一种细胞培养雪花肉的制造方法

本发明涉及一种细胞培养雪花肉的制造方法，具体涉及一种可以利用肌肉干细胞同时产生肌纤维和脂肪的细胞培养雪花肉的制作方法，属于干细胞培养及细胞培养肉。

背景技术：

1、细胞培养肉(cultured meat)作为未来食品的重要组成部分，是根据肌肉组织的生长发育及损伤修复机理，利用体外培养动物细胞的方式，获得肌纤维、脂肪等构成肌肉组织的细胞，再经过收集、塑形、食品化加工而成的一种新型肉类食品。相比于传统肉类生产，细胞培养肉具有良好的资源转化率和可持续发展潜力，其生产过程不涉及牲畜的饲喂和宰杀，大大缩短了肉类的生产周期，同时可以提供真实的动物蛋白，必将会成为未来肉制品市场的重要组成部分。

2、市售的肉含有肌纤维和脂肪等组织，提供了丰富的蛋白质和脂肪酸等，同时也保证了肉类制品的优质口感。细胞培养肉制作过程中，通常利用肌肉干细胞(muscle stemcell，又称肌卫星细胞，satellite cell)作为种子细胞，经过体外扩增分化产生成肌细胞，再进一步分化、融合产生大量肌纤维，构成肌肉组织。但是目前，采用肌肉干细胞作为种子细胞主要用于细胞培养肌纤维的生产，若要进行细胞培养脂肪组织的制造，需要利用其他种子细胞，如间充质干细胞(mesenchymal stem cells)，造成生产工艺复杂、成本提升。如果仅采用肌肉干细胞作为种子细胞，挖掘其成脂分化能力，研发肌肉干细胞成脂分化策略，为制造同时含有肌纤维和脂肪的细胞培养雪花肉提供一种全新的方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种利用肌肉干细胞同时产生肌纤维和脂肪的细胞培养肉制作方法，同时可以通过调整成肌分化能力不同的肌肉干细胞的比例，从而调控细胞培养肉中肌纤维和脂肪的比例。

2、本发明的第一个目的是提供了一种快速诱导肌肉干细胞同时成肌和成脂分化的培养基，细胞可以在诱导4天后形成明显的肌管及脂滴，所述培养基的组成为(a)或(b)：

3、(a)基础培养基、胎牛血清、胰岛素、罗格列酮、油酸；

4、(b)基础培养基、马血清、罗格列酮、油酸；

5、在一种实施方式中，所述基础培养包括dmem或f12。

6、在一种实施方式中，(a)中，胎牛血清使用浓度为5％(v/v)，胰岛素使用浓度为1～50mg/l，罗格列酮使用浓度为1～50mg/l，油酸的使用浓度为10～300μm。

7、在一种实施方式中，胰岛素的使用浓度为10mg/l，罗格列酮使用浓度为10mg/l，油酸的使用浓度为100μm。

8、在一种实施方式中，(b)中，马血清使用浓度为2％(v/v)，罗格列酮使用浓度为1～50μm，油酸的使用浓度为10～300μm。

9、在一种实施方式中，罗格列酮使用浓度为10μm，油酸的使用浓度为100μm。

10、在一种实施方式中，所述肌肉干细胞包括但不限于哺乳动物或卵生动物的肌肉干细胞。

11、在一种实施方式中，所述肌肉干细胞包括猪、鸡、鸭、牛或羊的肌肉干细胞。

12、肌肉干细胞生长至80～90％密度时更换roi培养基或ro培养基，在37℃、5％co2条件下培养，24小时更换一次培养基，诱导分化4天左右，能同时形成明显的肌管和脂滴。

13、本发明的第二目的是提供一种维持肌肉干细胞长期成肌和成脂分化的培养基，所述培养基由两部分组成：培养基a+培养基b；培养基a的组成为：基础培养基、胎牛血清、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌(ibmx)、吲哚美辛(idm)、胰岛素、罗格列酮；培养基b：基础培养基、胎牛血清、胰岛素。

14、在一种实施方式中，培养基a中，胎牛血清使用浓度为10％(v/v)，地塞米松使用浓度为0.1～5μm，ibmx使用浓度为1～100μm，idm使用浓度为0.1～5μm，胰岛素使用浓度为10～300nm，罗格列酮使用浓度为1～30μm。

15、在一种实施方式中，地塞米松使用浓度为1μm，ibmx使用浓度为1μm，idm使用浓度为1μm，胰岛素使用浓度为100nm，罗格列酮使用浓度为10μm。

16、在一种实施方式中，培养基b中，胎牛血清使用浓度为10％(v/v)，胰岛素使用浓度为10～300nm。

17、本发明的第三个目的是提供一种维持肌肉干细胞长期成肌和成脂分化的培养方法，所述方法为利用上述维持肌肉干细胞长期成肌和成脂分化的培养基进行肌肉干细胞的分化培养。

18、在一种实施方式中，所述方法为将肌肉干细胞置于普通培养基中培养至细胞密度为80～90％，更换培养基a，每24小时更换一次培养基，诱导分化3天后，更换培养基b，培养2天，循环培养3次。

19、在一种实施方式中，所述普通培养基为基础培养基和10％(v/v)胎牛血清。

20、在一种实施方式中，所述基础培养包括dmem或f12。

21、在一种实施方式中，所述方法的培养条件为在37℃、5％co2。

22、本发明的第四个目的是提供了一种调控细胞培养肉中脂肪和肌纤维比例的方法，将不同代数的肌肉干细胞按照一定比例混合，于上述培养基快速诱导肌肉干细胞同时成肌和成脂分化的培养基或上述维持肌肉干细胞长期成肌和成脂分化的培养基中进行成肌和成脂分化培养。

23、本发明还提供了上述快速诱导肌肉干细胞同时成肌和成脂分化的培养基或上述维持肌肉干细胞长期成肌和成脂分化的培养基在细胞培养肉领域的应用。

24、有益效果：

25、肌内前体脂肪细胞和肌肉干细胞(也称肌卫星细胞)是两种不同的细胞，肌内前体脂肪细胞主要定向分化为脂肪组织，肌肉干细胞则具有多能性，具有分化为肌纤维、脂肪、骨等潜力；制作细胞培养肉需要肌纤维、脂肪等组织构成，通常需要单独培养2种或以上细胞并分别诱导或共培养才可形成同时含有肌纤维和脂肪，但因为肌肉干细胞具有多向分化的潜力，所以本发明在诱导脂肪细胞成脂培养的培养基基础上优化并运用于肌肉干细胞上，使其可以同时成肌成脂，达到仅用一种细胞同时产生肌纤维和脂肪的作用。

26、本发明确定了三种可以实现肌肉干细胞同时成肌成脂的培养基，分别可以实现肌肉干细胞的快速成肌成脂分化以及长期维持肌肉干细胞成肌成脂分化状态。同时发现体外培养不同时间肌肉干细胞的成肌分化和成脂分化能力不同，体外培养时间较短的细胞成肌分化能力更强，培养时间较长的细胞能够获得更多的脂肪，因此可以通过调控培养肉中成肌分化能力不同的肌肉干细胞的比例，来控制细胞培养肉中脂肪和肌纤维的比例。可以在同一诱导条件下同时实现肌肉干细胞的成肌和成脂分化，无需培养多种类型细胞，即可实现培养肉中肌纤维和脂肪的同时获得，大大减少了培养细胞的工作量，为细胞培养肉的工业化和定制化生产提供了一个新的思路和方法。

技术特征：

1.一种快速诱导肌肉干细胞同时成肌和成脂分化的培养基，其特征在于，所述培养基的组成为(a)或(b)：

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养包括dmem或f12。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，(a)中，以体积比计，胎牛血清使用浓度为5％，胰岛素使用浓度为1～50mg/l，罗格列酮使用浓度为1～50mg/l，油酸的使用浓度为10～300μm。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，(b)中，以体积比计，马血清使用浓度为2％，罗格列酮使用浓度为1～50μm，油酸的使用浓度为10～300μm。

5.一种维持肌肉干细胞长期成肌和成脂分化的培养基，其特征在于，所述培养基由两部分组成：培养基a和培养基b；

6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，培养基a中，胎牛血清使用浓度为10％，地塞米松使用浓度为0.1～5μm，ibmx使用浓度为1～100μm，idm使用浓度为0.1～5μm，胰岛素使用浓度为10～300nm，罗格列酮使用浓度为1～30μm；

7.一种维持肌肉干细胞长期成肌和成脂分化的培养方法，所述方法为利用权利要求5或6所述维持肌肉干细胞长期成肌和成脂分化的培养基进行肌肉干细胞的分化培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为将肌肉干细胞置于普通培养基中培养至细胞密度为80～90％，更换培养基a，每24小时更换一次培养基，诱导分化3天后，更换培养基b，培养2天，循环培养3次。

9.一种调控细胞培养肉中脂肪和肌纤维比例的方法，其特征在于，将不同培养代数的肌肉干细胞按比例混合，于权利要求1～4任一所述培养基或权利要求5或6所述的培养基中进行成肌和成脂分化培养。

10.权利要求1～4任一所述培养基或权利要求5或6所述的培养基在细胞培养肉领域的应用。

技术总结
本发明公开了一种细胞培养雪花肉的制造方法，属于干细胞培养及细胞培养肉技术领域。本发明公开了实现肌肉干细胞同时成肌成脂的培养基，分别可以实现肌肉干细胞的快速成肌成脂分化以及长期维持肌肉干细胞成肌成脂分化状态。本发明公开了一种利用肌肉干细胞同时产生肌纤维和脂肪的细胞培养肉制作方法，并公开了一种通过调控成肌分化能力不同的肌肉干细胞的比例，来控制细胞培养肉中脂肪和肌纤维的比例。本发明实现了在同一诱导条件下，在二维和三维培养条件中同时实现肌肉干细胞的成肌和成脂分化，无需培养多种类型细胞，即可实现培养肉中肌纤维和脂肪的同时获得，减少细胞培养的工作量，为细胞培养肉的工业化和定制化生产提供了新的思路和方法。

技术研发人员：关欣,周景文,雷庆子,陈坚,堵国成
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4