一种用于发夹小RNA类药物定量的改进型茎环引物及其定量方法与流程

本发明属于寡核苷酸检测，具体涉及一种用于发夹小rna类药物定量的改进型茎环引物及其定量方法。

背景技术：

1、发夹小rna是一种形成发夹结构的rna序列，发夹结构可显著增强其自身的稳定性，在导入细胞中后，可长期稳定存在，并通过rna干扰途径使基因沉默，在病毒感染和异常基因疾病中具有巨大的药用潜力。目前已有许多团队在进行发夹小rna类药物的研发，发夹小rna的定量分析有利于促进此类药物的药代动力学和毒代动力学的研究并可用于后续的临床检测。

2、然而由于发夹小rna本身已形成了碱基互补配对，很难针对其设计有效的杂交探针，这限制了杂交elisa和质谱法对该类核酸药物进行定量分析的应用。对于另一种常见的rna定量技术，rt-qpcr，在检测发夹小rna时存在反转录效率低的问题。因为发夹小rna自身已形成碱基配对，阻碍了常规3’端配对引物与其配对，使得反转录很难进行，即使反转录成功，也因序列太短而无法设计出有效的正向和反向引物进行rt-qpcr。另一方面，发夹小rna结构复杂，序列长度短，使其在血浆或组织中提取困难，易造成丢失，导致定量结果不准确。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明要解决的技术问题之一是提供一种用于发夹小rna类药物定量的改进型茎环引物，该茎环引物特异性强、通用性好，反转录效率高。

2、本发明要解决的技术问题之二是提供采用上述改进型茎环引物进行发夹小rna类药物定量的方法，该方法具有分析步骤少、成本低、效率高、准确率高的特点。

3、为解决上述第一个技术问题，本发明采用如下技术方案：一种用于发夹小rna类药物定量的改进型茎环引物，其具有6～9个未形成发夹结构的游离简并碱基(a/c/g/t)，6～9个所述游离简并碱基的具体序列以与目标发夹小rna的中间环位置处形成互补配对为目的来设计，且所述改进型茎环引物的第一个3’端配对碱基距目标发夹小rna 5’端大于18个碱基。

4、在一些实施方案中，所述改进型茎环引物的5’端是由如seq id no：1所示的碱基序列构成的茎环结构，3’端具有6～9个所述游离简并碱基(a/c/g/t)。

5、图1是其中一种所述改进型茎环引物的结构图，该改进型茎环引物的5’端碱基序列如seq id no：1所示，3’端是由6个游离简并碱基构成并与目标发夹小rna的中间环位置处形成互补配对(图2)。

6、本发明中的改进型茎环引物直接与发夹小rna的中间环位置处互补配对，而非rt-qpcr方法中常见的与发夹小rna3’端配对。

7、采用本发明中的改进型茎环引物可避免rna的发夹结构对茎环引物与发夹小rna配对的抑制，使反转录过程能够顺利进行。

8、为解决上述第二个技术问题，本发明采用如下技术方案：采用上述改进型茎环引物进行发夹小rna类药物定量的方法，包括如下步骤：采用所述改进型茎环引物对血浆或组织裂解液中的发夹小rna进行反转录，获得目标cdna，然后采用rt-qpcr引物进行rt-qpcr反应，获得所述目标发夹小rna的定量结果。该定量方法步骤如图2、图3、图4所示。

9、所述反转录反应时采用温度梯度使所述改进型茎环引物的3’端与所述目标发夹小rna的中间环位置处能够通过所述游离简并碱基进行成功配对，配对的所述简并碱基的数量为6～9个。所述反转录反应时采用的温度梯度具体为：95℃，5分钟；80℃，2分钟；70℃，2分钟；60℃，2分钟；45℃，2分钟，最后放置冰上。

10、所述rt-qpcr的引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物序列由两部分组成，一部分是由和发夹小rna序列反向互补的12～16个特异性碱基组成，优选为14个，另一部分由4～6个随机碱基(为非特异性碱基，比如：gcgc、gcgcgc)组成，用来调节引物的tm值在60±2℃和gc含量在40％～60％；所述的反向引物是茎环引物的一段骨架序列，其碱基序列如seq id no：2所示。

11、所述rt-qpcr反应中以sybr green i作为染料进行定量检测。

12、采用本发明中的定量方法可直接使用血浆或组织裂解液作为模板进行反转录和rt-qpcr反应，而不需要进行核酸的提取。

13、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

14、(1)发夹小rna的发夹结构使得很难针对其设计有效的杂交探针，这限制了rt-qpcr、杂交elisa或质谱法对该类核酸药物进行定量分析的应用。而本发明中的发夹小rna定量方法只需要针对目标发夹小rna中间环位置确定改进型茎环引物3’端的6个简并碱基的序列，即可进行反转录和后续qpcr扩增。

15、(2)发夹小rna在血浆或组织中提取困难，使得定量结果不准确。本发明中使用的改进型茎环引物具有非常强的特异性，不会受到血浆或组织复杂基质的干扰，可直接使用血浆或组织裂解液作为模板，不需要进行核酸的提取，从而简化了分析步骤，提高了结果准确度。采用本发明的定量方法，在血浆中检测发夹小rna的灵敏度可达到0.5ng/ml；在组织中检测发夹小rna的灵敏度可达到50ng/ml。

16、(3)本发明中的定量方法可以一次性进行超过100个样本的高通量分析，与杂交elisa或质谱法相比，可显著提高分析效率。同时本技术方案使用的是sybr green i染料法，而非taqman探针法，避免了探针设计的困难，提高了通用性，降低了成本。

17、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

技术特征：

1.一种用于发夹小rna类药物定量的改进型茎环引物，其特征在于，所述改进型茎环引物具有6～9个未形成发夹结构的游离简并碱基(a/c/g/t)，6～9个所述游离简并碱基的具体序列以与目标发夹小rna的中间环位置处形成互补配对为目的来设计，且所述改进型茎环引物的第一个3’端配对碱基距目标发夹小rna 5’端大于18个碱基。

2.根据权利要求1所述的改进型茎环引物，其特征在于，所述改进型茎环引物的5’端是由如seq id no：1所示的碱基序列构成的茎环结构，3’端具有6～9个所述游离简并碱基(a/c/g/t)。

3.一种发夹小rna的定量方法，其特征在于，采用权利要求1所述的改进型茎环引物进行检测。

4.根据权利要求3所述的定量方法，其特征在于，包括以下步骤：采用所述改进型茎环引物对血浆或组织裂解液中的发夹小rna进行反转录，获得目标cdna，然后采用rt-qpcr引物进行rt-qpcr反应，获得所述目标发夹小rna的定量结果。

5.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，反转录反应时采用温度梯度使所述改进型茎环引物的3’端与所述目标发夹小rna的中间环位置处能够通过所述简并碱基进行成功配对，配对的所述简并碱基的数量为6～9个。

6.根据权利要求5所述的定量方法，其特征在于，所述温度梯度具体为：95℃，5分钟；80℃，2分钟；70℃，2分钟；60℃，2分钟；45℃，2分钟，最后放置冰上。

7.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述rt-qpcr引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物含有4～6个随机碱基和12～16个与所述目标发夹小rna 5’端相同的碱基，所述反向引物的碱基序列如seq id no：2所示。

8.根据权利要求7所述的定量方法，其特征在于，所述正向引物的随机碱基序列的确定以调节引物的tm值和gc含量为目的，使得tm值为60±2℃，gc含量为40％～60％；所述正向引物与所述目标发夹小rna互补的碱基序列为14个。

9.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，在rt-qpcr反应中以sybr green i作为染料进行定量检测。

10.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，可直接使用血浆或组织裂解液作为模板进行反转录和rt-qpcr反应，不需要进行核酸的提取。

技术总结
本发明公开了一种用于发夹小RNA类药物定量的改进型茎环引物，该茎环引物可特异性地与发夹小RNA的中间环位置处互补配对，避免了RNA发夹结构对茎环引物与发夹小RNA配对的抑制，提高了反转录效率。本发明还提供了采用上述改进型茎环引物进行发夹小RNA类药物定量的方法，该方法具有分析步骤少、成本低、效率高、准确率高的特点。

技术研发人员：魏波,杨华,魏峥,李波,金晓莺,李晋鹏
受保护的技术使用者：苏州药明康德新药开发有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13