快速检测乙型流感病毒病原体的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体而言，涉及一种快速检测乙型流感病毒病原体的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、乙型流感病毒与甲型流感病毒的亲缘关系很近，都属于正粘病毒属，通过基质蛋白(m蛋白)和核蛋白(np蛋白)的不同来区分。乙型流感病毒不分亚型，根据血凝素的抗原性和基因特征分为2个谱系，即b/victoria/2/1987谱系和b/yamagata/16/1988谱系。这两个谱系在上世纪90年代开始共同循环，起初是b/yamagata系占优势，到了21世纪，b/victoria逐渐成为优势毒株，在人际间引起多次暴发流行。b/victoria和b/yamagata2个谱系间的ha的抗原性有明显差异，两者的抗体交叉保护率低。乙型流感病毒两个谱系间的遗传距离一般在10％左右。但两个谱系间的遗传距离随着时间的推移逐渐增大，提示可能随着时间的推移乙型流感病毒由2个谱系进化为不同的亚型。乙型流感病毒自1940年首次发现以来，一直是单一来源的，几乎只感染人类。虽然在海豹和猪中发现有散在感染，人仍然是乙型流感病毒的主要感染宿主，并持续在人类中存在。

2、检测乙型流感病毒的方法主要有免疫学检测和核酸检测。免疫学检测主要包括传统免疫学检测和快速免疫学检测，其中传统免疫学检测包括红细胞凝集及凝集抑制试验(hi)、补体结合试验、琼脂免疫扩散试验(agp)、流感病毒神经氨酸酶活性及其活性抑制试验等。其中hi试验是诊断人类流感病毒感染的血清学常用方法，试验结果较为准确，且无需太多的辅助设备。而快速免疫学检测主要包括胶体金免疫层析(gica)、酶联免疫吸附(elisa)、免疫荧光技术(ifa)等，其中疫金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，基于抗原抗体反应原理而产生的一种新型免疫标记技术，具有检测速度快、操作简便等特点。

3、目前，核酸检测的时效性和特异性相对于免疫学检测更好，应用得更为广泛，核酸检测主要包括rt-pcr、实时定量rt-pcr(real-timepcr)、pcr-relp、依赖核酸序列的扩增法(nasba)技术、环介导等温扩增(lamp)等。其中rt-pcr技术主要为将流感病毒的rna逆转录为dna，选定特定引物对特定片段进行扩增，根据目的片段特异度来鉴别流感病毒；实时定量rt-pcr(real-timepcr)是在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测特异度产物的量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，由于整个检测过程都在封闭管中进行，能有效防止扩增产物的交叉污染，同时确保样本不污染环境，确保实验的准确；pcr-relp需要先设计合成引物，然后扩增基因，接着利用限制内切酶对扩增出的核酸产物进行切割，由于位点具有严格的特异度，导致核苷酸片段数目和长短不同，在琼脂糖凝胶上形成不同分布来鉴定流感病毒；依赖核酸序列的扩增法(nasba)技术是一项以rna为模板的快速等温扩增技术，这项技术特别适用于rna分子的检测；环介导等温扩增(lamp)是一种新型核酸扩增技术，其原理是在具有链置换活性的dna聚合酶作用下，利用能识别目的基因上6个独立区段的4条引物，在60～65℃恒温条件下高效特异地扩增目的基因，在扩增的过程中会产生大量焦磷酸根离子，其与金属离子形成不可溶的盐，生成白色焦磷酸盐沉淀，可直观观察扩增结果。

4、市面上检测乙型流感的主要方法是rt-pcr，real-time-pcr等核酸检测技术，采用qpcr技术可以直接检测临床样本，相对于传统的检测手段，即红细胞凝集及凝集抑制试验和琼脂免疫扩散试验、胶体金免疫层析、酶联免疫吸附等，其时效性与特异度较好，但是目前市面上qpcr的检测方法基本上需要1～1.5h左右，导致患者不能及时得到检测，延长患者在医院里的等待时间。

5、另外，传统免疫学检测仅对已发现的病毒有效，且试验条件繁琐，对实验技术的要求也较为苛刻；快速免疫学检测特异性相对较低，假阳性率也较高；rt-pcr等核酸检测技术特异性较好，但需要其他昂贵的设备进行辅助。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种快速检测乙型流感病毒病原体的试剂盒及其应用，以缩短乙型流感病毒病原体的检测时间。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测乙型流感病毒病原体核酸的试剂盒。该试剂盒包含乙型流感病原体正向引物seq id no：1和乙型流感病原体反向引物seq id no：2。

3、进一步地，试剂盒还包括乙型流感病原体寡核苷酸探针seq id no：3；优选的，乙型流感病原体寡核苷酸探针的5’端标记有fam通道的荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团和/或mgb。

4、进一步地，荧光报告基团选自fam、nex、rox、tet、tamra、joe、vic、cy3、cy5或texasred。

5、进一步地，荧光淬灭基团选自bhq、tamra、eclipse、dabcyl、lowa blacktm rq或lowa blacktm fq。

6、进一步地，试剂盒还包含pcr反应液及酶混合液。

7、进一步地，pcr反应液包括datps、dutps、dgtps、dctps和dttps五种核苷酸、10xbsa、含有镁离子的缓冲液。

8、进一步地，乙型流感病原体正向引物seq id no：1、乙型流感病原体反向引物seqid no：2和乙型流感病原体寡核苷酸探针seq id no：3包含在pcr反应液中。

9、进一步地，酶混合液包括taq酶、逆转录酶、rna酶抑制剂与热敏udg酶。

10、根据本发明的再一方面，提供了一种检测乙型流感病毒病原体核酸的系统。该系统包括：核酸提取装置，设置为用于提取样本核酸；检测装置，包括实时荧光定量pcr分析仪和上述检测乙型流感病毒病原体核酸的试剂盒；数据分析装置，设置为对实时荧光定量pcr分析仪的数据文件进行分析并输出结果。

11、进一步地，实时荧光定量pcr分析仪为快速实时荧光定量pcr分析仪，设置为45s以内完成每个循环；优选的，实时荧光定量pcr分析仪为超快速实时荧光定量pcr分析仪，设置为23s以内完成每个循环。应用本发明的技术方案，使用本发明的试剂盒及检测方法，可以实现10min完成40个循环的超快速pcr扩增检测，并且检测灵敏度与常规荧光定量pcr技术相当，乙型流感病毒病原体的最低检出限可以达到200copies/ml。

技术特征：

1.一种检测乙型流感病毒病原体核酸的试剂盒，其特征在于，包含乙型流感病原体正向引物seq id no：1和乙型流感病原体反向引物seq id no：2。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括乙型流感病原体寡核苷酸探针seq id no：3；

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团选自fam、nex、rox、tet、tamra、joe、vic、cy3、cy5或texas red。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自bhq、tamra、eclipse、dabcyl、lowa blacktm rq或lowa blacktm fq。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含pcr反应液及酶混合液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应液包括datps、dutps、dgtps、dctps和dttps五种核苷酸、10x bsa和含有镁离子的缓冲液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述乙型流感病原体正向引物seq idno：1、乙型流感病原体反向引物seq id no：2和乙型流感病原体寡核苷酸探针seq id no：3包含在所述pcr反应液中。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括taq酶、逆转录酶、rna酶抑制剂与热敏udg酶。

9.一种检测乙型流感病毒病原体核酸的系统，其特征在于，包括：

10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述实时荧光定量pcr分析仪为快速实时荧光定量pcr分析仪，设置为45s以内完成每个循环；

技术总结
本发明公开了一种快速检测乙型流感病毒病原体的试剂盒及其应用。其中，该试剂盒包含乙型流感病原体正向引物SEQ ID NO：1和乙型流感病原体反向引物SEQ ID NO：2。应用本发明的技术方案，使用本发明的试剂盒及检测方法，可以实现10min完成40个循环的超快速PCR扩增检测，并且检测灵敏度与常规荧光定量PCR技术相当，乙型流感病毒病原体的最低检出限可以达到200copies/mL。

技术研发人员：毛平道,黄华香,张萌
受保护的技术使用者：广东润鹏生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13