一种检测曲霉的引物探针组合、试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术，尤其涉及一种检测曲霉的引物探针组合、试剂盒。

背景技术：

1、曲霉是引起感染病最多的霉菌菌种，有250多种广布自然界，其中有40多种为致病菌。曲霉可寄生于正常人的皮肤和上呼吸道，为条件致病菌。一般正常人对曲霉菌有一定的抵抗力，不引起疾病。曲霉菌病大多为继发性，当机体抵抗力降低时，病原菌可经皮肤黏膜损伤处或吸入呼吸道，进而进入血液循环到其他组织或器官而致病。免疫抑制、恶性肿瘤、器官移植(常见于肺移植)患者为曲霉感染的主要患者人群。曲霉的主要感染部位为肺部，肺部感染分三大类：过敏性支气管感染、慢性感染、侵袭性感染。主要感染肺部的曲霉菌有烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉等。烟曲霉病占所有曲霉病的90％以上。

2、线粒体是真核生物细胞内一个重要的细胞器，因为有氧呼吸在线粒体内进行，线粒体又被称为真核细胞的能量供应站。作为半自主细胞器，线粒体内拥有一定量的独立于细胞核的遗传体系，称为线粒体基因。

3、因为真菌培养比较困难且生长缓慢，目前检测曲霉感染的主要方法为gm检测，其缺点是受某些食物或药物的影响可致假阳性结果。目前也有利用qpcr技术检测曲霉的报道，但是其检测靶标为烟曲霉一个菌种或烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉三个菌种的基因组dna(18s rna、its区或28s rna)，目前还没有利选用线体基因作为检测靶标用于检测曲霉的报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种检测曲霉的引物探针组合、试剂盒。该引物探针组合可快速实现烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的三种常见曲霉的联合检测，灵敏度高、特异性好、重复性高。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种检测曲霉的引物探针组合，包括：

4、检测烟曲霉的引物、探针：seq id no:1～2所示核苷酸序列的引物和seq id no:3所示核苷酸序列的探针；

5、检测黑曲霉的引物、探针：seq id no:4～5所示核苷酸序列的引物和seq id no:6所示核苷酸序列的探针；和/或

6、检测黄曲霉的引物、探针：seq id no:7～8所示核苷酸序列的引物和seq id no:9所示核苷酸序列的探针。

7、本发明针对烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的线粒体基因的特异性保守区序列设计引物和探针，其中，烟曲霉线粒体基因的特异性保守区域的核苷酸序列如seq id no:13所示；黑曲霉线粒体基因的特异性保守区域的核苷酸序列如seq id no:14所示；黄曲霉线粒体基因的特异性保守区域的核苷酸序列如seq id no:15所示。

8、本发明中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。其中：

9、seq id no:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团fam，3’端标记有荧光淬灭基团mgb；

10、seq id no:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团rox，3’端标记有荧光淬灭基团mgb；

11、seq id no:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团cy5，3’端标记有荧光淬灭基团mgb。

12、本发明还提供了所述的引物探针组合在制备检测曲霉的试剂盒中的应用；所述曲霉包括烟曲霉、黄曲霉或黑曲霉中的至少一种。

13、本发明还提供一种检测曲霉的试剂盒，包括所述的引物探针组合。

14、本发明提供的试剂盒还包括针对seq id no.16所示的保守区域设计得到的用于检测内参基因的引物和探针：核苷酸序列如seq id no.10～11所示的引物以及核苷酸序列如seq id no.12所示的探针。

15、其中，seq id no:12所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团vic，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1。

16、本发明提供的试剂盒还包括无菌水和ddpcrmix。

17、本发明还提供一种检测曲霉的方法，以本发明所述的引物探针或试剂盒对待测样本进行检测。

18、本发明中，所述检测为pcr检测，检测的程序为：95℃5min，[98℃15s，60℃30s]×40cycles。

19、本发明中，所述待测样本包括人痰液样本、肺泡灌洗液样本、血液样本和胸腹水样本。一些实施方案中，本发明所述检测为非诊断目的的检测，例如对环境的样本或对食品进行检测，其中，所述环境中的样本包括水样或物体表面拭子。

20、本发明针对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉的线粒体基因的特定区域设计引物和探针，可快速实现烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的三种常见曲霉的联合检测，对已检测的22种菌均无交叉，具有灵敏度高、特异性好、重复性高的特点。

技术特征：

1.一种检测曲霉的引物探针组合，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，

3.权利要求1或2所述的引物探针组合在制备检测曲霉的试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述曲霉包括烟曲霉、黄曲霉或黑曲霉中的至少一种。

5.一种检测曲霉的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测内参基因的引物和探针：核苷酸序列如seq id no.10～11所示的引物以及核苷酸序列如seq id no.12所示的探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，seq id no:12所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团vic，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括无菌水和ddpcr mix。

9.非诊断目的检测曲霉的方法，其特征在于，以权利要求5～8任一项所述的试剂盒对待测样本进行检测。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括来自环境中的水样、食物样本或物体表面拭子。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测曲霉的引物探针、试剂盒。本发明针对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉的线粒体基因的特定区域设计引物和探针，可快速实现烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的三种常见曲霉的联合检测，对已检测的22种菌均无交叉，具有灵敏度高、特异性好、重复性高的特点。

技术研发人员：夏江,高学娟
受保护的技术使用者：领航基因科技（杭州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13