1.本发明属于食用菌技术领域，尤其涉及一种食用菌病毒检测方法。
背景技术：
2.病毒检测是脱病毒研究及无毒菌株选育的重要环节。目前，常用的食用菌病毒的检测方法有以下几种：电镜观察、利用病毒粒子或外壳蛋白制备抗血清进行血清学检测、dsrna电泳检测技术和pcr法。电镜法操作繁琐、费用高、且需要特殊设备，因此其在实际生产中的应用受到了限制。利用病毒粒子或外壳蛋白制备多克隆或单克隆抗体进行血清学检测，这种方法首先需要分离纯化病毒，当提取的病毒浓度比较低时，制备的抗血清效价不是很高，且特异性也不强，一定程度上也限制了利用其通过免疫杂交或elisa检测病毒。由于目前已经发现的食用菌病毒的基因组大多为dsrna，通过琼脂糖电泳检测分离纯化dsrna是实验室中检测病毒最常用的一种方法。pcr法通常和其它检测方法结合，使检测更加准确。例如pcr和dsrna检测结合。
3.目前的检测方法是利用dsrna单克隆抗体j2通过斑点免疫杂交检测食用菌病毒，但由于检测周期较长，样本长时间处于室温状态下可能会导致rna缺失，降低检测精度。
技术实现要素：
4.为了解决相关技术中的问题，本申请提供了一种食用菌病毒检测方法通过增设降温环节，可以有效提高检测精度。
5.技术方案如下：
6.一种食用菌病毒检测方法，食用菌病毒检测方法包括以下步骤：
7.步骤一，将待检测的食用菌样品制备成匀浆液，并将匀浆液离心处理，待匀浆液分层后取其上清液备用；
8.步骤二，将膜布裁剪成若干方形膜片，将若干方形膜片固定在移料板上；取上清液点样于方形膜片上，随后进行干燥处理；
9.步骤三，将干燥后的方形膜片设于容器内，并将容器内加入封闭液直至完全浸没方形膜片，随后将容器放入冷藏设备在2-3℃温度下放置40-50min；
10.步骤四，将冷藏后的容器置于水平摇床上封闭5-7min；
11.步骤五，将方形膜片取出后清理封闭液，然后放入抗体溶液中在室温条件下孵育2h；
12.步骤六，孵育后将方形膜片在4℃环境下放置在洗涤液中进行洗膜处理；
13.步骤七，将方形膜片放入稀释过的二抗中孵育2h后再次进行步骤六中的洗膜处理；
14.步骤八，将方形膜片放于显色缓冲液中浸泡至少20min，如显色出现紫色，则判断食用菌样品携带病毒。
15.在封闭和洗膜处理中增加温度限制，通过降低环境温度使样本的rna保存更加完
整，提高检测精度。
16.进一步地，匀浆液由食用菌样品打碎后投入核酸提取设备中匀浆处理，匀浆处理时加入生理盐水和搅拌钢珠；搅拌钢珠直径尺寸为2mm，数量为5-10颗。
17.进一步地，匀浆液在离心处理时的转速为15000-17000rpm，持续时间为4-5min。
18.进一步地，膜片选用尼龙膜或硝酸纤维素膜。
19.进一步地，抗体溶液由dsrna单克隆抗体j2加入缓冲液稀释1500-2500倍所制得。
20.进一步地，洗涤液选用pbst缓冲液。
21.进一步地，方形膜片进行五次洗膜处理，每次洗膜处理完成后吸干洗涤液再进行下一次洗膜处理；第一次洗膜处理时间为20min，第二次洗膜处理时间为15min，第三、四次洗膜处理时间均为5min。
22.进一步地，在步骤六中，进行洗膜处理的设备具有循环功能，洗涤液全部循环一遍的时间为5min。
23.应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性的，并不能限制本发明。
具体实施方式
24.一种食用菌病毒检测方法，食用菌病毒检测方法包括以下步骤：
25.步骤一，将待检测的食用菌样品制备成匀浆液，并将匀浆液离心处理，待匀浆液分层后取其上清液备用；
26.步骤二，将膜布裁剪成若干方形膜片，将若干方形膜片固定在移料板上；取上清液点样于方形膜片上，随后进行干燥处理；
27.步骤三，将干燥后的方形膜片设于容器内，并将容器内加入封闭液直至完全浸没方形膜片，随后将容器放入冷藏设备在2-3℃温度下放置40-50min；
28.步骤四，将冷藏后的容器置于水平摇床上封闭5-7min；
29.步骤五，将方形膜片取出后清理封闭液，然后放入抗体溶液中在室温条件下孵育2h；
30.步骤六，孵育后将方形膜片在4℃环境下放置在洗涤液中进行洗膜处理；
31.步骤七，将方形膜片放入稀释过的二抗中孵育2h后再次进行步骤六中的洗膜处理；
32.步骤八，将方形膜片放于显色缓冲液中浸泡至少20min，如显色出现紫色，则判断食用菌样品携带病毒。
33.在封闭和洗膜处理中增加温度限制，通过降低环境温度使样本的rna保存更加完整，提高检测精度。
34.匀浆液由食用菌样品打碎后投入核酸提取设备中匀浆处理，匀浆处理时加入生理盐水和搅拌钢珠；搅拌钢珠直径尺寸为2mm，数量为5-10颗。
35.匀浆液在离心处理时的转速为15000-17000rpm，持续时间为4-5min。
36.膜片选用尼龙膜或硝酸纤维素膜。
37.抗体溶液由dsrna单克隆抗体j2加入缓冲液稀释1500-2500倍所制得。
38.洗涤液选用pbst缓冲液。
39.方形膜片进行五次洗膜处理，每次洗膜处理完成后吸干洗涤液再进行下一次洗膜处理；第一次洗膜处理时间为20min，第二次洗膜处理时间为15min，第三、四次洗膜处理时间均为5min。进行多次洗膜处理可以尽可能减少抗体溶液残留，由于残留溶液经过首次洗膜处理后大幅减少，因此洗膜时间逐渐缩短，可以提高检测效率。
40.在步骤六中，进行洗膜处理的设备具有循环功能，洗涤液全部循环一遍的时间为5min。洗涤液在浸泡方形膜片的同时不断更新，由洗膜设备加入新制备的洗涤液同时抽走旧的洗涤液，保证浸泡池内的洗涤液中的溶液含量始终保持较低的水平，提高洗涤效果。
41.本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未发明的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由所附的权利要求指出。
42.应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。
技术特征：
1.一种食用菌病毒检测方法，其特征在于，所述食用菌病毒检测方法包括以下步骤：步骤一，将待检测的食用菌样品制备成匀浆液，并将所述匀浆液离心处理，待所述匀浆液分层后取其上清液备用；步骤二，将膜布裁剪成若干方形膜片，将若干所述方形膜片固定在移料板上；取所述上清液点样于所述方形膜片上，随后进行干燥处理；步骤三，将干燥后的所述方形膜片设于容器内，并将所述容器内加入封闭液直至完全浸没所述方形膜片，随后将所述容器放入冷藏设备在2-3℃温度下放置40-50min；步骤四，将冷藏后的所述容器置于水平摇床上封闭5-7min；步骤五，将所述方形膜片取出后清理封闭液，然后放入抗体溶液中在室温条件下孵育2h；步骤六，孵育后将所述方形膜片在4℃环境下放置在洗涤液中进行洗膜处理；步骤七，将所述方形膜片放入稀释过的二抗中孵育2h后再次进行所述步骤六中的洗膜处理；步骤八，将所述方形膜片放于显色缓冲液中浸泡至少20min，如显色出现紫色，则判断所述食用菌样品携带病毒。2.根据权利要求1所述的食用菌病毒检测方法，其特征在于，所述匀浆液由所述食用菌样品打碎后投入核酸提取设备中匀浆处理，匀浆处理时加入生理盐水和搅拌钢珠；所述搅拌钢珠直径尺寸为2mm，数量为5-10颗。3.根据权利要求1所述的食用菌病毒检测方法，其特征在于，所述匀浆液在离心处理时的转速为15000-17000rpm，持续时间为4-5min。4.根据权利要求1所述的食用菌病毒检测方法，其特征在于，所述膜片选用尼龙膜或硝酸纤维素膜。5.根据权利要求1所述的食用菌病毒检测方法，其特征在于，所述抗体溶液由dsrna单克隆抗体j2加入缓冲液稀释1500-2500倍所制得。6.根据权利要求1所述的食用菌病毒检测方法，其特征在于，所述洗涤液选用pbst缓冲液。7.根据权利要求1所述的食用菌病毒检测方法，其特征在于，所述方形膜片进行五次洗膜处理，每次洗膜处理完成后吸干所述洗涤液再进行下一次洗膜处理；第一次洗膜处理时间为20min，第二次洗膜处理时间为15min，第三、四次洗膜处理时间均为5min。8.根据权利要求1所述的食用菌病毒检测方法，其特征在于，在所述步骤六中，进行洗膜处理的设备具有循环功能，所述洗涤液全部循环一遍的时间为5min。
技术总结
本发明公开了一种食用菌病毒检测方法，将待检测的食用菌样品制备成匀浆液取上清液点样于方形膜片，利用dsRNA单克隆抗体J2通过斑点杂交检测食用菌dsRNA病毒；在封闭和洗膜处理中增加温度限制，通过降低环境温度使样本的RNA保存更加完整，提高检测精度。提高检测精度。
技术研发人员：胡蕊 朱艳 季坤 戈雪莲
受保护的技术使用者：徐州锡沂康成食品检验检测研究院有限公司
技术研发日：2022.09.28
技术公布日：2023/1/6