靶向Rdh12基因的sgRNA及食蟹猴Rdh12基因敲除的方法

本发明属于生物，涉及靶向rdh12基因的sgrna及食蟹猴rdh12基因敲除的方法。

背景技术：

1、视黄醇脱氢酶12(rdh12)位于人类染色体14q24.1处，由9个外显子组成。rdh12与early-onset severe retinal dystrophy(eosrd)早发性严重视网膜营养不良有关，多为leber先天性黑朦13型(lca14)。rdh12在眼中只位于视杆细胞和视锥细胞内节，属于利用nadph还原多种底物的酶家族，包括11-cisretinaldehyde(11-顺视黄醛)和all-transretinaldehyde.(全反视黄醛)。双等位基因rdh12突变是早发性视网膜营养不良的常见原因，也是视锥-视杆细胞营养不良的罕见原因。

2、已知rdh12中的突变与leber先天性黑病(lca)和常染色体显性遗传性视网膜色素变性有关。lca其特征是在成年早期视觉功能逐渐下降，视网膜电图无视杆和视锥反应，这是一种进行性疾病，其特征为可变色素性视网膜病，伴有视乳头周围水肿、视网膜色素上皮萎缩和明显的中央黄斑病变，包括色素性黄斑病变、黄色黄斑沉积和黄斑凹陷，导致成年后严重的视力障碍和失明。rdh12-ird引起早发的全视网膜疾病，伴有严重的中央视网膜异常，以及相对轻的视杆光感受器功能障碍相关，这种表现与早发的视杆营养不良相一致。严重异常的pos及在中心周围和乳头周围视网膜检测到onl提示这些区域可能成为基因治疗的靶点。

3、目前，关于视网膜功能及结构的研究主要集中在啮齿动物模型上，对灵长类视网膜模型研究较少。选用食蟹猴作为眼科模型，开展相关研究相比以往在啮齿类的研究更具有说服力，科学性。哺乳动物出生后不同年龄阶段视网膜内层神经元如何改变尚无详细报道，且对rdh12视网膜病变形态学的研究相对较少。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术中关于灵长类视网膜模型的不足，本申请提供一种靶向rdh12基因的sgrna，并进行相关的食蟹猴rdh12基因敲除，以此构建相关模型。本申请为rdh12视网膜病变造模、早期诊断、干预、阻断及治疗rdh12视网膜病变提供新思路。

2、本发明的另一目的在于提供一种食蟹猴rdh12基因敲除的方法，该方法为食蟹猴胚胎上的基因敲除方法，该基因敲除方法敲除食蟹猴rdh12基因，进而有可能为制造非人灵长类肿瘤动物模型提供新的有效方法。

3、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

4、一种敲除食蟹猴rdh12基因的sgrna，为sgrna3-1或sgrna5，其核苷酸序列如下所示：

5、rdh12 sgrna 3-1：5'-tgctgccagtgaaatccgag(tgg)-3'；

6、rdh12 sgrna 5-3：5'-ggtggttaacgtgtcctcgg(tgg)-3'；

7、其中，括号内为pam位点ngg，sgrna识别位点。

8、本发明还提供所述靶向敲除rdh12基因的sgrna的应用，为1)至3)中任一种：

9、1)在rdh12基因敲除领域中的应用；

10、2)在制备视网膜变性动物模型中的应用；

11、3)在筛选视网膜变性动物模型中的应用。

12、本发明还提供一种食蟹猴rdh12基因敲除的方法，包括如下步骤：体外合成所述的靶向敲除rdh12基因的sgrna，与cas9 mrna混合注射入食蟹猴胚胎，得到rdh12基因敲除的食蟹猴胚胎。

13、作为本发明所述的食蟹猴rdh12基因敲除的方法，其中的一种优选实施方式，所述体外合成靶向敲除rdh12基因的sgrna的具体操作步骤如下：

14、(1)根据权利要求1所述的靶向敲除rdh12基因的sgrna，设计合成引物x，然后以px459载体为模板进行pcr扩增，得到转录dna模板；

15、(2)将步骤(1)制得的转录dna模板进行体外转录，得到所述sgrna。

16、优选的，步骤(1)所述的引物的核苷酸序列如下所示：

17、rdh12 grna 3-1f：5’-taatacgactcactatagtgctgccagtgaaatccgaggttttagagctagaaatagc-3’；

18、grna pcr r：5’-agcaccgactcggtgccactt-3’；

19、rdh12 grna 5-3f：5’-taatacgactcactatagggtggttaacgtgtcctcgggttttagagctagaaatagc-3’；

20、grna pcr r：5’-agcaccgactcggtgccactt-3’。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

22、(1)本发明针对食蟹猴rdh12基因提供了2个高效的敲除靶点。

23、(2)本发明经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴胚胎上实现rdh12基因的敲除，为建立非人灵长类艾滋病动物模型奠定了坚实基础。

技术特征：

1.一种靶向敲除rdh12基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna为sgrna3-1和sgrna5-3，其核苷酸序列如下所示：

2.权利要求1所述靶向敲除rdh12基因的sgrna的应用，为1)至3)中任一种：

3.一种食蟹猴rdh12基因敲除的方法，其特征在于，包含如下步骤：

4.根据权利要求3所述的食蟹猴rdh12基因敲除的方法，其特征在于，体外合成靶向敲除rdh12基因的sgrna的操作步骤为：

5.根据权利要求4所述的食蟹猴rdh12基因敲除的方法，其特征在于，所述的引物的核苷酸序列如下所示：

技术总结
本发明属于生物技术领域，涉及靶向Rdh12基因的sgRNA及其应用，针对食蟹猴Rdh12基因的mRNA确立靶序列并合成相应的sgRNA，然后构建敲除载体，将sgRNA和Cas9mRNA混合注射入食蟹猴胚胎，得到Rdh12基因敲除的食蟹猴胚胎。本发明经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴胚胎上实现Rdh12基因的基因敲除，为建立非人灵长类肿瘤动物模型提供新的有效方法。

技术研发人员：杨世华,张郭乐,郭永龙
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13