诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法与流程

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法。

背景技术：

1、骨组织工程技术通过把种子细胞和能引导骨组织再生的生物活性因子整合植入特殊的支架结构中而形成组织工程复合骨，可替代传统的移植材料。传统应用的种子细胞包括分化晚期成骨细胞、骨髓混合细胞或纯化的间充质干细胞等。其中间充质干细胞(mesenchymal stem cell，msc)增殖较快，应用于体内植入和体外培育均具有很强的成骨能力，而且在骨再生过程中能旁分泌引导骨组织再生的生物活性因子，因此在骨组织工程中有重要作用。

2、间充质干细胞因其具有自我更新能力和低致癌性，在特定条件下可诱导分化成为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、肝脏细胞、神经细胞或皮肤细胞等多种细胞类型，基于间充质干细胞定向成骨分化特性的骨组织再造修复应用备受临床关注。另外，近期研究还发现间充质干细胞除具有很好的免疫调节特性外，还可被用于关节炎或骨损伤所造成的局部及系统性过度免疫反应及重度炎症的控制与缓解，临床转化及应用市场巨大。然而，临床上应用的细胞，至少需要10次以上传代才能满足约1×109的数量需求，而传统来源的间充质干细胞有限扩增能力和细胞衰老问题使其难以满足临床数量要求。另外，衰老和相关疾病也可能会影响传统组织来源间充质干细胞的自我更新和分化潜能。由于成体来源的间充质干细胞存在上述不足，严重影响了规模化制备和未来大规模临床应用和疾病治疗。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞的制备方法，以克服用于细胞移植的间充质干细胞来源少的问题。

2、此外，还提供一种诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞。

3、一种诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

4、悬浮培养过表达成纤维细胞生长因子的诱导性多能干细胞，得到拟胚体；及

5、在包含tgf-β信号通路抑制剂的贴壁诱导培养基中培养所述拟胚体，得到目标间充质干细胞。

6、上述诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞的制备方法，采用诱导性多能干细胞作为间充质干细胞的来源，从而克服细胞移植来源少的问题。并且，通过利用成纤维细胞生长因子基因过表达及tgf-β信号通路抑制剂对诱导性多能干细胞的诱导分化，能够制备得到具有较高成骨分化能力的间充质干细胞且该方法的制备效率高。

7、在其中一个实施例中，所述成纤维细胞生长因子包括bfgf。

8、在其中一个实施例中，与野生型诱导性多能干细胞相比，所述过表达成纤维细胞生长因子的诱导性多能干细胞的bfgf的mrna表达量提高了1倍～5倍。

9、在其中一个实施例中，所述tgf-β信号通路抑制剂包括sb431542、a83-01、galunisertib、ldn193189、repsox、ly2109761、dmh-1、ly-364947或vactosertib。

10、在其中一个实施例中，所述tgf-β信号通路抑制剂包括sb431542；所述sb431542在所述贴壁诱导培养基中的终浓度为1μm～50μm。

11、在其中一个实施例中，所述贴壁诱导培养基包括dmem高糖培养基、dmem低糖培养基或dmem/f12培养基。

12、在其中一个实施例中，所述贴壁诱导培养基还包括如下物质中的一种或多种：

13、体积浓度为1％～20％的血清；

14、体积浓度为1％～2％的neaa；

15、体积浓度为1％～2％的谷氨酰胺替代物。

16、在其中一个实施例中，所述贴壁诱导培养基包括终浓度为5μm～30μm的sb431542、dmem高糖培养基、体积浓度为5％～15％的血清、体积浓度为1％～1.5％的neaa和体积浓度为1％～1.5％的谷氨酰胺替代物。

17、在其中一个实施例中，所述血清包括人血清、胎牛血清、小牛血清、马血清和血清替代物中的任意一种或几种。

18、一种诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞，根据上述任一实施例所述的制备方法制备得到。

技术特征：

1.一种诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述成纤维细胞生长因子包括bfgf。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，与野生型诱导性多能干细胞相比，所述过表达成纤维细胞生长因子的诱导性多能干细胞的bfgf的mrna表达量提高了1倍～5倍。

4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述tgf-β信号通路抑制剂包括sb431542、a83-01、galunisertib、ldn193189、repsox、ly2109761、dmh-1、ly-364947或vactosertib。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述tgf-β信号通路抑制剂包括sb431542；所述sb431542在所述贴壁诱导培养基中的终浓度为1μm～50μm。

6.根据权利要求1～3和5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述贴壁诱导培养基包括dmem高糖培养基、dmem低糖培养基或dmem/f12培养基。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述贴壁诱导培养基还包括如下物质中的一种或多种：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述贴壁诱导培养基包括终浓度为5μm～30μm的sb431542、dmem高糖培养基、体积浓度为5％～15％的血清、体积浓度为1％～1.5％的neaa和体积浓度为1％～1.5％的谷氨酰胺替代物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述血清包括人血清、胎牛血清、小牛血清、马血清和血清替代物中的任意一种或几种。

10.一种诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞，其特征在于，根据权利要求1～9任一项所述的制备方法制备得到。

技术总结
本发明涉及一种诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法。该诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞的制备方法，采用诱导性多能干细胞作为间充质干细胞的来源，从而克服细胞移植来源少的问题。并且，通过利用成纤维细胞生长因子基因过表达及TGF‑β信号通路抑制剂对诱导性多能干细胞的诱导分化，能够制备得到具有较高成骨分化能力的间充质干细胞且该方法的制备效率高。

技术研发人员：何敏仪,吴海涛,沈政,王新志,侯怀信
受保护的技术使用者：北昊干细胞与再生医学研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8