸附，未加入bsa导致不能起到封闭磁珠的作用，发生非特异性吸附，增加了反应体系中的非特异信号，降低了检测灵敏度。
[0098]
对比例3中，步骤s2中漂洗液2漂洗后未加入增强剂进行孵育，减少了一次对磁珠的增强孵育，导致对磁珠的封闭作用不足，增加了反应体系中的非特异信号，降低了检测灵敏度。
[0099]
对比例4中，步骤s5中未在pcr反应体系中加入增强剂，使得未与生物素化核酸结合的游离链霉亲和素磁珠没有能够及时封闭，发生非特异性吸附，增加了反应体系中的非特异信号，降低了检测灵敏度。
[0100]
对比例5中，磁珠未采用增强剂孵育，导致不能起到封闭磁珠的作用，bsa的加入可以防止酶分解和非特异性吸附，同时能够降低磁珠对pcr反应的抑制作用，减小非特异性信号，提高检测灵敏度。
[0101]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。