本发明属于漆酶固定化，具体涉及一种高比表面积聚离子液体材料的制备及固定化漆酶的方法。
背景技术：
1、漆酶(lac,ec 1.10.3.2)属于蓝铜酶家族，广泛存在于真菌、植物、细菌和昆虫中，具有广泛的底物特异性和生态友好性，可在不同的工业领域发挥不同的作用。然而，漆酶存在容易失活、稳定性差、重复利用率低、成本高等缺陷，这在一定程度上限制了漆酶的工程化应用。
2、载体材料在溶液中形成的微环境会影响固定化酶的性能，它可能影响载体的物理性质和化学结构、酶与其载体的相互作用性质、结合位置以及键的数目。专利cn114045280a中公开了一种以磁性单宁酸-壳聚糖为载体共价固定化酶的方法，考察了不同ph、温度条件下酶的活性，并且在循环7次后仍能保留79％的相对酶活力。专利cn113980921 a中合成了一种离子液体修饰的复合材料，酶载量达到120mg/g，并将该固定化酶应用于酚类物质的吸附降解，其中，间苯二酚、2,4-二氯苯酚的降解吸附率超过90％，邻苯二酚的降解吸附率接近80％。载体有多种类型，目前载体研究主要集中在天然高分子载体、无机载体、金属有机框架载体合成聚合物载体等。
3、在过去的几十年里，以il为基础的生物催化技术已经得到了广泛的研究。ils在酶催化中发挥着越来越重要的作用，被认为是挥发性有机溶剂的“绿色”替代品。聚离子液体是一种新型的高分子电解质，在重复单元中含有il结构，其阴离子或阳离子被限制在大分子的基质中。pil有广泛的应用，包括热响应材料、碳材料、能量收集/生成，以及几种生物应用。然而，关于pil材料在载酶方面的应用报道很少，这可能是因为pil的制备方法如自由基聚合一般会导致产品孔隙分布不规则或比表面积低，不利于载酶。为了提高聚合物的比表面积，已有提高交联密度或引入多孔材料的研究，但事实上，制备具有高比表面积的聚合物仍然是一个挑战。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种基于氨基功能化聚合离子液体微球的制备方法，所述聚合离子液体材料用于漆酶的固定化，通过限域聚合提高载体比表面积，改善固定化漆酶微环境，实现了漆酶的高固定化、催化活性及稳定性。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
3、氨基功能化聚合离子液体载体的制备，包括如下步骤：
4、(1)离子液体单体的制备
5、在氮气保护下，将一定量的氨基类化合物单体溶解于无水乙腈中，搅拌、加热。n-乙烯基咪唑溶于无水乙腈(30.0ml)中，逐滴加到氨基类化合物溶液中。回流，除去溶剂，用有机溶剂洗涤产物。将溶剂在真空下蒸发后，得到离子液体单体ilm。
6、(2)氨基功能化聚离子液体微球的制备
7、采用限域聚合制备pil-nh2微球。首先，通过悬浮聚合得到形状相对规则的聚二乙烯基苯微球。待微球在适当有机溶剂中充分膨胀后，加入ilm、引发剂及溶剂进行二次聚合，得到pil(2)-nh2。
8、(3)漆酶的固定化
9、氨基功能化聚合离子液体微球pil-nh2通过戊二醛(ga)共价结合固定化漆酶(lac)。将漆酶溶解于ph＝3.0-7.0的缓冲液中(0.1mol/l)。加入活化的pil-nh2材料在常温下孵育，分离上清液(用于固定化酶吸附量的测定)，沉淀用蒸馏水洗涤3次，用ph＝3.0的缓冲液洗涤1次，真空干燥后置于0-4℃保存。
10、所述步骤(1)中，氨基类单体可以是溴乙胺氢溴酸盐、溴丙胺氢溴酸盐及溴丁胺氢溴酸盐，且加热温度在30-60℃之间，回流温度在40-80℃之间；
11、所述步骤(1)中，有机溶剂包括乙醇、甲醇、四氢呋喃、丙酮、乙醚、二氯甲烷中的一种或多种；
12、所述步骤(1)中，氨基类化合物与乙烯基咪唑用量的摩尔比在1:(0.8～2)之间，优选 1：(1～1.5)；
13、所述步骤(2)中，聚二乙烯基苯微球聚合温度为40-80℃之间，搅拌速率在120 -350r/min 之间，致孔剂为正己烷、正庚烷、液体石蜡、甲苯中的一种或多种，与单体用量的质量比为1：(0.5～5)，优选1：(1～3)；
14、所述步骤(2)中，溶胀所需溶剂为甲苯、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮中的一种或多种；
15、所述步骤(2)中，聚二乙烯基苯和ilm的摩尔比为10：(0.5～5)，优选10：(1～3)；
16、所述步骤(2)中，限域聚合温度控制在30-80℃之间，搅拌速率在100-400r/min之间，反应时间在12-24h之间；
17、所述步骤(3)中，交联剂戊二醛水溶液浓度为0.2-2％ωt，优选0.5-1％ωt，交联时间在1-6h之间，优选3-5h，交联温度在20-50℃之间，优选25-40℃；
18、所述步骤(3)中，载体pil-nh2用量为10-100mg，优选10-40mg，酶浓度为0.5mg/ml-5mg/ml，优选1-3mg/ml。
1.一种高比表面积聚离子液体载体的制备方法，其特征在于，步骤一、氮气保护下，将n-乙烯基咪唑与氨基类化合物分别溶解于无水乙腈中，磁力搅拌加热，n-乙烯基咪唑逐滴加到烧瓶中，通过季胺化反应得到离子液体单体(ilm)；步骤二、通过悬浮聚合得到形状较为规整的聚二乙烯基苯(pdvb)微球；步骤三、将第二单体ilm、引发剂溶于合适溶剂中，让pdvb在其中充分溶胀，加热，第二单体与pdvb的悬挂双键进行限域聚合。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤一中离子液体单体采用氨基官能化。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤三中溶胀溶剂为甲苯与dmf的混合液，混合比例为甲苯：dmf＝(2～5)：1，聚合温度为40-80℃。
4.一种高比表面积聚离子液体载体，其特征在于，比表面积达到300cm3/g以上。
5.如权利要求4所述的一种高比表面积聚离子液体载体，其特征在于，(1)引入的第二单体为离子液体,(2)离子液体采用氨基官能化，(3)聚二乙烯基苯(pdvb)微球为限域聚合的基本单元。
6.如权利要求4所述的一种高比表面积聚离子液体载体，其特征在于，按照权利要求1-3的任一的制备方法制成。
7.一种高比表面积聚离子液体载体固定化漆酶的方法，其特征在于，步骤如下：
8.如权利要求7所述的一种高比表面积聚离子液体载体固定化漆酶的方法，其特征在于缓冲溶液为ph2-8的柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸-磷酸氢二钠、醋酸-醋酸钠溶液中的一种。
9.如权利要求7所述的一种高比表面积聚离子液体载体固定化漆酶的方法，其特征在于交联剂为质量分数0.5％-5％wt的戊二醛水溶液。
10.如权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，漆酶交联时间为0.5-8h，交联温度为室温，漆酶浓度为1mg/ml。