酸性多糖及从罗勒籽胶中分离酸性多糖的方法

1.本发明涉及从罗勒籽胶中分离酸性多糖技术领域，具体涉及一种酸性多糖及从罗勒籽胶中分离酸性多糖的方法。


背景技术：

2.罗勒籽胶(bsg)是一种果胶基质，由大量未酯化的半乳糖醛酸组成，具有很强的水合能力，属于天然植物水胶体，具有优良的凝胶性、粘性和乳化特性。有研究表明，罗勒籽胶中含有酸性多糖等活性成份，该活性成份具有降胆固醇的作用。为此，罗勒籽胶在食品、工业、医药等领域具有非常广阔的应用前景。
3.目前从天然植物水胶体中提取其中的活性成分，常用的方法是把天然植物中溶于水的部分制备成水溶液，然后从其水溶液中再分离活性成分。但是罗勒籽胶因其分子量较大，虽然能够溶于水，但是溶于水后的溶液粘度比较大，因此从罗勒籽胶中分离、纯化酸性多糖比较困难，鉴于此，提供一种从罗勒籽胶中分离酸性多糖的方法成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种酸性多糖及从罗勒籽胶中分离酸性多糖的方法，解决了从罗勒籽胶中分离、纯化酸性多糖比较困难的技术问题。
6.(二)技术方案
7.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
8.一种从罗勒籽胶粉中分离酸性多糖的方法，包括如下步骤：
9.s1、以罗勒籽为原料，提取罗勒籽胶粉；
10.s2、对罗勒籽胶粉进行去蛋白处理：
11.把罗勒籽胶粉溶于水中，使用sevage试剂去除罗勒籽胶粉中的蛋白质，然后去除sevage试剂并浓缩后，对罗勒籽胶粉进行醇沉，对沉淀物进行冷冻干燥、粉碎、过60目筛，获得脱蛋白罗勒籽胶粉；
12.s3、提取罗勒籽胶酸性粗多糖：
13.碱法：将脱蛋白罗勒籽胶粉溶于碱性溶液中，获得脱蛋白罗勒籽胶粉溶液，将所述脱蛋白罗勒籽胶粉溶液于-4℃冷冻10-12小时，再离心处理，取所述脱蛋白罗勒籽胶粉溶液的上清液，调节所述上清液的ph值为7-9，然后除去所述上清液中的离子及小分子，再对所述上清液进行醇沉得到沉淀，对所述沉淀进行冷冻干燥、粉碎、过60目筛处理，获得罗勒籽胶酸性粗多糖；或
14.ctab法：将脱蛋白罗勒籽胶粉于80℃温水中搅拌30min，12000r/min离心20min，取上清液，加入10％ctab溶液，可使酸性多糖沉淀，4℃过夜，12000r/min离心15-20min，去上清，收集沉淀，加入10％nacl溶液，搅拌3-4h，再加入3倍体积96％的乙醇进行沉淀，同样
12000r/min离心15-20min，蒸馏水复溶，冷冻干燥，得到酸性粗多糖；或
15.微孔滤膜法：将脱蛋白罗勒籽胶粉于80℃温水中搅拌30min，12000r/min离心20min，取上清液，过0.45um的水系微孔滤膜，冷冻干燥，得到酸性粗多糖；
16.s4、分离罗勒籽胶酸性多糖：
17.将罗勒籽胶酸性粗多糖溶于水中，使用纤维素柱进行层析得到至少一种酸性多糖组分洗脱液，使用苯酚-硫酸法检测所述洗脱液的吸光度，选择吸光度为明显单峰的洗脱液，对所述吸光度为明显单峰的洗脱液进行分离纯化，浓缩并冻干，获得至少一种罗勒籽胶酸性多糖，于-20℃保存。
18.在一实施例中，所述步骤s2中，罗勒籽胶粉与水的质量体积比为1:5g/l。
19.在一实施例中，所述步骤s2中，sevage试剂的组成为：正丁醇与氯仿的体积比为1/4，罗勒籽胶粉与sevage试剂的质量体积比为1：1-1：1.5g/l。
20.在一实施例中，所述步骤s3中，碱性溶液选自naoh或koh溶液，所述naoh或koh溶液的浓度为0.5mol/l，脱蛋白罗勒籽胶粉与碱性溶液的质量体积比为1：1g/l。
21.在一实施例中，所述步骤s3中，还包括向脱蛋白罗勒籽胶粉溶液中加入硼氢化钠溶液，所述硼氢化钠溶液的浓度为20mmol/l，脱蛋白罗勒籽胶粉与硼氢化钠溶液的质量体积比为10：1g/l。
22.在一实施例中，所述步骤s3中，用醋酸调解上清液的ph＝7。
23.在一实施例中，所述步骤s4中，罗勒籽胶酸性粗多糖与水的质量体积比为1：5g/l。
24.一种使用所述的分离方法从罗勒籽胶中分离的酸性多糖，所述的酸性多糖具有α-淀粉酶抑制活性及抗氧化活性。
25.(三)有益效果
26.本发明提供了一种酸性多糖及从罗勒籽胶中分离酸性多糖的方法。与现有技术相比，具备以下有益效果：
27.1、以罗勒籽为原料，原料来源广泛，从罗勒籽中提取罗勒籽胶，经过复溶和洗涤步骤，不仅除去了杂质，而且具有节约乙醇用量的效果。
28.2、使用碱性溶液再次把脱蛋白罗勒籽胶粉溶解，提供氢氧根离子减弱脱蛋白罗勒籽胶粉分子之间的水合作用，降低溶液粘度，提高脱蛋白罗勒籽胶粉中多糖的溶解；添加硼氢化钠nabh4溶液，促进脱蛋白罗勒籽胶粉中多糖的溶解，并于-4℃冷冻，以促进脱蛋白罗勒籽胶粉中的多糖在碱性条件下与氢氧根离子进行充分结合，再通过调节ph，使上清溶液中的与氢氧根离子结合的多糖能够与氢氧根离子脱离，以独立的多糖分子形式存在于溶液中，采用柱层析技术，再经过洗脱分离浓缩处理得到罗勒籽胶酸性多糖，方法简单易行。分离得到的罗勒籽胶酸性多糖具有较强的抗氧化活性和抗糖作用。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1、实施例1制备罗勒籽胶粉过程示意图；
31.图2、实施例1制备脱蛋白罗勒籽胶粉过程示意图；
32.图3、实施例1制备罗勒籽胶酸性粗多糖过程示意图；
33.图4、实施例1制备罗勒籽胶酸性多糖过程示意图；
34.图5、实施例1脱蛋白罗勒籽胶粉溶解在碱性溶液中的状态及粘度示意图；
35.图6、对比例1脱蛋白罗勒籽胶粉溶解在蒸馏水中的状态及粘度示意图；
36.图7、实施例1中用deae纤维素分离纯化罗勒籽胶多糖的洗脱图。
具体实施方式
37.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.本技术实施例通过提供一种酸性多糖及从罗勒籽胶中分离酸性多糖的方法，解决了从罗勒籽胶中分离、纯化酸性多糖比较困难的技术问题。
39.本技术实施例中的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
40.本发明以罗勒籽为原料，原料来源广泛，从罗勒籽中提取罗勒籽胶，经过复溶和洗涤步骤，不仅除去了杂质，而且具有节约乙醇用量的效果。使用碱性溶液再次把脱蛋白罗勒籽胶粉溶解，提供氢氧根离子减弱脱蛋白罗勒籽胶粉分子之间的水合作用，降低溶液粘度，提高脱蛋白罗勒籽胶粉中多糖的溶解，添加硼氢化钠nabh4溶液，并于-4℃冷冻，以促进脱蛋白罗勒籽胶粉中的多糖在碱性条件下与氢氧根离子进行充分结合，再通过调节ph，使上清溶液中的与氢氧根离子结合的多糖能够与氢氧根离子脱离，以独立的多糖分子形式存在于溶液中，采用柱层析技术，再经过洗脱分离浓缩处理得到罗勒籽胶酸性多糖，分离得到的罗勒籽胶酸性多糖具有较强的抗氧化活性和抗糖作用。
41.为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
42.实施例1
43.本实施例提供一种从罗勒籽胶中分离酸性多糖的方法，包括如下步骤：
44.s1、以罗勒籽为原料，提取罗勒籽胶粉：
45.如图1所示：
46.(1)罗勒籽原料经过清洗机清洗，比重去石机精选去石，得净料。
47.(2)使用温水对净料进行浸泡，水温65℃，该温度下浸泡提取效率最高。水籽比65:1，提取效率较好。超声处理1.5小时，超声处理可使胶的提取率提高10％。
48.(3)将浸泡好的罗勒籽缓慢倒入原汁机，在果汁出口收集胶液，在废渣出口收集种子。由于罗勒籽胶在种皮上附着紧密，不易全部脱落，因此需将收集的种子再次倒入原汁机中提取，重复4次，收集到的胶液即为罗勒籽粗胶溶液。
49.(4)将罗勒籽粗胶溶液置于冰箱-20℃冷冻过夜，再取出放置在冷冻干燥机中冻干后保存、备用。
50.(5)脱胶种子：脱胶后的种子烘干或者晒干，可继续用于提取油脂或做饲料。
51.(6)复溶和洗涤：向冻干罗勒粗胶中加入100倍体积的蒸馏水进行溶解，再加入3倍
体积乙醇进行沉淀，65r/min搅拌35min，反复洗涤3次。离心得到罗勒籽胶。废弃的过滤液加入防爆酒精回收机中，回收酒精再次使用。
52.(7)冻干和粉碎：将罗勒籽胶进行冻干，获得罗勒籽胶块，粉碎，过60目筛，得到罗勒籽胶粉。
53.s2、对罗勒籽胶粉去蛋白，获得脱蛋白罗勒籽胶粉：
54.如图2所示：
55.(1)称取罗勒籽胶粉200mg溶于1000ml水，连续搅拌30min，使其充分溶解。
56.(2)加入sevage试剂250ml，振摇30min，除去水层和试剂层交界处的变性蛋白质，重复6次至无絮状变性蛋白质析出为止；
57.sevage试剂的组份为正丁醇/氯仿＝1/4。
58.(3)选取截留分子量为8000da的透析袋，在蒸馏水中透析50h，期间每隔4h更换1次蒸馏水，去除残留的正丁醇及氯仿溶液。
59.(4)将透析液置于旋转蒸发仪中，蒸发浓缩至300ml。
60.(5)加入3倍体积乙醇并过滤沉淀物，对沉淀物进行冷冻干燥、粉碎、过60目筛，获得脱蛋白罗勒籽胶粉。
61.s3、从脱蛋白罗勒籽胶粉中提取罗勒籽胶酸性粗多糖：
62.如图3所示：
63.(1)称取100mg脱蛋白罗勒籽胶粉边搅拌边加入到100ml0.5mol/l的naoh溶液中，同时，添加20mmol/l的硼氢化钠nabh4溶液10ml，获得脱蛋白罗勒籽胶粉溶液，其溶解充分，粘度较小，流动性好，状态如图5。将该脱蛋白罗勒籽胶粉溶液于-4℃冷冻一夜，促进脱蛋白罗勒籽胶粉中多糖的充分溶解。
64.(2)5000r/min离心8min，收集上清溶液，并用醋酸把上清溶液的ph值调为7，再选取截留分子量为8000da的透析袋，使用蒸馏水对其进行透析48h，期间每隔4h更换1次蒸馏水，去除naoh含有的离子和小分子。
65.(3)加入3倍体积乙醇，进行沉淀，收集沉淀，并将其进行冷冻干燥、粉碎、过60目筛，获得罗勒籽胶酸性粗多糖，保存、备用。
66.s4、从罗勒籽胶酸性粗多糖中提取罗勒籽胶酸性多糖、中性多糖：
67.如图4所示：
68.(1)称取罗勒籽胶酸性粗多糖20mg溶于100ml蒸馏水，65℃搅拌1h，使其充分溶解；将其经过deae sepharose cl-6b纤维素柱进行层析；纤维素柱预先需经过碱-酸-碱平衡处理过夜；
69.(2)加入蒸馏水洗脱，收集到中性多糖溶液bsg-ng；
70.(3)加入0.1mol/l nacl溶液洗脱,收集到第1个酸性多糖组分bsg-ag1；
71.(4)加入0.3mol/l nacl溶液冲洗,收集到第2个酸性多糖组分bsg-ag2；
72.(5)加入0.4mol/l nacl溶液冲洗,收集到第3个酸性多糖组分bsg-ag3；
73.洗脱体积流量为0.5ml/min，5管一个梯度，每管收集5ml。
74.(6)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液bsg-ng、bsg-ag1、bsg-ag2、bsg-ag3的吸光度，选取吸光度为明显单峰的bsg-ng、bsg-ag1、bsg-ag2的洗脱液进行回收处理，deae纤维素分离纯化罗勒籽胶多糖洗脱图如图7所示。
75.(7)针对洗脱液bsg-ng、bsg-ag1、bsg-ag2，选取截留分子量为8000da的透析袋，在蒸馏水中透析54h，期间每隔4h更换一次水；
76.(8)分别收集透析袋内的液体，浓缩并冻干，获得罗勒籽胶酸性多糖bsg-ag1、bsg-ag2，以及中性多糖bsg-ng，于-20℃保存。
77.对比例1：
78.将实施例1中的步骤s3中的步骤(1)“称取100mg脱蛋白罗勒籽胶粉边搅拌边加入到100ml 0.5mol/l的naoh溶液中”，调整为“称取100mg脱蛋白罗勒籽胶粉边搅拌边加入到100ml蒸馏水中”，其他步骤同实施例1。
79.称取100mg脱蛋白罗勒籽胶粉边搅拌边加入到100ml蒸馏水中，获得脱蛋白罗勒籽胶粉溶液，其无法完全溶解，粘度大，流动性不好，状态如图6。使用brookfield旋转粘度计(4号转子)，对其粘度进行测量，室温下，当转子速度为6rmp/min时，粘度为91500mpa.s。粘度过大，无法收集上清溶液，后续实验无法进行。
80.实施例2：
81.本实施例提供一种从罗勒籽胶中分离酸性多糖的方法，包括如下步骤：
82.s1、以罗勒籽为原料，提取罗勒籽胶粉：
83.(1)罗勒籽原料经过清洗机清洗，比重去石机精选去石，得净料。
84.(2)使用温水对净料进行浸泡，水温20℃，水籽比20:1，搅拌处理0.5小时。
85.(3)将浸泡好的罗勒籽缓慢倒入原汁机，在果汁出口收集胶液，在废渣出口收集种子。由于罗勒籽胶在种皮上附着紧密，不易全部脱落，因此需将收集的种子再次倒入原汁机中提取，重复3次，收集到的胶液即为罗勒籽粗胶溶液。
86.(4)将罗勒籽粗胶溶液置于冰箱-20℃冷冻过夜，再取出放置在冷冻干燥机中冻干，得到罗勒籽粗胶；
87.该罗勒籽粗胶溶液不仅可以用于本发明申请中的提取多糖，还可以用于制作其他产品，冻干以后形成粉状的罗勒籽粗胶方便保存，为提取多糖或制作其他产品提供方便。
88.因为罗勒籽粗胶溶液冻干以后利于保存，因此，实验操作者可以暂定实验，根据时间灵活安排后续实验。
89.(5)脱胶种子：脱胶后的种子烘干或者晒干，可继续用于提取油脂或做饲料。
90.(6)复溶和洗涤：向罗勒籽粗胶中加入100倍体积的蒸馏水进行溶解，再加入3倍体积乙醇进行沉淀，65r/min搅拌30min，取出沉淀物，用乙醇反复洗涤沉淀物2次，得到罗勒籽胶。
91.罗勒籽粗胶中一般含有少量肉眼不可见的种子皮等杂质，罗勒籽粗胶溶于蒸馏水，杂质不溶于蒸馏水，因此向罗勒籽粗胶中加入蒸馏水后，杂质与罗勒籽粗胶分离，此时，再加入乙醇，罗勒籽粗胶因不溶于乙醇而析出，然后用乙醇反复冲洗析出的罗勒籽粗胶，从而将杂质与罗勒籽粗胶彻底分开，从而实现除杂的目的。
92.另外，本技术把罗勒籽粗胶溶液干燥成罗勒籽粗胶再除杂，能够节约乙醇用量。这是因为其他条件都相同的情况下，1000ml的罗勒籽粗胶溶液沉淀罗勒籽粗胶要用3000ml乙醇，1000ml的罗勒籽粗胶溶液冻干以后形成罗勒籽粗胶大概为1ml，加蒸馏水溶解后再加乙醇沉淀，只需300ml乙醇，因此，可以节约大量乙醇。
93.废弃的过滤液加入防爆酒精回收机中，回收酒精再次使用。
94.(7)冻干和粉碎：将罗勒籽胶进行冻干，获得罗勒籽胶块，粉碎，过60目筛，得到罗勒籽胶粉；
95.s2、对罗勒籽胶粉去蛋白，获得脱蛋白罗勒籽胶粉：
96.(1)称取罗勒籽胶粉200mg溶于1000ml水，连续搅拌30min，使其充分溶解；
97.(2)加入sevage试剂200ml，振摇30min，除去水层和试剂层交界处的变性蛋白质，重复6次至无絮状变性蛋白质析出为止。
98.sevage试剂的组份为正丁醇/氯仿＝1/4。
99.(3)选取截留分子量为8000da的透析袋，在蒸馏水中透析24h，期间每隔4h更换1次蒸馏水，去除残留的正丁醇及氯仿溶液；
100.(4)将透析液置于旋转蒸发仪中，蒸发浓缩至200ml；
101.(5)加入3倍体积乙醇并过滤沉淀物，对沉淀物进行冷冻干燥、粉碎、过60目筛，获得脱蛋白罗勒籽胶粉。
102.s3、从脱蛋白罗勒籽胶粉中提取罗勒籽胶酸性粗多糖：
103.(1)称取100mg脱蛋白罗勒籽胶粉边搅拌边加入到100ml0.5mol/l的naoh溶液中，提供氢氧根离子减弱脱蛋白罗勒籽胶粉分子之间的水合作用，降低溶液粘度，提高脱蛋白罗勒籽胶粉中多糖的溶解，添加20mmol/l的硼氢化钠nabh4溶液10ml，硼氢化钠nabh4提高脱蛋白罗勒籽胶粉在naoh溶液中的溶解效率，获得脱蛋白罗勒籽胶粉的碱性溶液，将该脱蛋白罗勒籽胶粉的碱性溶液于-4℃冷冻一夜，促进脱蛋白罗勒籽胶粉中的多糖在碱性条件下与氢氧根离子进行充分结合而溶解在碱性溶液中。
104.(2)3000r/min离心5min，收集上清溶液，并用醋酸把上清溶液的ph值调为7，使上清溶液中的与氢氧根离子结合的多糖能够与氢氧根离子脱离，以独立的多糖分子形式存在于溶液中；再选取截留分子量为8000da的透析袋，使用蒸馏水对调整过ph值的上清溶液进行透析，透析时间为48h，期间每隔4h更换1次蒸馏水，以去除oh-及其他离子和小分子；然后取透析袋内的溶液，得到多糖水溶液；
105.(3)向多糖水溶液中加入3倍体积乙醇，对多糖进行沉淀，收集沉淀，并将其进行冷冻干燥、粉碎、过60目筛，获得罗勒籽胶酸性粗多糖粉，保存、备用。
106.s4、从罗勒籽胶酸性粗多糖粉中分别分离罗勒籽胶酸性多糖、中性多糖：
107.(1)称取罗勒籽胶酸性粗多糖粉20mg溶于100ml蒸馏水，65℃搅拌0.5h，使其充分溶解；然后使用deae sepharose cl-6b纤维素柱对其进行层析，纤维素柱预先需经过碱-酸-碱平衡处理过夜；
108.(2)使用蒸馏水洗脱，收集到中性多糖溶液bsg-ng；
109.(3)使用0.1mol/l nacl溶液洗脱,收集到第1个酸性多糖组分bsg-ag1；
110.(4)使用0.3mol/l nacl溶液洗脱,收集到第2个酸性多糖组分bsg-ag2；
111.(5)使用0.4mol/l nacl溶液洗脱,收集到第3个酸性多糖组分bsg-ag3；
112.洗脱体积流量为0.5ml/min，5管一个梯度，每管收集5ml。
113.(6)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液bsg-ng、bsg-ag1、bsg-ag2、bsg-ag3的吸光度，选取吸光度为明显单峰的bsg-ng、bsg-ag1、bsg-ag2的洗脱液进行回收处理。
114.(7)针对洗脱液bsg-ng、bsg-ag1、bsg-ag2，选取截留分子量为8000da的透析袋，在蒸馏水中透析24h，期间每隔4h更换一次水；
115.(8)分别收集透析袋内的液体，浓缩并冻干，获得罗勒籽胶酸性多糖bsg-ag1、bsg-ag2，以及中性多糖bsg-ng，于-20℃保存。
116.实施例3：
117.本实施例提供一种从罗勒籽胶中分离酸性多糖的方法，包括如下步骤：
118.s1、以罗勒籽为原料，提取罗勒籽胶粉：
119.(1)罗勒籽原料经过清洗机清洗，比重去石机精选去石，得净料。
120.(2)使用温水对净料进行浸泡，水温70℃，水籽比70:1，超声处理2小时，超声处理可使胶的提取率提高10％以上。
121.(3)将浸泡好的罗勒籽缓慢倒入原汁机，在果汁出口收集胶液，在废渣出口收集种子。由于罗勒籽胶在种皮上附着紧密，不易全部脱落，因此需将收集的种子再次倒入原汁机中提取，重复4次，收集到的胶液即为罗勒籽粗胶溶液。
122.(4)将罗勒籽粗胶溶液置于冰箱-20℃冷冻过夜，再取出放置在冷冻干燥机中冻干后保存、备用。
123.(5)脱胶种子：脱胶后的种子烘干或者晒干，可继续用于提取油脂或做饲料。
124.(6)复溶和洗涤：向冻干罗勒粗胶中加入100倍体积的蒸馏水进行溶解，再加入3倍体积乙醇进行沉淀，65r/min搅拌40min，反复洗涤4次。纱布过滤得到罗勒籽胶。废弃的过滤液加入防爆酒精回收机中，回收酒精再次使用。
125.(7)烘干和粉碎：将得到的罗勒籽胶进行烘干，获得罗勒籽胶块，粉碎，过60目筛，得到罗勒籽胶粉；
126.s2、对罗勒籽胶粉去蛋白，获得脱蛋白罗勒籽胶粉：
127.(1)称取罗勒籽胶粉200mg溶于1000ml水，连续搅拌30min，使其充分溶解；
128.(2)加入sevage试剂300ml，振摇30min，除去水层和试剂层交界处的变性蛋白质，重复6次至无絮状变性蛋白质析出为止。
129.sevage试剂的组份为正丁醇/氯仿＝1/4。
130.(3)选取截留分子量为8000da的透析袋，在蒸馏水中透析72h，期间每隔4h更换1次蒸馏水，去除残留的正丁醇及氯仿溶液；
131.(4)将透析液置于旋转蒸发仪中，蒸发浓缩至400ml；
132.(5)加入3倍体积乙醇并过滤沉淀物，对沉淀物进行冷冻干燥、粉碎、过60目筛，获得脱蛋白罗勒籽胶粉。
133.s3、从脱蛋白罗勒籽胶粉中提取罗勒籽胶酸性粗多糖：
134.(1)称取100mg脱蛋白罗勒籽胶粉边搅拌边加入到100ml0.5mol/l的koh溶液中，同时，添加20mmol/l的硼氢化钠nabh4溶液10ml，获得脱蛋白罗勒籽胶粉的碱性溶液，将该脱蛋白罗勒籽胶粉的碱性溶液于-4℃冷冻一夜，促进脱蛋白罗勒籽胶粉中多糖的充分溶解。
135.(2)6000r/min离心10min，收集上清溶液，并用醋酸把上清溶液的ph值调为7，再选取截留分子量为8000da的透析袋，使用蒸馏水对其进行透析48h，期间每隔4h更换1次蒸馏水，去除koh等含有的离子和小分子；
136.(3)加入3倍体积乙醇，进行沉淀，收集沉淀，并将其进行冷冻干燥、粉碎、过60目筛，获得罗勒籽胶酸性粗多糖，保存、备用。
137.s4、从罗勒籽胶酸性粗多糖中提取罗勒籽胶酸性多糖、中性多糖：
138.(1)称取罗勒籽胶酸性粗多糖20mg溶于100ml蒸馏水，65℃搅拌2h，使其充分溶解；将其经过deae sepharose cl-6b纤维素柱进行层析；纤维素柱预先需经过碱-酸-碱平衡处理过夜；
139.(2)加入蒸馏水洗脱，收集到中性多糖溶液bsg-ng；
140.(3)加入0.1mol/l nacl溶液洗脱,收集到第1个酸性多糖组分bsg-ag1；
141.(4)加入0.3mol/l nacl溶液冲洗,收集到第2个酸性多糖组分bsg-ag2；
142.(5)加入0.4mol/l nacl溶液冲洗,收集到第3个酸性多糖组分bsg-ag3；
143.洗脱体积流量为0.5ml/min，5管一个梯度，每管收集5ml。
144.(6)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液bsg-ng、bsg-ag1、bsg-ag2、bsg-ag3的吸光度，选取吸光度为明显单峰的bsg-ng、bsg-ag1、bsg-ag2的洗脱液进行回收处理。
145.(7)针对洗脱液bsg-ng、bsg-ag1、bsg-ag2，选取截留分子量为8000da的透析袋，在蒸馏水中透析72h，期间每隔4h更换一次水；
146.(8)分别收集透析袋内的液体，浓缩并冻干，获得罗勒籽胶酸性多糖bsg-ag1、bsg-ag2，以及中性多糖bsg-ng，于-20℃保存。
147.实施例4
148.与实施例1的不同之处是，步骤s3、提取罗勒籽胶酸性粗多糖使用ctab法：
149.将脱蛋白罗勒籽胶粉于80℃温水中搅拌30min，12000r/min离心20min，取上清液，加入10％ctab溶液，可使酸性多糖沉淀，4℃过夜，12000r/min离心18min，去上清，收集沉淀，加入10％nacl溶液，搅拌3.5h，再加入3倍体积96％的乙醇进行沉淀，同样12000r/min离心15-20min，蒸馏水复溶，冷冻干燥，得到酸性粗多糖；其他同实施例1。
150.实施例5
151.与实施例1的不同之处是，步骤s3、提取罗勒籽胶酸性粗多糖使用微孔滤膜法：
152.将脱蛋白罗勒籽胶粉于80℃温水中搅拌30min，12000r/min离心20min，取上清液，过0.45um的水系微孔滤膜，冷冻干燥，得到酸性粗多糖；其他同实施例1。
153.对实施例3制备的罗勒籽胶酸性多糖的性能进行测定。
154.1)罗勒籽胶酸性多糖的α-淀粉酶体外抑制活性测定
155.对α-淀粉酶的抑制可以减少餐后血糖的含量，因此体外α-淀粉酶的抑制作用常被用于评估生物活性物质的降血糖活性。分别称取罗勒籽胶多糖bsg-ng、bsg-ag1和bsg-ag2的粉末10mg，配制成10mg/ml的样品溶液。向2ml的试管中分别加入样品溶液40ul，α-淀粉酶溶液200ul，0.5％的淀粉溶液400ul，25℃下水浴30min，然后加入3,5-二硝基水杨酸溶液1ml，在水浴中煮沸10min，并用蒸馏水稀释至5ml。于吸光度为540nm处测量吸光度d1。以50μlnah2po4缓冲液替代α-淀粉酶溶液，测定吸光度值d2；以50μlnah2po4缓冲液替代样品液，测定吸光度值d3；以50μl nah2po4缓冲液替代酶溶液，测定吸光度值d4。α－淀粉酶活性的抑制率sr＝[1-(d
1-d2)/(d
3-d4]
×
100％。结果表明，罗勒籽胶粉以及分离到的罗勒籽胶中性和酸性多糖均具有不同程度的α-淀粉酶淀粉酶抑制作用，由此表明这类物质具有一定的抗糖作用，结果见表1。
[0156]
2)罗勒籽胶酸性多糖的抗氧化活性测定
[0157]
为评估罗勒籽胶多糖的抗氧化性能，采用dpph自由基清除活性的方式进行测定。首先制备1mg/ml的多糖溶液和0.1mm的dpph乙醇溶液。然后在试管中将样品与dpph溶液混
合。将混合液剧烈摇晃并在室温下避光放置30min，再使用分光光度计在517nm处检测吸光度。检测方法如下：
[0158]
(1)准确量取1ml的待测液与1ml的dpph乙醇溶液混匀(a1管)；
[0159]
(2)准确量取1ml的无水乙醇与1ml的dpph乙醇溶液混匀(a2管)；
[0160]
(3)准确量取1ml的无水乙醇与1ml的待测液混匀(a3管)；
[0161]
(4)反应30min后，在517nm下测a1、a2、a3管吸光度值。
[0162]
清除率计算公式：清除率％＝[(a2+a3)-a1]/a2。
[0163]
结果显示，罗勒籽胶粉及其中性和酸性多糖均具有不同程度的dpph自由基清除活性，表明该类化合物具有较强的抗氧化活性。
[0164]
表1罗勒籽胶及其不同多糖组分α-淀粉酶抑制活性及抗氧化活性
[0165]
种类bsgbsg-ngbsg-ag1bsg-ag2α-淀粉酶抑制活性55.20
±
0.2858.50
±
0.4660.03
±
0.5959.30
±
0.21dpph自由基清除活性40.18
±
0.5432.11
±
0.8747.92
±
1.2249.59
±
0.66
[0166]
综上所述，与现有技术相比，具备以下有益效果：
[0167]
1、以罗勒籽为原料，原料来源广泛，从罗勒籽中提取罗勒籽胶，经过复溶和洗涤步骤，不仅除去了杂质，而且具有节约乙醇用量的效果。
[0168]
2、使用碱性溶液再次把脱蛋白罗勒籽胶粉溶解，提供氢氧根离子减弱脱蛋白罗勒籽胶粉分子之间的水合作用，降低溶液粘度，提高脱蛋白罗勒籽胶粉中多糖的溶解。
[0169]
3、添加硼氢化钠nabh4溶液，并于-4℃冷冻，以促进脱蛋白罗勒籽胶粉中的多糖在碱性条件下与氢氧根离子进行充分结合。
[0170]
4、通过调节ph，使上清溶液中的与氢氧根离子结合的多糖能够与氢氧根离子脱离，以独立的多糖分子形式存在于溶液中，采用柱层析技术，再经过洗脱分离浓缩处理得到罗勒籽胶酸性多糖，方法简单易行。
[0171]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0172]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。