两株鞘氨醇单胞菌及其应用

1.本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及两株具有促生功能鞘氨醇单胞菌新种及其应用。


背景技术：

2.植物根际土壤中存在着大量的有益微生物，具有促进植物生长、增加作物产量和防治植物病害等重要作用，这些有益微生物被称为根际促生菌(pgpr)。pgpr的促生功能主要涉及三个方面，第一是通过产生铁载体、解磷、解钾和固氮等作用促进植物对营养物质的吸收；第二是通过产生生长素(iaa)、赤霉素、acc脱氨酶或细胞分裂素等调节植物生长；第三是通过分泌抗生素、胞外酶或者脂多糖等防治植物病害。pgpr可通过一种或多种机制来促进植物生长和增加农作物产量，降低化肥农药的使用量和生产成本，对促进生态农业绿色发展具有重要的意义。
3.铁元素是植物和微生物生长过程中不可或缺的重要矿物营养元素，在植物光合作用、呼吸作用及氮代谢过程中起着重要的作用。铁在生理条件下(fe
3+
)溶解度很低，而土壤中的铁以fe
3+
和不溶性氧化态为主，可溶性的fe
2+
含量很低，难以被植物和微生物吸收。农业生产中大多数植物普遍处于缺铁状态，微生物为适应低铁环境进化出了几种高亲和力铁摄取系统来解决环境中微生物可利用铁含量过低的问题，其中铁载体是微生物铁吸收的一种重要方式。
4.铁载体是由植物根际微生物分泌产生的一类低分子量物质，可以高效结合土壤环境中的铁，促使土壤中的不溶性铁转化为可以被植物利用的有效态铁，从而增强植物对环境条件的耐受能力。此外，植物根际细菌分泌的铁载体除了用来螯合铁以满足植物对铁的需求外，还可同时减少病原微生物可以利用的铁的含量，进而促进植物的生长。因此，在农业生产中可通过在植物根际接种产铁载体细菌来达到促进植物生长和增加农作物产量的目的。不断发掘多重促生机制的pgpr新资源，利用其制备微生物菌肥，对于改善土壤肥力，推动绿色农业可持续发展具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供两株种能够高效产铁载体和iaa的鞘氨醇单胞菌属的新种(sphingomonas sp.)mmsm20和mmsm24。sphingomonas sp.mmsm20于2022年6月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：gdmcc no：62519。sphingomonas sp.mmsm24于2022年6月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：gdmcc no：62520。
6.本发明的第二个目的是提供鞘氨醇单胞菌mmsm20或mmsm24在制备具有促进植物生长和/或提高植物抗逆性的生物制剂中的应用。
7.本发明的第三个目的是提供鞘氨醇单胞菌mmsm20或mmsm24在产铁载体和/或iaa
中的应用。
8.本发明的第四个目的是提供一种促进植物生长和/或提高植物抗逆性的生物制剂，其含有鞘氨醇单胞菌mmsm20和/或mmsm24作为主要活性成分。
9.优选，所述的生物制剂可以为微生物菌剂或有机生物肥料等。
10.本发明相对于现有技术具有以下优点：
11.1)本发明提供的两株鞘氨醇单胞菌新种是不同于其他植物促生菌的鞘氨醇单胞菌属的新种。
12.2)根际促生菌-鞘氨醇单胞菌mmsm20和mmsm24在r2a液体培养基中培养2d产铁载体的能力分别为68.8％和64.9％，产铁载体能力强于大多已报到的细菌。
13.3)根际促生菌鞘氨醇单胞菌mmsm20和mmsm24既可产铁载体，又能够分泌产生iaa，与已报到的植物根际促生菌相比具有双重的促生作用。因此，本发明公开的两株鞘氨醇单胞菌新种mmsm20和mmsm24可用于提高植物的抗逆性，促进植物生长，在制备植物抗逆促生微生物菌剂、有机生物肥料等方面具有广阔的应用前景。
14.sphingomonas sp.mmsm20于2022年6月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：gdmcc no：62519。
15.sphingomonas sp.mmsm24于2022年6月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：gdmcc no：62520。
附图说明
16.图1为本发明两株鞘氨醇单胞菌新种mmsm20(a)和mmsm24(b)在cpg平板上的形态。
17.图2为本发明两株鞘氨醇单胞菌新种mmsm20(a)和mmsm24(b)的细胞透射电镜观察图，标尺为5μm。
18.图3为两株鞘氨醇单胞菌新种mmsm20和mmsm24的16s rrna基因系统进化树。
19.图4为两株鞘氨醇单胞菌新种mmsm20和mmsm24的基因组组系统进化树。
20.图5为本发明两株鞘氨醇单胞菌新种mmsm20(a)和mmsm24(b)在cas平板上产生的透明圈。
21.图6为两株鞘氨醇单胞菌新种mmsm20和mmsm24产铁载体和iaa的能力分析。
具体实施方式
22.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
23.下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。
24.实施例1两株鞘氨醇单胞菌新种mmsm20和mmsm24的分离纯化
25.1、分离及筛选培养基
26.cpg琼脂培养基：细菌学蛋白胨10.0g，酸水解酪蛋白1.0g，葡萄糖5.0g(或甘油5ml)，用蒸馏水溶解定容至1l，ph 6.5-7.0，121℃湿热灭菌20min，备用。
27.2、实验步骤
28.(1)样品采集：从广东省茂名市采集常年种植番茄的土壤样品，装入采样袋中带回实验室在室温下自然风干。
29.(2)土壤梯度稀释液准备，称取10g土壤，加入到事先加有玻璃珠和90ml无菌水的灭菌三角瓶中，于30℃摇床上200rpm震荡培养30min。静置5min后取1ml上清液加入到事先装有9ml灭菌水的试管中，依次进行梯度稀释至10-2-10-7
g/ml的土壤悬浮液备用。
30.(3)细菌分离：分别取100μl稀释好的土壤菌悬液(10-2-10-7
g/ml)用一次性塑料涂布棒均匀涂布在cpg培养基平板上，每个浓度设置三个重复，涂布完成后将平板倒置放于30℃恒温培养箱中培养。隔天观察平板上菌落的生长情况，挑取产生透明圈的不同形态的菌株在cpg固体平板上划线，对菌株进行纯化，最终分离获得菌株mmsm20和mmsm24。
31.实施例2.菌株mmsm20和mmsm24的分类鉴定
32.参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠主编科学出版社)对分离菌株进行鉴定。
33.(1)表型特征：
34.将菌株mmsm20和mmsm24采用三区划线法接种于cpg培养基上，30℃培养3d后观察其菌落形态。挑取培养的菌落进行革兰氏染色并利用光学显微镜进行形态观察，制备透射电镜观察样本，采用日立的hitachi h7650透射电镜观察菌株的细胞形态。硝酸盐还原、水解明胶、吲哚产生、β-葡萄糖苷酶、精氨酸双水解酶、脲酶和葡萄糖氧化等测试采用api 20ne试剂条(法国梅里埃生物)进行。
35.菌株mmsm20和mmsm24在cpg培养基上呈乳白色，单菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，无流动性(图1)。菌株mmsm20和mmsm24革兰氏染色为阴性，透射电镜下细胞呈短杆状，无鞭毛(图2)。水解明胶，β-葡萄糖苷酶，精氨酸双水解酶和脲酶为阳性，硝酸盐还原、吲哚产生和葡萄糖氧化均为阴性(表1)。
36.表1菌株mmsm20和mmsm24的表型特征
[0037][0038][0039]
(2)系统进化分析：
[0040]
通过水煮法提取菌株mmsm20和mmsm24的dna，利用细菌的16s rdna特异性引物27f(5
′‑
agagtttgatcctggctcag-3
′
)和1492r(5
′‑
tacgacttaaccccaatcgc-3
′
)和taq酶对mmsm20和mmsm24的16s rdna基因序列进行扩增，扩增产物经电泳分析产生约1500b左右的条带，切胶回收该条带后送苏州金唯智生物科技有限公司进行sanger测序，测序得到的序
列经seqman软件拼接后获得16s rdna序列，提交至ezbioclode网站(https://www.ezbiocloud.net/)进行鉴定。采用mega 10软件构建基于16s rrna序列的neighbor joining系统发育进化树，计算模型为kimura 2-paremeter。通过sanger测序获得的菌株mmsm20和mmsm24的16s rrna基因的全长分别为1338bp和1357bp(seq id no.1和2)。序列比对发现菌株mmsm20和mmsm24与已发表的模式菌序列相似度低于物种区分的临界值98.65％，其中相似度最高的模式菌为sphingomonas dokdonensis dsm 21029
t
(97.97％和97.85％)。基于16s rrna基因序列构建的nj进化树显示，菌株mmsm20和mmsm24从属于鞘氨醇单胞菌属，且与sphingomonas dokdonensis dsm 21029
t
，sphingomonas jeddahensis g39
t
，sphingomonas mucosissima dsm 17494
t
等模式菌具有最近的亲缘关系(图3)。综上，根据16s rdna序列和形态特征结果，菌株mmsm20和mmsm24为鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)的潜在新种。
[0041]
》mmsm20(seq id no.1)
[0042]
gtcgaacgatgccttcgggcatagtggcgcacgggtgcgtaacgcgtgggaatctgcccctgggttcggaataacagcgagaaattgctgctaataccggatgatgacgaaagtccaaagatttatcgcccagggatgagcccgcgtaggattagctagttggtgaggtaagagctcaccaaggcgacgatccttagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagcaatgccgcgtgagtgatgaaggccttagggttgtaaagctcttttacccgggatgataatgacagtaccgggagaataagctccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggagctagcgttgttcggaattactgggcgtaaagcgcacgtaggcggctttgtaagttagaggtgaaagcctggagcttaactccagaattgcctttaagactgcatcgcttgaatccgggagaggtgagtggaattccgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcggaagaacaccagtggcgaaggcggctcactggaccggtattgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgataactagctgtccgggcacttggtgcttgggtggcgcagctaacgcattaagttatccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcctgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagcgtttgacatggtagggcggtttccagagatggattccttcccttcggggacctacacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtggagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcctttagttaccatcatttagttggggactctaaaggaaccgccggtgataagccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgcgctgggctacacacgtgctacaatggcaactacagtgggcagcaatcccgcgagggtgagctaatctccaaaagttgtctcagttcggattgttctctgcaactcgagagcatgaaggcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccaggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggattcacccgaaggcgttgcgctaactcgcaa。
[0043]
》mmsm24(seq id no.2)
[0044]
tggtcgcctgcctctcttgcgagttagcgcaacgccttcgggtgaatccaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcctgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgccttcatgctctcgagttgcagagaacaatccgaactgagacaacttttggagattagctcaccctcgcgggattgctgcccactgtagttgccattgtagcacgtgtgtagcccagcgcgtaagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggcttatcaccggcggttcctttagagtccccaactaaatgatggtaactaaaggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtgtgtaggtccccgaagggaaggaatccatctctggaaaccgccctaccatgtcaaacgctggtaaggttctgcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcaggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggataactta
atgcgttagctgcgccacccaagcaccaagtgcccggacagctagttatcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagcgtcaataccggtccagtgagccgccttcgccactggtgttcttccgaatatctacgaatttcacctctacactcggaattccactcacctctcccggattcaagcgatgcagtcttaaaggcaattctggagttaagctccaggctttcacctctaacttacaaagccgcctacgtgcgctttacgcccagtaattccgaacaacgctagctccctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccggagcttattctcccggtactgtcattatcatcccgggtaaaagagctttacaaccctaaggccttcatcactcacgcggcattgctggatcaggctttcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcatcctctcagaccagctaaggatcgtcgccttggtgagctcttacctcaccaactagctaatcctacgcgggctcatccctgggcgataaatctttggactttcgtcatcatccggtattagcagcaatttctcgctgttattccgaacccaagggcagattcccacgcgttacgcacccgtgcgccactatgcccgaaggcatcgttcgactgca。
[0045]
(3)比较基因组学分析：
[0046]
菌株mmsm20和mmsm24的基因组dna采用细菌基因组dna提取试剂盒(magen)进行提取，后经16s rrna基因扩增验证后由上海美吉生物科技有限公司完成基因组测序，双端文库构建和illumina hiseq 2500测序均委托该公司完成。下机数据利用spades(3.13.0)软件进行基因组序列拼接组装。从ncbi数据库中下载拟用于比较分析的已发表的模式种的基因组序列，基于基因组序列利用fastani计算各菌株的平均核苷酸一致性(ani)。采用在线工具ggdc 2.1(http://hhdc.dsmz.de/home.php)计算基于基因组序列的dna-dna杂交值(dddh)。菌株mmsm20和mmsm24的基因组大小分别为约5.03mb和5.16mb，gc含量分别为66.62和66.36mol％。基于基因组序列的分析结果见表2，菌株mmsm20和mmsm24与亲缘关系最近的已发表的模式菌株之间的ani值和dddh分别为78.6％～81.1％和19.5％-21.7％，显著低于目前公认的95％～96％ani和70％dddh作为物种界限的阈值(图4)。这些结果表明菌株mmsm20和mmsm24代表了鞘氨醇单胞菌属的两个不同的新种。本发明将该菌株mmsm20命名为鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)mmsm20，于2022年6月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：gdmcc no：62519。本发明将菌株mmsm24命名为鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)mmsm24，于2022年6月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：gdmcc no：62520。
[0047]
表2菌株mmsm20和mmsm24与已发表的30个近源模式种的比较基因组分析
[0048]
[0049]
[0050][0051]
实施例3：两株鞘氨醇单胞菌新种mmsm20和mmsm24产铁载体和iaa能力分析
[0052]
(1)定性测定菌株mmsm20和mmsm24产铁载体的能力
[0053]
在cpg固体平板上活化两株鞘氨醇单胞菌新种mmsm20和mmsm24甘油菌，30℃培养2d，用灭菌的棉签将活化后的菌株接种至r2a平板，每个平板接种三个菌落，30℃培养2d，取15-20ml cas检测液加入到培养好的菌落平板上，待凝固后1h内观察菌落周围颜色变化，记录铁载体分泌情况。
[0054]
r2a琼脂培养基(g/l青岛海博生物hb0167-5)：酵母浸出粉0.5g、蛋白胨0.5g、酪蛋白水解物0.5g、葡萄糖0.5g、琼脂粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，琼脂15g，使用时称取上述培养基15.2g，加热溶解于1l蒸馏水中，121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。
[0055]
cas检测液(1l)：chrome azurol s(铬天青)60.5mg，ctab 72.9mg，pipes(哌嗪-1,4-二乙磺酸)，30.24g，fecl3·
6h2o 1mm，hcl，10mm，琼脂糖0.9％(w/v)。
[0056]
(2)定量测定菌株mmsm20和mmsm24产铁载体的能力
[0057]
挑取cpg固体平板上菌株mmsm20和mmsm24的单菌落接种到含有50ml cpg液体培养基的三角瓶中，然后置于30℃，200rpm的水平摇床上震荡培养2d，以未接种mmsm20和mmsm24的灭菌的cpg培养基为对照，定量测定菌株产铁载体的量，试验设置三个生物学重复。
[0058]
铁载体测定方法为取1ml培养好的菌液于ep管中，12000rpm离心5min，取100μl上清于96孔板中，加入等体积的cas检测液混合均匀，静置1h后用酶标仪测定630nm波长吸光值as，以加ddh2o为对照调0，另取等体积未接种的灭菌cpg培养基与等体积的cas检测液混合，测定的吸光值为参比值ar。最后根据公式计算产生的铁载体量。产生的铁载体量(％)＝(ar-as)/ar*100。计算结果小于10％则认为是铁载体分泌为阴性。
[0059]
采用含有l-色氨酸(100mg/ml)的r2a液体培养基测定菌株产iaa的含量，具体方法
为将菌株mmsm20和mmsm24接种于含有l-色氨酸(100mg/ml)的r2a液体培养基，28℃，180rpm摇床培养2d。取1ml培养好的菌液于ep管中10000rpm离心5min，取50μl上清于96孔板中，同时加入50μl salkowski比色液(50ml 35％的hclo4+1ml 0.5m fecl3)。将加入50μl 50mg/l iaa的比色液作为阳性对照。96孔板于室温避光放置30min后用酶标仪测地od530的吸光值，以梯度稀释的50mg/l的iaa作为标准品制作标准曲线，最后根据标准曲线方程计算菌株产iaa的含量。
[0060]
鞘氨醇单胞菌新种mmsm20和mmsm24在平板上产铁载体的结果见图5，可以看到菌落周围的颜色由蓝色变为黄色，产生了明显的晕圈，这表明菌株mmsm20和mmsm24具有产生铁载体的能力。进一步对两株菌产铁载体和iaa的能力进行了定量评估，结果见图6，菌株mmsm20和mmsm24接种培养2d产铁载体的能力分别为68.8％和64.9％，产iaa的量分别为18.5mg/l和18.2mg/l。