一种冠状病毒病原体核酸检测试剂及其检测方法和应用与流程

本发明涉及生物检测，具体而言，涉及一种冠状病毒病原体核酸检测试剂及其检测方法和应用。

背景技术：

1、冠状病毒呈球形且具有多形型，直径约80～160nm，有囊膜，并包含一段不分段的、线性单股正链rna基因组，其基因组是已知rna病毒中最长的，约27～32kb，该rna含有5'帽子结构和3'聚腺苷酸，还包含多个开放阅读框。目前，冠状病毒被分为α、β、γ和δ四大类，人冠状病毒主要分布在α类和β类，而感染人类的冠状病毒共有七种，致病性较弱的有α冠状病毒属中的hcov-229e和hcov-nl63，和β冠状病毒属中的hcov-oc43、hcov-hku1；致病性较强的有β冠状病毒属中的sars-cov、mers-cov以及sars-cov-2。

2、冠状病毒是一种传染性比较强的病毒，会通过直接、间接接触或气溶胶进行传播，其致病过程大致分为3个阶段，即病毒侵入、复制阶段、过度免疫应答和急性肺损伤阶段，它们首先经由飞沫传播、气溶胶传播和接触传播等途径到达机体，靠静电作用吸附在细胞外表面，随后病毒表面的刺突蛋白(s)或血凝素酯酶蛋白(he)与敏感细胞膜表面特异性的细胞受体识别并结合，并利用多种方式成功逃逸宿主天然免疫反应，启动病毒的生命周期。与此同时，在机体与病毒的这场博弈中会诱发大量的促炎性细胞因子和趋化因子产生，启动“细胞因子风暴”效应，使靶细胞受损或死亡，进而造成局部组织、器官病变或坏死，最后释放出的子代病毒再不断地去感染其他未受感染的细胞，并随着病毒的不断复制，使机体病情不断恶化，病程加剧。冠状病毒感染的主要致病特征是呼吸道感染与宿主免疫系统的过激反应。

3、从感染冠状病毒到疾病发作需要经历一个两周左右的潜伏期，早期症状与感冒类似，还有研究表明sars-cov-2感染的患者或无症状感染者在潜伏期就具有传染性，所以及时准确的对疑似病例进行确诊、研发有效的治疗药物和抗体以及开发安全有效的疫苗是防止疫情进一步扩大的重要手段。

4、目前，有血清学检测、核酸检测、电镜技术、病毒的分离培养等检测冠状病毒的方式，其中，血清学检测和核酸检测是检测冠状病毒的主要方式。电镜技术可以用于冠状病毒形态学鉴定和观察，但依赖于科技含量高的电镜设备，合适在实验室里进行形态研究。病毒分离培养是病毒检测的金标准，但病毒的分离对技术的依赖性较高，并且与样本质量、病毒的细胞嗜性以及分离体系有关。血清学检测包括igm抗体检测法、igg抗体检测法、igm/igg双抗体检测法，其具有可操作性强，适用范围广等优点；但检测样品容易污染或溶血，可能存在假阳性或假阴性的检测结果。

5、目前，冠状病毒检测多用核酸检测的方式，核酸检测包括全基因组高通量测序、实时荧光定量pcr、多重pcr技术、逆转录环介导等温扩增等方式，其中，全基因组高通量测序能够检测到冠状病毒的整个基因组，但是成本高昂，对设备的依赖性较高；实时荧光定量pcr是目前核酸检测最常用的检测方式，但同样需要价格昂贵的设备进行辅助；多重pcr技术的检测效率较高，可以同时检测多种病毒；逆转录环介导等温扩增具有方便省时、不依赖设备等优点，适合于现场检测，但检测的准确度和重复性有待提高，可能会出现假阴性的风险。

6、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种冠状病毒病原体核酸检测试剂及其检测方法和应用。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明实施例提供了一种冠状病毒病原体核酸检测试剂，其包括用于检测β冠状病毒oc43靶标区域和hku1靶标区域的核酸组合物；其中，所述oc43靶标区域的序列如seq id no：1所示，所述hku1靶标区域的序列如seq id no：2所示。

4、第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的冠状病毒病原体核酸检测试剂在制备用于检测冠状病毒病原体核酸的试剂盒中的应用。

5、第三方面，本发明实施例提供了一种用于检测冠状病毒病原体核酸的试剂盒，其包括如前述实施例所述的冠状病毒病原体核酸检测试剂。

6、第四方面，本发明实施例提供了一种冠状病毒病原体核酸的检测方法，其包括采用如前述实施例所述的冠状病毒病原体核酸检测试剂或如前述实施例所述的用于检测冠状病毒病原体核酸的试剂盒对待测样本进行pcr检测；所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

7、本发明具有以下有益效果：

8、本发明针对β冠状病毒属中的oc43、hku1设计了特异性引物探针，这两组引物探针组合都适配于实时荧光定量pcr分析仪，可以在保证检测的特异性和灵敏度的基础上实现快速检测出结果。

技术特征：

1.一种冠状病毒病原体核酸检测试剂，其包括用于检测β冠状病毒oc43靶标区域和hku1靶标区域的核酸组合物；其中，所述oc43靶标区域的序列如seq id no：1所示，所述hku1靶标区域的序列如seq id no：2所示。

2.根据权利要求1所述的冠状病毒病原体核酸检测试剂，其中，所述冠状病毒病原体核酸检测试剂是检测β冠状病毒属中的hcov-oc43和/或hcov-hku1亚型。

3.根据权利要求1所述的冠状病毒病原体核酸检测试剂，其中，所述核酸组合物包括：序列如seq id no：6所示的上游引物和序列如seq id no：7～8所示的下游引物。

4.根据权利要求3所述的冠状病毒病原体核酸检测试剂，其中，所述核酸组合物还包括探针；

5.根据权利要求3或4所述的冠状病毒病原体核酸检测试剂，其中，所述上游引物和所述下游引物的摩尔比为(0.1～0.5)：(0.1～0.5)；

6.如权利要求1～5任一项所述的冠状病毒病原体核酸检测试剂在制备用于检测冠状病毒病原体核酸的试剂盒中的应用。

7.一种用于检测冠状病毒病原体核酸的试剂盒，其中，其包括如权利要求1～5任一项所述的冠状病毒病原体核酸检测试剂。

8.根据权利要求7所述的用于检测冠状病毒病原体核酸的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：pcr反应液、阳性质控品、阴性质控品、酶混合液中的至少一种；

9.一种冠状病毒病原体核酸的检测方法，其中，其包括采用如权利要求1～5任一项所述的冠状病毒病原体核酸检测试剂或如权利要求7或8所述的用于检测冠状病毒病原体核酸的试剂盒对待测样本进行pcr检测；

10.根据权利要求9所述的检测方法，其中，进行所述pcr检测时，核酸组合物中的上游引物和下游引物的作用浓度独立地为0.1～0.5μm；

技术总结
本发明公开了一种冠状病毒病原体核酸检测试剂及其检测方法和应用，涉及生物检测技术领域。本发明针对β冠状病毒属中的OC43、HKU1设计了特异性引物探针，OC43靶标区域的序列如SEQID No：1所示，所述HKU1靶标区域的序列如SEQ ID No：2所示，针对这靶标区域设计获得的引物探针组合都适配于实时荧光定量PCR分析仪，可以在保证检测的特异性和灵敏度的基础上实现快速检测出结果。

技术研发人员：黄超杰,黄华香,毛平道
受保护的技术使用者：广东润鹏生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13