一种鉴别榛属物种的DNA条形码及其扩增引物和应用的制作方法

本发明属于基因，具体涉及一种鉴别榛属物种的dna条形码及其扩增引物和应用。

背景技术：

1、榛(hazelnut)为桦木科(betulaceae)榛属(corylus l.)植物的统称，世界范围内约有20种，在北温带(亚洲、欧洲和北美洲)广泛分布。榛坚果含有丰富的油脂和蛋白质，可直接鲜食、炒/烤食，也可榨油或作为原料加工成各类食品，具有“坚果之王”的美誉。

2、榛属近缘种间广泛的自然杂交、不完全谱系分选和趋同进化机制导致不同榛种乃至同种的不同种群间在形态特征、组织结构以及坚果品质方面表现出明显的不规律性，既存在种间差异，又具有种内变异。此外，表观性状还易受环境变化的影响而产生不稳定的变异。可见，凭借传统的形态学、解剖学及理化性质判定方法不能科学、全面地评价和鉴别榛属植物。因此，为了从物种水平上实现对榛属种质的精准利用，需要一种更快速、有效的方法进行物种鉴定。

3、与传统鉴定方法相比，dna条形码技术具有准确高效、重复性强、不受外界环境干扰的优势，已广泛应用于植物分类鉴定和系统进化研究。在榛属植物中，虽然国际通用条形码its、matk、atpb-rbcl、psba-trnh等在属或组水平上的鉴别率较高，但在种水平的分辨率较低，尤其对遗传距离较近的近缘种、种与变种等缺乏有效的鉴别能力。鉴于此，为提高种质资源的开发和利用效率，开发适用于榛属物种鉴定的特异性dna条形码非常必要。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面提供一种鉴别榛属物种的dna条形码，其为由榛属物种叶绿体基因组的以下4个高变区连接而成的序列：ndhf-rpl32、rpl32-trnl、ycf1和trns-trng，其中所述ndhf-rpl32表示基因ndhf和rpl32之间的非编码区，所述rpl32-trnl表示基因rpl32和trnl之间的非编码区，所述ycf1表示编码区基因ycf1，所述trns-trng表示基因trns和trng之间的非编码区。

2、在一些实施方式中，用于扩增ndhf-rpl32的上下游引物分别如seq id no:3-4所示；用于扩增rpl32-trnl的上下游引物分别如seq id no:5-6所示；用于扩增ycf1的上下游引物分别如seq id no:7-8所示；用于扩增trns-trng的上下游引物分别如seq id no:9-10所示。

3、本发明另一方面提供一种用于鉴别榛属物种的引物组合，其包括：

4、用于扩增ndhf-rpl32的上下游引物，其核苷酸序列分别如seq id no:3-4所示；

5、用于扩增rpl32-trnl的上下游引物，其核苷酸序列分别如seq id no:5-6所示；

6、用于扩增ycf1的上下游引物，其核苷酸序列分别如seq id no:7-8所示；

7、用于扩增trns-trng的上下游引物，其核苷酸序列分别如seq id no:9-10所示。

8、本发明另一方面还提供一种用于鉴别榛属物种的试剂盒，其包括上述的引物组合。

9、上述的dna条形码、引物组合、或试剂盒在鉴别榛属物种中的应用也属于本发明的内容。

10、本发明再一方面还提供一种鉴别榛属物种的方法，其包括以下步骤：

11、s1)以不同待测样本的叶绿体dna为模板，使用上述的引物组合分别进行pcr扩增，得到以下4个高变区的pcr扩增产物：ndhf-rpl32、rpl32-trnl、ycf1和trns-trng；

12、s2)对步骤s1)得到的4个高变区的pcr扩增产物进行测序，分别得到不同待测样本的叶绿体dna的4个高变区序列，并将不同待测样本的所述4个高变区序列按相同顺序拼接、校对，分别得到不同待测样本对应的dna条形码；

13、s3)根据步骤s2)所得不同待测样本的dna条形码进行聚类分析，以鉴别榛属物种。

14、在一些实施方式中，步骤s1)中所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60-50℃梯度复性1min，72℃延伸1min，30个循环；最终72℃延伸10min。

15、在一些实施方式中，步骤s3)中所述聚类分析为使用不同待测样本的dna条形码构建ml系统发育树，若榛属物种分布于支持率不低于75％的不同分枝，则确定为不同种。

16、基于以上技术方案提供的鉴别榛属物种的dna条形码为由榛属物种叶绿体基因组的以下4个高变区连接而成的序列：ndhf-rpl32、rpl32-trnl、ycf1和trns-trng，利用该dna条形码对榛属物种进行鉴别时，可以达到与利用叶绿体全基因组序列鉴别榛属物种的同等效力，可实现对榛属物种的快速、准确鉴别。本发明提供的试剂盒和方法可应用于农业科研与生产的种质资源鉴定中，为榛属种质资源的分类管理和应用提供重要依据。

技术特征：

1.一种鉴别榛属物种的dna条形码，其特征在于，所述dna条形码为由榛属物种叶绿体基因组的以下4个高变区连接而成的序列：ndhf-rpl32、rpl32-trnl、ycf1和trns-trng，其中所述ndhf-rpl32表示基因ndhf和rpl32之间的非编码区，所述rpl32-trnl表示基因rpl32和trnl之间的非编码区，所述ycf1表示编码区基因ycf1，所述trns-trng表示基因trns和trng之间的非编码区。

2.根据权利要求1所述的dna条形码，其特征在于，

3.用于鉴别榛属物种的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：

4.用于鉴别榛属物种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的引物组合。

5.权利要求1或2所述的dna条形码、权利要求3所述的引物组合、或权利要求4所述的试剂盒在鉴别榛属物种中的应用。

6.一种鉴别榛属物种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤s1)中所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60-50℃梯度复性1min，72℃延伸1min，30个循环；最终72℃延伸10min。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤s3)中所述聚类分析为使用不同待测样本的dna条形码构建ml系统发育树，若榛属物种分布于支持率不低于75％的不同分枝，则确定为不同种。

技术总结
本发明公开一种鉴别榛属物种的DNA条形码及其扩增引物和应用，其中DNA条形码为由榛属物种叶绿体基因组的以下4个高变区连接而成的序列：ndhF‑rpl32、rpl32‑trnL、ycf1和trnS‑trnG。本发明提供的鉴别榛属物种的DNA条形码能够达到与叶绿体全基因组序列鉴别榛属物种的同等效力，可实现对榛属物种的快速、准确鉴别。

技术研发人员：杨振,马庆华,赵天田,梁丽松,王贵禧
受保护的技术使用者：中国林业科学研究院林业研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13