一种靶向环状RNA的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用与流程

本发明属于基因工程，具体而言，涉及一种靶向环状rna的shrna、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。

背景技术：

1、作为最常见的妇科恶性肿瘤之一，宫颈癌已成为一种重要的公共卫生问题。近年来，随着人乳头瘤病毒(hpv)疫苗的使用与宫颈癌筛查的普及，宫颈癌发病率在西方发达国家明显下降，而我国宫颈癌的发病率却有升高趋势。根据目前宫颈癌的最新发病报告来看，全球最新的发病例数大约是60万/年，死亡例数大约34万/年。中国的每年新发病例数接近11万，死亡人数大概在5.9万，中国宫颈癌的发病率大约占全球的1/5，宫颈癌仍是严重危害女性健康的疾病。在加强宫颈癌预防同时，宫颈治疗仍然面临巨大挑战。目前，手术、放化疗是宫颈癌的主要治疗手段，但对于大多数晚期宫颈癌患者的疗效并不理想，晚期复发性宫颈癌预后较差，仍缺乏有效的治疗方法。因此，进一步探究宫颈癌的发病机制，探索新的宫颈癌治疗方法迫在眉睫。

2、环状rna(circularrnas，circrnas)是一类由前体mrna(pre-mrna)反向剪接形成的单链闭合环状rna分子。目前研究已证实多种circrnas在宫颈癌细胞中差异表达，通过竞争结合微小rna(mirna)以发挥海绵吸附作用，与rna结合蛋白相互作用，甚至翻译功能肽等方式，广泛参与肿瘤细胞生长、侵袭、迁移和转移等。但总体而言，对于circrnas在宫颈癌中的研究尚处于起步阶段，其详细分子作用机制尚未完全阐明，对circrnas能否作为宫颈癌治疗靶标等方面存在较大研究空间。

3、环状rna hsa_circ_0005571，定位于人类第19号染色体(18285849-18286507)，起源于其线性亲本基因ifi30第1-3号外显子。当前关于hsa_circ_0005571的报道较少，仅一项研究提示hsa_circ_0005571可能参与调控三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移、和凋亡等恶性生物学过程(pmid:35378000)。而对于hsa_circ_0005571在宫颈癌中的功能尚无研究报道，与宫颈癌发生发展是否存在相关性尚不可知。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明目的在于提供一种靶向环状rna hsa_circ_0005571的shrna和应用，该环状rna与宫颈癌细胞增殖能力相关，针对其设计的shrna可应用于抗宫颈癌药物的制备。

2、本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

3、本发明的一个方面提供了一种靶向环状rna的shrna，所述环状rna为环状rnahsa_circ_0005571，所述shrna包含正义链、反义链、茎环结构以及终止信号；

4、所述正义链具有如序列表seq.id.no.2所示的碱基序列，所述反义链具有如序列表seq.id.no.3所示的碱基序列；

5、所述茎环结构的碱基序列为ctcgag；

6、所述终止信号的碱基序列为ttttt或tttttt。

7、本发明的另一个方面还提供了一种靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体，其特征在于，该载体是：plko.1-puro-hsa_circ_0005571-shrna慢病毒载体。

8、本发明的又一个方面还提供了一种靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体的构建方法，所述慢病毒表达载体由合成的所述shrna克隆入慢病毒表达载体plko.1-puro中而得，所述的构建方法包括以下步骤：

9、(1)设计shrna靶点：其具有如序列表seq.id.no.1所示的碱基序列；

10、(2)dna oligo序列合成：根据所述shrna靶点设计shrna干扰序列，其正义链具有如序列表seq.id.no.2所示的碱基序列，所述反义链具有如序列表seq.id.no.3所示的碱基序列；

11、(3)dna oligo序列退火：将正义链和反义链混匀然后加入退火缓冲液进行退火，形成shrna模板，然后稀释备用；

12、(4)载体线性化：将慢病毒表达载体plko.1-puro于37℃进行双酶切反应3h，对产物进行电泳，回收线性化plko.1-puro，稀释备用；

13、(5)目的片段与载体连接：将得到的线性化plko.1-puro与得到的shrna模板于16℃连接过夜得到连接产物；

14、(6)转化及阳性克隆的pcr鉴定与测序：将连接产物加入到大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min；加入无抗生素的lb液体培养基培养；取菌液均匀涂抹在含有amp的lb固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养，次日，挑取单菌落，进行菌液pcr鉴定，挑选阳性克隆进行测序，鉴定阳性克隆即为构建成功的plko.1-puro-hsa_circ_0005571-shrna慢病毒载体。

15、进一步地，步骤(2)中所述shrna干扰序列中还包含碱基序列为ctcgag的茎环结构，以及碱基序列为ttttt或tttttt的终止信号。

16、进一步地，步骤(3)中所述正义链和反义链的浓度比为1:1。

17、进一步地，步骤(3)中所述退火程序为：95℃，30s；72℃，2min；37℃，2min；25℃，2min。

18、进一步地，步骤(4)中所述双酶切反应中使用的酶为agei/ecori，酶切体系为：

19、

20、进一步地，步骤(5)中所述连接体系为：

21、

22、本发明的再一个方面还提供了一种靶向环状rna的shrna在制备抗宫颈癌药物中的应用。

23、本发明的再一个方面还提供了一种靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体在制备抗宫颈癌药物中的应用。

24、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果：本发明所公开的一种靶向环状rna hsa_circ_0005571的shrna，通过转染shrna可下调hsa_circ_0005571的表达，显著抑制癌细胞活性，为宫颈癌相关circrna的临床治疗和科学研究提供了基础。

25、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并结合附图详细说明如后。

技术特征：

1.一种靶向环状rna的shrna，其特征在于，所述环状rna为环状rna hsa_circ_0005571，所述shrna包含正义链、反义链、茎环结构以及终止信号；

2.根据权利要求1所述的靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体，其特征在于，该载体是：plko.1-puro-hsa_circ_0005571-shrna慢病毒载体。

3.根据权利要求2所述的靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体由合成的所述shrna克隆入慢病毒表达载体plko.1-puro中而得，所述的构建方法包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述shrna干扰序列中还包含碱基序列为ctcgag的茎环结构，以及碱基序列为ttttt或tttttt的终止信号。

5.根据权利要求3所述的靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述正义链和反义链的浓度比为1:1。

6.根据权利要求3所述的靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述退火程序为：95℃，30s；72℃，2min；37℃，2min；25℃，2min。

7.根据权利要求3所述的靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述双酶切反应中使用的酶为agei/ecori，酶切体系为：

8.根据权利要求3所述的靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述连接体系为：

9.根据权利要求1所述的靶向环状rna的shrna在制备抗宫颈癌药物中的应用。

10.根据权利要求2所述的靶向环状rna的shrna的慢病毒表达载体在制备抗宫颈癌药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种靶向环状RNA的shRNA，其特征在于，所述环状RNA为环状RNA hsa_circ_0005571，所述shRNA包含正义链、反义链、茎环结构以及终止信号。本发明还公开了上述shRNA的慢病毒表达载体及其构建方法。本发明的靶向环状RNA hsa_circ_0005571的shRNA，通过转染shRNA可下调hsa_circ_0005571的表达，显著抑制癌细胞活性，为宫颈癌相关circRNA的临床治疗和科学研究提供了基础。

技术研发人员：袁奕,高凡雅,范许云,何胜祥
受保护的技术使用者：安徽同科生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13