一种具有皮肤修护功效的新型铜肽及其制备方法和应用与流程

51与铜肽进行选择性吸附，提高蓝铜肽的透皮性；同时，利用面贴膜将精华液附于面部的方法，相比其他护肤品会使面部承受的渗透压更大，从而形成隐形渗透压力膜，微压促渗，进一步提高蓝铜肽在皮肤中的渗透性；但是该合成方法采用了三氟乙酸进行离子交换存在不经济环保的问题，且该产品经过水洗、真空干燥等一系列操作所得，具有一定的吸潮性。


技术实现要素：

9.本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种具有高稳定性、高渗透性的皮肤修护功效的新型铜肽及其制备方法和应用。
10.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种具有皮肤修护功效的新型铜肽，该铜肽的化学结构如下：
[0011][0012]
进一步地，所述的铜肽为具有h-gly-his-lys(pal)-oh.(cu)氨基酸序列的pal-ghk-cu，其化学式为c
30h52
cun5o5。
[0013]
本发明还提供一种具有皮肤修护功效的新型铜肽的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
一、pal-ghk的制备
[0015]
(1)胺基保护
[0016]
在搅拌下，向反应器内加入fmoc-lys(dde)-oh和含有9-芴基甲氧羰基(fmoc)或叔丁基羰基(boc)的氨基酸，在室温下搅拌反应1-3h，进行胺基保护，得到ghk(pal)；
[0017]
(2)棕榈酸修饰
[0018]
搅拌下，继续向反应器内加入棕榈酸，在室温下搅拌反应1-3h，进行侧链修饰；
[0019]
所述含有9-芴基甲氧羰基(fmoc)或叔丁基羰基(boc)的氨基酸为fmoc-his(trt)-oh或boc-gly-oh；
[0020]
当氨基酸为fmoc-his(trt)-oh时，所述fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-his(trt)-oh、和棕榈酸的用量质量比为：2～4：2～4：0.5～2；
[0021]
当氨基酸为boc-gly-oh时，所述fmoc-lys(dde)-oh、boc-gly-oh和棕榈酸的用量质量比为：2～4：0.5～1：0.5～2。
[0022]
(3)脱保护
[0023]
将步骤(2)得到的产物依次用洗脱剂(20％哌啶或n,n-二甲基甲酰胺，和2％肼或n,n-二甲基甲酰胺)进行洗脱(即将产物先与20％哌啶或n,n-二甲基甲酰胺混合搅拌1-3h后离心分离，去除fmoc组，然后与2％肼或n,n-二甲基甲酰胺混合搅拌1-3h后离心分离，去
除dde组)，去除fmoc组和dde组；
[0024]
(4)氨基酸残基延长
[0025]
将步骤(3)得到的产物加入活性试剂，在室温下反应1-3h，使氨基酸残基碳链延长；所述的活性试剂包括n-羟基苯并三唑和n,n
′‑
二异丙基碳二亚胺，活性试剂的用量为fmoc-lys(dde)-oh摩尔量的1-3倍。
[0026]
(5)分离和纯化
[0027]
将步骤(4)得到的产物依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷和甲醇洗涤进行洗涤，真空干燥，然后与含有三氟乙酸和三异丙基硅烷的水溶液(体积比为90:5:5的三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合物)进行反应，将产物与树脂分离，产物经浓缩、离心，然后使用反相高效液相色谱进行纯化和分离，得到pal-ghk产品。
[0028]
二、pal-ghk-cu的合成
[0029]
将pal-ghk与乙酸铜在水中混合反应，用氢氧化钠调节反应溶液ph＝4-6，析出的天蓝色固体产物，经水洗，真空干燥，得到氨基酸序列为h-gly-his-lys(pal)-oh.(cu)的新型铜配合物。
[0030]
本发明还提供一种具有皮肤修护功效的新型铜肽的应用，将所述铜肽用于化妆品中。所述的化妆品包括精华液，以精华液总重量为100％计，配方包括如下组分和重量百分含量：
[0031]
a相：甘油4-12％、烟酰胺0.7-1.3％、新型铜肽0.1-2％、尿囊素0.1-2％、edta二钠0.01-0.1％、传明酸0.1-0.2％、去离子水余量；
[0032]
b相：羊毛脂0.5-0.7％、吐温800.2-0.25％、十八醇0.45-0.6％；
[0033]
c相：乙基己基甘油1-2％、香精0.01-0.1％。
[0034]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0035]
1.本发明引入了创新型亲脂基团棕榈酸，对ghk-cu的赖氨酸侧链进行修饰和转化，成功合成了新型铜肽pal-ghk-cu，该新型铜肽能有效改善铜肽在皮肤层中的滞留性以及有效提高铜肽的生物利用度。此外，经体外细胞毒性和功效试验，验证了此方案所合成的新型铜肽具有良好的安全性和皮肤修复功效性。
[0036]
2.本发明通过fmoc-lys(dde)-oh树脂和fmoc-his(trt)-oh氨基酸或boc-gly-oh氨基酸保护胺基，侧链均使用棕榈酸。然后fmoc组用20％哌啶或n,n-二甲基甲酰胺混合搅拌脱保护，dde组用2％肼或n,n-二甲基甲酰胺混合搅拌脱保护，随后在产物中加入n-羟基苯并三唑和n,n
′‑
二异丙基碳二亚胺活性剂延长氨基酸残基碳链，所得产物依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷和甲醇洗涤进行洗涤，真空干燥，然后与含有三氟乙酸和三异丙基硅烷的水溶液进行反应，将产物与树脂分离，产物经浓缩、离心，然后使用反相高效液相色谱进行纯化和分离，得到pal-ghk的多肽产品。将多肽产品与乙酸铜在水中混合反应，用氢氧化钠调节反应溶液ph＝4-6，析出的天蓝色固体产物，经水洗，真空干燥，得到新型铜肽。在原有基础上对于赖氨酸侧链进行修饰和转化，保有原有活性的同时增加了生物利用度。最后采用真空干燥的方法操作简单，经济环保，大大提高了经济效益。
[0037]
3.本发明的新型铜肽合成路线清楚，原料简单，所得产物结构稳定且表征清楚。
[0038]
4.本发明的新型铜肽能有效改善铜肽在皮肤层中的滞留性以及有效提高铜肽的生物利用度。
[0039]
5.本发明的新型铜肽应用到精华液中，能够有效降低皱纹深度，显著去除鱼尾纹的功效。
附图说明
[0040]
图1为实施例1所得pal-ghk-cu的hplc图；
[0041]
图2为实施例1所得pal-ghk-cu的质谱图；
[0042]
图3为实施例1所得pal-ghk-cu的3d渲染图；
[0043]
图4为累积皮肤通透性计算结果图。
具体实施方式
[0044]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0045]
本发明采用的原料均为市售产品，例如
[0046]
fmoc-lys(dde)-oh可选用anaspec(as-21081)、常州康龙生物科技有限公司(150629-67-7)等；
[0047]
boc-gly-oh可选用南京肽业生物科技有限公司(njpep-x-146686)、北京泰泽嘉业科技发展有限公司(04-12-0001-25gm)等；
[0048]
棕榈酸可选用上海源叶生物科技有限公司(s30037)、西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(w283215)等。
[0049]
实施例1
[0050]
一种具有皮肤修护功效的新型铜肽的制备方法，包括以下步骤：
[0051]
一、pal-ghk的制备
[0052]
(1)胺基保护
[0053]
在搅拌下，向反应器内加入fmoc-lys(dde)-oh树脂和boc-gly-oh在室温下搅拌反应2.0h，进行胺基保护，得到ghk(pal)；
[0054]
(2)棕榈酸修饰
[0055]
搅拌下，继续向反应器内加入棕榈酸，在室温下搅拌反应2.0h，进行侧链修饰；
[0056]
所述fmoc-lys(dde)-oh、boc-gly-oh和棕榈酸的用量比为：质量比3.37：1：1.46。
[0057]
(3)脱保护
[0058]
将步骤(2)得到的产物依次用洗脱剂(20％哌啶和2％n,n-二甲基甲酰胺)进行洗脱(即将产物先与20％哌啶混合搅拌2.0h后离心分离，去除fmoc组；然后与2.0％n,n-二甲基甲酰胺混合搅拌2.0h后离心分离，去除dde组)，去除fmoc组和dde组；
[0059]
(4)氨基酸残基延长
[0060]
将步骤(3)得到的产物加入活性试剂n-羟基苯并三唑和n,n
′‑
二异丙基碳二亚胺)，在室温下反应2.0h，使氨基酸残基碳链延长；活性试剂的用量为fmoc-lys(dde)-oh树脂摩尔量的2.0倍。
[0061]
(5)分离和纯化
[0062]
将步骤(4)得到的产物依次用二甲基甲酰胺洗涤6次，二氯甲烷洗涤6次，甲醇洗涤2次，真空干燥，然后将附着有产物的树脂与含有三氟乙酸和三异丙基硅烷的水溶液(体积比为90:5:5的三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合物)进行反应，将产物与树脂分离，产物
浓缩至残渣，用冷乙醚沉淀并离心，再用冷乙醚洗涤固体3次并离心，真空干燥，然后使用反相高效液相色谱(柱:unisil,c18,10μ,250x 50mm)对肽进行纯化和分离，得到pal-ghk产品。
[0063]
二、pal-ghk-cu的合成
[0064]
将pal-ghk与乙酸铜在水中混合反应，用氢氧化钠调节反应溶液ph＝4-6，析出的天蓝色固体产物，经水洗3次，真空干燥，得到氨基酸序列为h-gly-his-lys(pal)-oh.(cu)的新型铜配合物。
[0065]
(6)采用高效液相色谱法(agilent,1100)和质谱法(agilent,6120)对制备的pal-ghk-cu进行表征，如图1-2所示，从图中可以看出，在该分析条件下，所制备的pal-ghk-cu分离度良好，紫外吸收度高，峰形较为对称，保留时间为12分钟左右，且分子量表征为640.33g/mol。
[0066]
合成的pal-ghk-cu(理论mw：1302.44g/mol)的分子量(mws)经ms(agilent，6120)表征为640.33g/mol，表明pal-ghk-cu的合成是成功的(结构如图3所示)。
[0067]
(7)采用体外透皮试验(rjy-6b药物透皮扩散试验仪)对所得pal-ghk-cu进行体外透皮通透试验，验证了此方案合成的新型铜肽的生物利用度的提高，具体包括以下步骤：
[0068]
1.选择猪耳背皮肤，先去除它的毛发和脂肪，再剪去3*3cm的皮片，最后将其放入零下20℃的冰箱中保存备用。等皮肤自然解冻后，用生理盐水浸泡0.5h，接着用吸水棉擦拭，然后再将其固定在垂直渗透试验扩散槽中，以备使用。
[0069]
2.先在接收槽中加入约7ml 0.9％的氯化钠溶液的生理盐水，将其作为接收液，再加入制得的新型铜肽以及与新型铜肽原液相同含量的市售铜肽(约1-2g，称重并记录)。接着用密封膜封闭供应罐，并以300r/min的速度启动磁力搅拌，分别在2h、4h、6h、8h、10h时，用注射器缓慢抽取所有接收液。每次抽取后，再用注射针头抽取适量绝缘生理盐水(可填满接收槽，约7g)，然后放回接收槽中。10小时以后，取出接收液，不添加生理盐水，将仪器温度设置在32
±
5℃处。
[0070]
3.采用液相色谱-质谱联用仪/质谱法(agilent 1290 infinityⅱ/agilent 6460triple quad lc/ms)对在预定时间采集的接收液和皮肤样品中的新型铜肽，进行了定性和定量分析，比较了本技术新型铜肽与未修饰的铜肽的通透性，具体如下：
[0071]
标准溶液的制备:准确称取适量的新型铜肽和标准铜肽(市售杭州肽佳生物科技有限公司(tj8511))放入玻璃瓶中，溶于适量体积的80％异丙醇水中(体积＝实际称量
×
0.994/1mg/ml)，分别以1mg/ml的浓度制备。将备用液进行稀释后，得到浓度分别为2000、5000、10000、25000、50000ng/ml的校准曲线工作液。采用外标法计算浓度，通过计算皮肤累计通透率和皮肤滞留量来评估透皮性能。
[0072]
各时段样品累积通透率q计算公式(1)如下：
[0073]
q＝cn
×
v+∑
i＝1...n-1 ci
×
v0
ꢀꢀꢀ
(1)
[0074]
注:q为累积通透率；不同采样点所测得的cn-肽浓度，用mg/ml表示；v为接收液体的体积，单位为7ml；ci:从第一次取样到最后一次取样，接收溶液中肽的浓度，用mg/ml表示；v0是每个样本的体积。
[0075]
质谱采用esi源正离子模式，扫描采用多反应监测(mrm)模式。用于定量分析的离子对为新型铜肽m/z 579
→
195.1和铜肽m/z 341.2
→
195.1。累积通透率结果:根据公式
(1)，得到不同时间点试样的累积通透率，如下表1所示：新型铜肽(pal-ghk-cu)分组以b-1、b-2、b-3计，未修饰的铜肽(ghk-cu)分组以t-1、t-2、t-3计，两者的起始浓度一致，均为1mg/ml。
[0076]
表1 累积通透率结果
[0077][0078]
结合表1和图4，体外通透试验结果表明，新型铜肽(pal-ghk-cu)具有较好的皮肤通透性。10h累计渗透率平均值为688.78ug，受试面积为2.27cm2，累积通透率为688.78ug/2.27cm2＝303.42ug/cm2，比未修饰的铜肽(ghk-cu)提高了94％，具体计算如下：未修饰的铜肽10h累计渗透率平均值为354.12ug，受试面积为2.27cm2，累积通透率为354.12/2.27＝156ug/cm2，因此pal-ghk-cu与ghk-cu相比，累积通透率提升(303.42-156)/156*100％＝94.5％，铜肽的生物利用度得到了有效提升，新型铜肽经过亲脂基团修饰，提高了铜肽的透皮吸收能力，显示出更好的潜在皮肤修复效果。
[0079]
(8)新型铜肽的体外研究
[0080]
进一步评估新型铜肽修护功效，并与未修饰的铜肽进行比较，并对其皮肤安全性进行评估：
[0081]
将角质形成细胞以每孔4
×
103个细胞的密度接种于96孔板中，在不含表皮生长因子的培养基中培养过夜。分别加入25μg/l浓度的新型铜肽和铜肽，作用24h后，采用mtt比色法观察细胞活性。以10ng/ml表皮生长因子培养基作为阳性对照(下表中pc(egf containing))，进行验证。将成纤维细胞以4
×
103细胞/孔的密度接种于96孔板中，在含2％胎牛血清的培养基中培养过夜。加入25μg/l浓度的新型铜肽(下表中25μg/l pal-ghk-cu)和铜肽(下表中25μg/l ghk-cu)，作用24h后，采用mtt比色法观察细胞活性。以10％胎牛血清为阳性对照(下表中pc(10％fbs))，进行验证。另外，将成纤维细胞以2.5
×
105细胞/孔的密度接种于6孔板上，在含2％胎牛血清的培养基中培养过夜。分别加入25μg/l浓度的新型
铜肽和铜肽，作用24h。通过划痕和显微镜摄影观察细胞迁移率。以10％胎牛血清作为阳性对照，进行验证。根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)第6.4、6.5、6.6节对新型铜肽的皮肤应用安全性进行评估。如下表2-3所示：
[0082]
表2 细胞增殖试验结果(人角质形成细胞)
[0083][0084]
表3 细胞增殖试验结果(人成纤维细胞)
[0085][0086]
上表中sc表示：阴性对照；
[0087]
sd表示：相对迁移率；
[0088]
pc表示：阳性对照；
[0089]
由表2可知，当用25μg/l的新型铜肽处理24小时后，角质形成细胞的增殖增加了近200％，而铜肽细胞的增殖增加了近20％。分析结果进一步表明，新型铜肽具有更好的表皮修复能力。由表3可知，25μg/l新型铜肽经处理24h后，成纤维细胞的增殖率提高了超过300％，优于铜肽处理24h后的增殖率。这种新型铜肽能维持成纤维细胞的增殖活性，而且对真皮修复具有潜在作用。
[0090]
表4 细胞迁移结果
[0091][0092]
由表4可知，25μg/l新型铜肽经处理24h后，成纤维细胞的相对迁移率显著增加(p《0.01)。与铜肽相比，新型铜肽具有更好的细胞迁移能力，进一步说明新型铜肽具有更好的皮肤修复能力。
[0093]
(8)新型铜肽用于皮肤的安全性
[0094]
通过实验，进一步验证了新型铜肽用于皮肤的安全性，以含有不同质量浓度的新
型铜肽的精华液为样品，进行安全性测试，结果如下：在12.5mg/ml的浓度范围内没有细胞毒性；在50mg/ml的高剂量下细胞增殖率大于50％，且没有细胞毒性。化妆品安全性评估表明，在0.125g/l的高剂量下，无皮肤刺激、无剧烈眼部刺激、无皮肤过敏以及无细胞毒性。
[0095]
应用实例
[0096]
将实施例1制得的新型铜肽用于制备精华液，具体如下：
[0097]
按下表5的重量百分比备料：
[0098]
表5 应用实例1-3和空白例、对照例的原料组分配比
[0099][0100][0101]
应用实例1-3所示精华液的制备工艺流程如下所示：
[0102]
(1)a相制备：加入一定量的去离子水于反应器，水加热至恒温90℃，依次加入甘油、烟酰胺、新型铜肽、尿囊素、edta二钠和传明酸，搅拌至完全溶解。
[0103]
(2)b相制备：反应器中加入羊毛脂、吐温60和十八醇至于90℃水浴锅，至其完全溶解。
[0104]
(3)将a相缓慢倒入b相中，3000r/min混合均质3分钟。
[0105]
(4)二者混合均质后，降温至45℃时，将c相的乙基己基甘油和香精加入，3000r/min均质3分钟使其分散完全，得到精华液。
[0106]
空白例的精华液的制备工艺流程如下所示：
[0107]
(1)a相制备：加入一定量的去离子水于反应器，水域加热至恒温90℃，依次加入甘油、烟酰胺、尿囊素、edta二钠和传明酸，搅拌至完全溶解。
[0108]
(2)b相制备：反应器中加入羊毛脂、吐温60和十八醇至于90℃水浴锅，至其完全溶解。
[0109]
(3)将a相缓慢倒入b相中，3000r/min混合均质3分钟。
[0110]
(4)二者混合均质后，降温至45℃时，将c相的乙基己基甘油和香精加入，3000r/min均质3分钟使其分散完全，得到精华液。
[0111]
对照例的精华液的制备工艺流程如下所示：
[0112]
(1)a相制备：加入一定量的去离子水于反应器，水域加热至恒温90℃，依次加入甘
油、烟酰胺、铜肽、尿囊素、edta二钠和传明酸，搅拌至完全溶解。
[0113]
(2)b相制备：反应器中加入羊毛脂、吐温60和十八醇至于90℃水浴锅，至其完全溶解。
[0114]
(3)将a相缓慢倒入b相中，3000r/min混合均质3分钟。
[0115]
(4)二者混合均质后，降温至45℃时，将c相的乙基己基甘油和香精加入，3000r/min均质3分钟使其分散完全，得到精华液。
[0116]
效果验证试验例一：
[0117]
鱼尾纹测试实验
[0118]
选择30人作为测试人员，均有明显的鱼尾纹，分为5组(a-e)，a-c组受试人员的脸部分别试用应用实例1-3含有新型蓝铜肽的精华液，d组受试人员的脸部试用空白例，e组受试人员的脸部试用对照例，每天早晚各使用一次，共用28天，采用primos测定试用效果，所得结果见表2.
[0119]
测试指标：明显的鱼尾纹为
×
；较浅的鱼尾纹为o；没有鱼尾纹为√。
[0120]
测试条件：(1)室内环境；(2)无强烈阳光或灯光直射；(3)环境温度25
±
2℃，环境湿度40-60％。
[0121]
表6 应用实例1-3和空白例、对照例精华液的鱼尾纹测试结果
[0122][0123]
由表6可以看出，本发明具有较好的除皱、抗衰老的效果。
[0124]
效果验证试验例二：
[0125]
选择了15名符合皱纹要求的女性志愿者参加临床研究，年龄在35-55岁之间。连续4周每天早晚将上述应用实例1所得精华液涂于眼角一次，并记录d0、d14、d28天的数据。使用primos(lmi technologies gmbh)评估眼周皱纹的改善情况，临床研究结果如下表7所示：
[0126]
表7 临床研究结果
[0127][0128]
第0天(d0)到第14天(d14)和第28天(d28)的平均值见表7。28天后，可以看出，含本发明新型铜肽提取物的精华液可有效降低皱纹深度，并显著去除鱼尾纹。