一种多基因叠加方法在油菜中合成神经酸的应用

本发明属于遗传转化，具体涉及一种多基因叠加方法在油菜中合成神经酸的应用。

背景技术：

1、神经酸(na；24:1δ15，24:1ω-9；顺-15--二十四碳烯酸)是一种长链单不饱和脂肪酸(vlcmfa，22～26碳)，na在促进受损脑组织中神经纤维的修复和再生方面具有特殊的作用。na通过酰胺键与鞘氨醇结合形成神经鞘脂，主要存在于脑组织的白质中，构成神经纤维的髓鞘。na在大脑的发育和维持、神经细胞的生物合成和改善方面起着至关重要的作用。

2、由于na具有巨大的市场和商业价值，发达国家在过去几十年通过捕获大量鲨鱼获得na，但国际组织已禁止捕鲨；以顺-13-二十二碳烯基甲酯为前体通过化学可以合成na，然而产率较低且副产物较多。na也存在于一些野生植物的种子油中。但漫长的生长周期、极其有限的分布和低且不稳定的种子产量阻碍了从天然植物源中提取na。例如在中国，na的产业化主要集中于元宝枫籽油的开发，然而其na含量较低，仅为6％左右，且只能在北方生长，8～10年才能成熟。因此，利用合成生物学的方法在油料作物中构建高效的神经酸合成路径是未来实现大规模生产的有效途径。

3、基因工程策略可以突破以上瓶颈并培育传统育种方法所难以获得的具有优良性状且理想na含量的新品种。通过基因工程生产高含量na的微生物、微藻和植物为na的营养和药理学应用提供了一种合适的方法，其巨大潜力引起了广泛关注。以微生物为底盘合成na也具有可扩展性，但主要受到大型生物发酵设施资本支出的限制，花费线性增长。以植物为底盘合成na的特点是：一旦建立成熟体系，通过标准的农业种植流程即可产生大量的目标产品，前期成本大后期花费小。因此植物基因工程具有特定的优势，一旦在植物中通过基因工程建立出成熟的生产na的系统，量产只需要更多种植面积即可。但是目前关于如何构建植物生化工厂的技术还不成熟，即便能够构建得到植物生化工厂，其表达的na含量也较低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种多基因叠加方法在油菜中合成神经酸的应用，以期提高作物的营养品质或创建植物生化工厂来生产na用于营养、制药和化学工业。

2、本发明提供了一种多基因共表达的植物载体，所述植物载体包括pbwa(v)bii的初始骨架和若干个外源基因表达盒；

3、每个外源基因表达盒中的外源基因均以种子特异表达启动子启动。

4、优选的，所述若干个外源基因表达盒位于所述植物载体一个独立的t-dna区内，所述外源基因表达盒内包含的外源基因均为神经酸和油脂的合成与组装相关基因。

5、优选的，所述神经酸和油脂的合成与组装相关基因，包括3-酮脂酰-coa合酶基因、溶血磷脂酸酰基转移酶基因和二酰甘油酰基转移酶基因。

6、优选的，所述3-酮脂酰-coa合酶基因包括bnfae1和/或cgkcs；所述溶血磷脂酸酰基转移酶基因包括slc1-1和/或ldlpaat；所述二酰甘油酰基转移酶基因包括dgat1。

7、本发明还提供了一种诱导表达神经酸和油脂的三基因共表达植物载体，所述三基因共表达植物载体基于pbwa(v)bii的初始骨架和处于t-dna区的3个外源基因表达盒构成；

8、所述3个外源基因表达盒包括1个3-酮脂酰-coa合酶基因表达盒、1个溶血磷脂酸酰基转移酶基因表达盒和1个二酰甘油酰基转移酶基因表达盒。

9、优选的，所述3-酮脂酰-coa合酶基因表达盒包括napin启动子、cgkcs基因和napin终止子；

10、所述溶血磷脂酸酰基转移酶基因表达盒包括napin启动子、slc1-1基因和napin终止子；

11、所述二酰甘油酰基转移酶基因表达盒包括napin启动子、dgat1基因和napin终止子。

12、本发明还提供了一种诱导表达神经酸和油脂的五基因共表达植物载体，所述五基因共表达植物载体基于pbwa(v)bii的初始骨架和处于t-dna区的5个外源基因表达盒构成；

13、所述5个外源基因表达盒包括2个3-酮脂酰-coa合酶基因表达盒、2个溶血磷脂酸酰基转移酶基因表达盒和1个二酰甘油酰基转移酶基因表达盒。

14、优选的，所述2个3-酮脂酰-coa合酶基因表达盒中的3-酮脂酰-coa合酶基因分别为cgkcs基因和bnfae1基因；

15、所述2个溶血磷脂酸酰基转移酶基因表达盒中的溶血磷脂酸酰基转移酶基因分别为slc1-1基因和ldlpaat基因；

16、所述二酰甘油酰基转移酶基因表达盒中的二酰甘油酰基转移酶基因为dgat1基因。

17、本发明还提供了上述植物载体或上述三基因共表达植物载体或上述五基因共表达植物载体在构建高表达神经酸和油脂的植物种质中的应用。

18、优选的，所述植物种质包括油菜种质。

19、有益效果：本发明提供了一种多基因共表达的植物载体，包括pbwa(v)bii的初始骨架、一个bar基因表达盒和若干个外源基因表达盒。本发明还提供了两种可应用于遗传转化的植物载体：三基因共表达植物载体和五基因共表达植物载体，其中三基因共表达植物载体包含一个3-酮脂酰-coa合酶基因表达盒，一个溶血磷脂酸酰基转移酶基因表达盒和一个二酰甘油酰基转移酶基因表达盒；五基因共表达植物载体包含两个3-酮脂酰-coa合酶基因表达盒，两个溶血磷脂酸酰基转移酶基因表达盒和一个二酰甘油酰基转移酶基因表达盒。本发明将上述三基因共表达植物载体转入油菜后，通过多基因共表达的方式在油菜种子中合成高含量的神经酸，na比例可达到45.8％，且具有较高种子油含量(47％)和较高的田间种子产量(175kg/亩)，其预计的na产量为215g/kg(47％*45.8％*1000)，取得了重大突破性进展，不仅超越油菜中通过基因工程技术生产na产量的最高水平，也超越了目前最好的其他物种通过基因工程技术生产na产量的最高水平。利用本发明所述的植物载体，实现na在油料作物中的高效合成，获得富含na的种子油，提高食用油的附加值，服务于营养学和药物学方面的应用，实现我国现代农业由“增产导向”向“提质导向”的转变。

技术特征：

1.一种多基因共表达的植物载体，其特征在于，所述植物载体包括pbwa(v)bii的初始骨架和若干个外源基因表达盒；

2.根据权利要求1所述植物载体，其特征在于，所述若干个外源基因表达盒位于所述植物载体一个独立的t-dna区内，且所述外源基因表达盒内包含的外源基因均为神经酸和油脂的合成与组装相关基因。

3.根据权利要求2所述植物载体，其特征在于，所述神经酸和油脂的合成与组装相关基因，包括3-酮脂酰-coa合酶基因、溶血磷脂酸酰基转移酶基因和二酰甘油酰基转移酶基因。

4.根据权利要求3所述植物载体，其特征在于，所述3-酮脂酰-coa合酶基因包括bnfae1和/或cgkcs；所述溶血磷脂酸酰基转移酶基因包括slc1-1和/或ldlpaat；所述二酰甘油酰基转移酶基因包括dgat1。

5.一种诱导表达神经酸和油脂的三基因共表达植物载体，其特征在于，所述三基因共表达植物载体基于pbwa(v)bii的初始骨架和处于t-dna区的3个外源基因表达盒构成；

6.根据权利要求5所述三基因共表达植物载体，其特征在于，所述3-酮脂酰-coa合酶基因表达盒包括napin启动子、cgkcs基因和napin终止子；

7.一种诱导表达神经酸和油脂的五基因共表达植物载体，其特征在于，所述五基因共表达植物载体基于pbwa(v)bii的初始骨架和处于t-dna区的5个外源基因表达盒构成；

8.根据权利要求7所述五基因共表达植物载体，其特征在于，所述2个3-酮脂酰-coa合酶基因表达盒中的3-酮脂酰-coa合酶基因分别为cgkcs基因和bnfae1基因；

9.权利要求1～4任一项所述植物载体或权利要求5或6所述三基因共表达植物载体或权利要求7或8所述五基因共表达植物载体在构建高表达神经酸和油脂的植物种质中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述植物种质包括油菜种质。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多基因叠加方法在油菜中合成神经酸的应用。本发明提供了一种多基因共表达的植物载体，包括pBWA(V)BII的初始骨架和若干个外源基因表达盒。本发明还提供了两种可应用于遗传转化的植物载体：三基因共表达植物载体和五基因共表达植物载体。本发明将上述三基因共表达植物载体和五基因共表达植物载体分别转入油菜后，通过多基因共表达的方式在油菜种子中合成高含量的神经酸，NA比例可显著提高，且具有较高种子油含量和较高的田间种子产量。利用本发明所述的植物载体，实现NA在油料作物中的高效合成，获得富含NA的种子油，提高食用油的附加值。

技术研发人员：刘芳,王盼娣,吴刚,熊小娟
受保护的技术使用者：中国农业科学院油料作物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11