AML相关的lncRNA标志物、检测试剂盒及方法在AML诊断与预后中的应用与流程

本发明属于基因工程生物，特别是涉及一种aml相关的lncrna标志物、检测试剂盒及方法在aml诊断与预后中的应用。

背景技术：

1、急性髓细胞性白血病(aml)是一种遗传多样性的造血系统恶性疾病，是成人白血病中最常见的类型。其发病机理复杂，涉及细胞分化、增殖、凋亡等多方面的异常改变。尽管在化疗、造血干细胞移植等方面取得了诸多进展，但aml患者生存率的提高仍不尽人意。总体而言，当前aml临床预后依然较差、死亡率高，其总的5年生存率不超过50％。随着我国人口老龄化加剧，近年来aml发病率呈升高态势。基于荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization，fish)和下一代测序技术(next generation sequencing，ngs)的aml鉴定方法多强调异质性，且所需检定周期较长，不利于aml的快速鉴定。因此，进一步解析aml发生发展的分子机制，筛选新的生物标志物以提供有效的诊断、治疗与预后预测方案至关重要。

2、近年来的研究表明，非编码rna与肿瘤的发生、发展密切相关，可作为有效的分子标志物应用于肿瘤的辅助诊断、预后判断与疾病监测，并可为治疗提供更多的靶向分子。然而在aml中，仍有大量非编码rna的功能未被阐明，临床期待发现更多特异而敏感的非编码rna，并将其运用于aml的临床诊疗。

3、foxn3-as1(ensembl数据库编号为ensg00000258920)是foxn3基因的反义转录本，隶属于长链非编码rna(lncrna)类。在目前研究中，lncrna foxn3-as1的失调仅在非小细胞肺癌与乳腺癌中发现(pmid:25590602；pmid:34703931)，需更多的功能研究来阐明lncrnafoxn3-as1在肿瘤发生中的确切作用。当前尚无报道揭示，lncrna foxn3-as1在aml中的表达情况，以及是否可作为aml的标志物，也无在aml中lncrna foxn3-as1表达的检测方法。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于，克服现有技术中诊断aml的不足，提供一种aml相关的lncrna标志物、检测试剂盒及方法在aml诊断与预后中的应用。本发明基于实时荧光定量pcr检测人lncrna foxn3-as1表达水平的方法，以此作为aml患者的生物标志物，为临床上aml患者的诊断及预后判断提供支持。

2、本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

3、本发明一个方面提供了一种与aml相关的lncrna标志物，所述lncrna foxn3-as1的核苷酸序列如seq id no：1所示。

4、进一步地，所述的lncrna标志物为lncrna foxn3-as1，对所述lncrna foxn3-as1具有检测特异性的引物序列如seq id no：2和seq id no：3所示。

5、本发明另一个方面提供了一种lncrna标志物的应用，所述的lncrna标志物在制备aml诊断与预后试剂盒中的应用。

6、本发明又一个方面还提供了一种aml诊断与预后试剂盒，所述试剂盒用于检测急性髓系白血病组织中标志物lncrna foxn3-as1的相对表达量，所述试剂盒包括引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no：3所示。

7、进一步地，所述试剂盒还包括qpcr扩增mix和ddh2o。

8、进一步地，所述qpcr扩增mix包含sybgreen染料。

9、进一步地，所述试剂盒还包扩内标系统，所示内标系统是根据内参基因gapdh序列设计的内标引物，所述内标引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核酸序列如seqid no.4所示，所述下游引物的核酸序列如seq id no.5所示。

10、本发明再一个方面还提供了一种aml诊断与预后试剂盒检测aml标志物lncrnafoxn3-as1的方法，该方法包括以下步骤：

11、s1、细胞培养：人永生化骨髓细胞株hs-5、人急性髓系白血病细胞株(molm-13、hl-60、kg1a)，使用含10％胎牛血清和1％双抗的培养基dmem在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养，2-3天换液1次；

12、s2、rna的提取：收集培养的细胞，按照总rna提取试剂盒说明书指示操作进行细胞总rna提取；

13、s3、rna的逆转录：按照hifiscript cdna第一链合成试剂盒说明书指示操作，进行反转录合成cdna；

14、s4、荧光定量pcr扩增：采用本发明所述的试剂盒，以步骤s3中获取的cdna为模板，进行pcr扩增，并收集荧光信号；

15、荧光pcr扩增的体系组成及含量为：

16、

17、荧光pcr的反应条件为：95℃预变性10min，然后以95℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共进行38个循环。

18、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果：本发明首次发现了lncrnafoxn3-as1表达水平与aml的发生具有相关性，通过检测受试者lncrna foxn3-as1的表达水平，可以判断受试者是否患有aml，从而使患者在患病早期就能采取相应的预防和治疗措施。本发明提供的lncrna foxn3-as1作为aml临床检测的辅助诊断标志物的优越性在于操作简单、成本低、检测精确，适合临床筛查。相比传统的诊断方法，使用lncrna来诊断aml更具有及时性和灵敏性，从而使患者在患病早期就能采取相应的预防和治疗措施。

19、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并结合附图详细说明如后。

技术特征：

1.一种与aml相关的lncrna标志物，其特征在于，所述的lncrna标志物为lncrnafoxn3-as1，所述lncrna foxn3-as1的核苷酸序列如seq id no：1所示。

2.根据权利要求1所述的与aml相关的lncrna标志物，其特征在于，对所述lncrnafoxn3-as1具有检测特异性的引物序列如seq id no：2和seq id no：3所示。

3.权利要求1所述的lncrna标志物的应用，其特征在于，所述的lncrna标志物在制备aml诊断与预后试剂盒中的应用。

4.一种aml诊断与预后试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测急性髓系白血病组织中标志物lncrna foxn3-as1的相对表达量，所述试剂盒包括引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no：3所示。

5.根据权利要求4所述的aml诊断与预后试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括qpcr扩增mix和ddh2o。

6.根据权利要求5所述的aml诊断与预后试剂盒，其特征在于，所述qpcr扩增mix包含sybgreen染料。

7.根据权利要求4所述的aml诊断与预后试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包扩内标系统，所示内标系统是根据内参基因gapdh序列设计的内标引物，所述内标引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核酸序列如seq id no.4所示，所述下游引物的核酸序列如seq id no.5所示。

8.权利要求4所述的aml诊断与预后试剂盒检测aml标志物lncrna foxn3-as1的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种与AML相关的LncRNA标志物，其特征在于，所述的LncRNA标志物为LncRNA FOXN3‑AS1，所述LncRN A FOXN3‑AS1的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。本发明还公开了检测试剂盒及方法在AML诊断与预后中的应用。本发明的lncRNA FOXN3‑AS1作为AML临床检测的辅助诊断标志物的具有操作简单、成本低、检测精确，适合临床筛查的优势。本发明提供的标记物可应用于制备AML早期评估产品中，有利于进一步阐明AML发病机制，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

技术研发人员：袁奕,方军,尚晓喻,何胜祥
受保护的技术使用者：安徽同科生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11