一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用，属于基因工程。

背景技术：

1、纳豆激酶(nattokinase，nk，ec 3.4.21.62)是在纳豆发酵过程中，其中的纳豆芽孢杆菌利用黄豆中的营养，发酵产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。该酶因其高效安全的溶栓能力，在心脑血管疾病领域掀起研究热潮。在此之前，常用临床溶栓药物主要有链激酶、尿激酶和纤维酶原激活因子等，但此类药物存在成本高昂、安全性低且药效短等弊端，不宜进行规模化生产。纳豆激酶无论在成本还是安全性方面均有显著优势，特别是它可直接作用于纤维蛋白，大大提高溶栓效率，使其与上述溶栓药物相比具有独特优越性和广阔开发前景。此外，纳豆激酶被证实在血压血脂调节方面有显著效果，且在抗疲劳、抗菌、抗氧化、调节内分泌等方面有研究价值，是一种高潜力的膳食补充剂，在食品工业上具有较大开发意义。

2、nakamura等人(1992)通过当时较为精确的鸟枪法首次克隆了纳豆激酶基因，并对其一级结构进行深入解析，测定了该酶的全基因序列，从此科研工作者开始从分子水平，利用基因工程手段对纳豆激酶基因或其宿主进行改造和优化。刘北域等人从纳豆芽孢杆菌中钓取纳豆激酶原基因，于e.coli jf1125中构建温度诱导型表达质粒pesx-1，实现了纳豆激酶在大肠杆菌中的有效表达。除此之外，其余宿主，例如毕赤酵母(pichia pastoris)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)以及草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)等均实现了纳豆激酶的有效表达。

3、为了提高纳豆激酶外源表达水平，研究者在表达元件优化上也开展了多项工作。例如wu等人尝试用启动子(paprv)启动纳豆激酶的转录表达，并通过点突变改造其核心-35和-10序列，发现-10区的突变改造使酶活提高了1.36倍。在分子水平上改造原始基因及其关键元件，可能显著提高纳豆激酶酶活力。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于提供一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用，通过对信号肽进行改造，筛选改造后的信号肽，优化纳豆激酶蛋白表达框，构建枯草芽孢杆菌纳豆激酶高表达菌株，提高蛋白酶活力。

2、本发明是通过如下技术方案来实现的：

3、一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌为在枯草芽孢杆菌wb800中转入重组质粒获得，所述重组质粒包括如seq id n0.2所示的信号肽的基因和如seq id n0.7所示的来源于枯草芽孢杆菌n2的纳豆激酶基因，所述信号肽的基因融合到所述纳豆激酶基因的n端。

4、本发明还提供所述重组基因工程菌在生产纳豆激酶中的应用。

5、本发明与现有技术相比的有益效果：

6、1、本发明通过在核苷酸序列为seq id n0.6，即原纳豆激酶信号肽基因的基础上，构建各种信号肽与纳豆激酶编码基因相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，筛选出能提高纳豆激酶分泌的信号肽。同时构建该信号肽与纳豆激酶酶原编码基因相结合的表达载体，提高了纳豆激酶酶原的分泌表达。

7、2、本发明提供了一种核苷酸片段，具有很强的分泌表达活性的信号肽，能实现纳豆激酶的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达纳豆激酶基因提供了有效的元件。

8、3、本发明通过融合信号肽，可以使纳豆激酶分泌量增加，酶活得到进一步提高。

9、4、本发明通过融合信号肽，提高了纳豆激酶酶原分泌表达。

技术特征：

1.一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌为在枯草芽孢杆菌wb800中转入重组质粒获得，所述重组质粒包括如seq id n0.2所示的信号肽的基因和如seq id n0.7所示的来源于枯草芽孢杆菌n2的纳豆激酶基因，所述信号肽的基因融合到所述纳豆激酶基因的n端。

2.权利要求1所述重组基因工程菌在生产纳豆激酶中的应用。

技术总结
本发明涉及一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。通过对信号肽进行改造，筛选改造后的信号肽，获得1个信号肽，序列如SEQ ID N0.2所示。构建枯草芽孢杆菌纳豆激酶高表达菌株，能够提高蛋白酶活力。

技术研发人员：牟海津,辜自强,宁晨,田明
受保护的技术使用者：威海迪普森生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/11/11