超多重数字PCR流式快速阅读装置及方法与流程

本发明涉及数字pcr，具体是一种超多重数字pcr流式快速阅读装置及方法。

背景技术：

1、pcr技术即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，是以dna双链复制原理为基础，对特定核酸样本进行体外扩增的生物技术。通过pcr扩增可以实现微量核酸样本迅速拷贝至几百万倍，在后续医疗筛查诊断、生命科学基础研究、法医分析鉴定及食品卫生等方面具有广泛应用。

2、数字pcr技术是将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元中，使每个单元中尽可能含有≤1个模板分子，并在此基础上进行扩增、检测和分布统计，可实现靶标分子的绝对计数。在实际靶标分子检测中，通过不同的染料探针标记不同靶标分子可以实现多靶标检测，可检测数量记为m，也可以通过使用同一染料但不同浓度的探针标记实现不同靶标分子，进行分阶检测，数量记为n，理论上通过m种染料探针和每种探针n种浓度的组合标记，可实现m*n种标记组合。这种组合方式大大提高了靶标分子的探测通量，同时有效降低了对样本的需求量。

3、以现有的数字pcr阅读技术可通过筛选器件型号和滤波片实现不同染料探针的成像检测，但由于本身成像灰度分辨率的问题使得其难以实现同种染料探针的多种浓度分阶使用；另一种流式阅读方法同样需匹配不同的激发光源和滤波片来实现多色阅读，但现有设备在微滴流动过程中可实现的荧光探测数量有限，且存在阅读速度慢检测时间过长等问题。

4、流式微滴阅读是一种对呈直线快速流动状态中的微滴进行逐个荧光激发探测的技术，通过分析光电倍增管采集到的信号可得出微滴携带靶标分子的浓度情况，具有检测速度快、采集数据量大、分析全面纯度高等特点。

5、基于流式阅读的检测原理，对pcr体系中的微滴进行不同浓度染料探针多靶标分子的结合，当微滴单行排列，依次流过激光阅读区域时，被激光激发的荧光光子通过光电倍增管(简称pmt)被收集，其中不同浓度的染料探针所激发的荧光反映在pmt信号中会呈现强度的高低分布，以此可得出不同靶标分子的含量信息。

6、除染料探针的浓度分阶外，也可使用不同种类的染料探针实现不同靶标分子的标记，如fam染料和rox染料，两者需使用不同波长的激发源进行荧光激发，同时在探测端需匹配相应的带宽滤波片实现二者的探测区分，最终通过分析两个pmt信号采集的结果进行靶标分子的数据分析。

7、现有的流式微滴阅读结果一方面受限于试剂端影响，可携带染料种类有限；另一方面需匹配多种激光源、滤波片和pmt等器件结构，结构复杂难以实现多种靶标分子的同时检测。

技术实现思路

1、本发明为了解决现有技术的问题，提供了一种超多重数字pcr流式快速阅读装置及方法，避免了复杂的光路分光结构，有效缩小了整体装置体积，实现快速阅读。

2、本发明提供了一种超多重数字pcr流式快速阅读装置，包括光源设备、激发端滤波片、折射设备、显微镜头、检测流道池、接收端滤波片和光电倍增管pmt，光源设备发出的激发光通过激发端滤波片和显微镜头聚焦射入检测流道池，检测流道池产生的荧光信号返回显微镜头汇聚后通过折射设备折射，再通过接收端滤波片被光电倍增管pmt接收；所述激发端滤波片和接收端滤波片同步转动，激发端滤波片和接收端滤波片上沿圆周划分为具有不同滤波参数的若干区域。

3、进一步改进，所述激发端滤波片和接收端滤波片上沿圆周等距划分为n个具有不同滤波参数的区域。

4、进一步改进，所述激发端滤波片和接收端滤波片上沿圆周等距划分为m个区域，每个区域内沿圆周等距划分为n个具有不同滤波参数的区域。通过该方式，相比于上述直接进行n个区域的划分，可以在相同阅读速度的情况下，降低对于电机转速的要求。

5、进一步改进，所述折射设备为中心孔反射镜，激发光穿过中心孔反射镜的中心孔进入显微镜头，反射回的荧光信号通过中心孔反射镜的镜面折射进入接收端滤波片。

6、进一步改进，所述光源设备包括依次连接的激发光源和准直透镜。

7、进一步改进，所述激发光源为多波长半导体激光合束，包括若干不同波长的半导体激光器，每个半导体激光器设置有与其波长对应的带通滤波片，若干半导体激光器的光束通过带通滤波片合束成激发光。

8、本发明还提供了一种超多重数字pcr流式快速阅读方法，包括以下步骤：

9、1)激发光通过激发端滤波片后聚焦摄入检测流道池，产生的光波段对应待测微滴中某一染料探针的激发波段产生荧光信号，荧光信号通过接收端滤波片中对应波长的区域后进入光电倍增管pmt，实现对检测流道池中一微滴某一靶标分子的探测。所述激发光源为不同波长半导体激光器合束或白光led与带宽滤波片的组合。

10、2)在激发端滤波片和接收端滤波片上沿圆周划分为具有不同滤波参数的若干区域，激发端滤波片转盘、接收端滤波片转盘与pmt信号采集通过时钟信号驱动进行同步，旋转激发端滤波片和接收端滤波片实现对一微滴不同靶标分子的探测。

11、3)检测流道池中的微滴进行流动，实现对样品整体不同靶标分子的探测。

12、本发明有益效果在于：

13、1、采用转盘式结构设计，将不同参数滤波片集中在同一转盘上，避免了复杂的光路分光结构，有效缩小了整体装置体积。

14、2、通过扩大转盘直径，提高电机转速，可有效提高转盘圆周速度，即提高光波段的过滤速度，实现快速阅读。

15、3、通过增加区域划分的方式，可以在相同阅读速度的情况下，降低对于电机转速的要求。

16、4、使用时钟同步信号触发转盘控制和pmt采集分时，实现激发光、发射光、信号采集的同步输出，可有效实现信号采集的准确度，便于后期数据分析及修正。

技术特征：

1.一种超多重数字pcr流式快速阅读装置，其特征在于：包括光源设备、激发端滤波片、折射设备、显微镜头、检测流道池、接收端滤波片和光电倍增管pmt，光源设备发出的激发光通过激发端滤波片和显微镜头聚焦射入检测流道池，检测流道池产生的荧光信号返回显微镜头汇聚后通过折射设备折射，再通过接收端滤波片被光电倍增管pmt接收；所述激发端滤波片和接收端滤波片同步转动，激发端滤波片和接收端滤波片上沿圆周划分为具有不同滤波参数的若干区域。

2.根据权利要求1所述的超多重数字pcr流式快速阅读装置，其特征在于：所述激发端滤波片和接收端滤波片上沿圆周等距划分为n个具有不同滤波参数的区域。

3.根据权利要求1所述的超多重数字pcr流式快速阅读装置，其特征在于：所述激发端滤波片和接收端滤波片上沿圆周等距划分为m个区域，每个区域内沿圆周等距划分为n个具有不同滤波参数的区域。

4.根据权利要求1所述的超多重数字pcr流式快速阅读装置，其特征在于：所述折射设备为中心孔反射镜，激发光穿过中心孔反射镜的中心孔进入显微镜头，反射回的荧光信号通过中心孔反射镜的镜面折射进入接收端滤波片。

5.根据权利要求1所述的超多重数字pcr流式快速阅读装置，其特征在于：所述光源设备包括依次连接的激发光源和准直透镜。

6.根据权利要求5所述的超多重数字pcr流式快速阅读装置，其特征在于：所述激发光源为多波长半导体激光合束，包括若干不同波长的半导体激光器，每个半导体激光器设置有与其波长对应的带通滤波片，若干半导体激光器的光束通过带通滤波片合束成激发光。

7.一种超多重数字pcr流式快速阅读方法，其特征在于：通过流式阅读方法实现对检测流道池中一微滴某一靶标分子的探测；在激发端滤波片和接收端滤波片上沿圆周划分为具有不同滤波参数的若干区域，同步旋转激发端滤波片和接收端滤波片实现对一微滴不同靶标分子的探测；检测流道池中的微滴进行流动，实现对样品整体不同靶标分子的探测。

8.根据权利要求7所述的超多重数字pcr流式快速阅读方法，其特征在于：所述流式阅读方法具体为，激发光通过激发端滤波片后聚焦摄入检测流道池，产生的光波段对应待测微滴中某一染料探针的激发波段产生荧光信号，荧光信号通过接收端滤波片中对应波长的区域后进入光电倍增管pmt。

9.根据权利要求7所述的超多重数字pcr流式快速阅读方法，其特征在于：所述激发端滤波片转盘、接收端滤波片转盘与pmt信号采集通过时钟信号驱动进行同步。

10.根据权利要求8所述的超多重数字pcr流式快速阅读方法，其特征在于：所述激发光源为不同波长半导体激光器合束或白光led与带宽滤波片的组合。

技术总结
本发明提供了一种超多重数字PCR流式快速阅读装置及方法，装置包括光源设备、激发端滤波片、折射设备、显微镜头、检测流道池、接收端滤波片和光电倍增管PMT，所述激发端滤波片和接收端滤波片同步转动，激发端滤波片和接收端滤波片上沿圆周划分为具有不同滤波参数的若干区域。光源设备发出的激发光通过激发端滤波片和显微镜头聚焦射入检测流道池，检测流道池产生的荧光信号返回显微镜头汇聚后通过折射设备折射，再通过接收端滤波片被光电倍增管PMT接收。本发明避免了复杂的光路分光结构，有效缩小了整体装置体积，实现快速阅读。

技术研发人员：尚午,张毅良,于淑慧,王正道,尚国峰,程洪雨
受保护的技术使用者：南京普济生物有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12