一种利用阿魏酸脱羧酶高效催化肉桂酸合成苯乙烯的方法

本发明属于蛋白质与酶工程，具体涉及一种利用阿魏酸脱羧酶高效催化肉桂酸合成苯乙烯的方法。

背景技术：

1、阿魏酸脱羧酶(ferulic acid decarboxylase,fdc)是近期发现的一种异戊二烯化黄素单核苷酸(prenylated flavin mononucleotide,prfmn)依赖性脱羧酶，其中亚胺形式prfmniminium为广泛被承认的活性形式。阿魏酸脱羧酶主要存在于真菌次级代谢途径，催化阿魏酸脱羧形成4-乙烯愈创木酚。目前研究的阿魏酸脱羧酶主要有两个来源，分别是来自于黑曲霉的aspergillus niger(anfdc)和来自酿酒酵母的saccharomyces cerevisae(scfdc)。近年发现该酶可催化(芳香族)丙烯酸衍生物脱羧及可逆羧化过程，包括芳香族烯烃、脂肪族烯烃等近四十种底物羧化，具有较为广泛的底物谱，且fdc辅因子prfmn在反应过程中不涉及氧化还原态变化及还原力再生，符合当下绿色生物制造的倡导。

2、苯乙烯(乙烯基苯)化学式为c8h8，是一种无色的、油状液体，有刺激性的气味，乙烯基的存在使得苯乙烯可以聚合。在工业上，苯乙烯是合成橡胶和塑料的单体，用来生产丁苯橡胶、聚苯乙烯、泡沬聚苯乙烯；也用于与其他单体共聚制造多种不同用途的工程塑料。

3、目前苯乙烯大规模生产用的两种化学合成的方法，包括乙苯催化脱氢法和乙苯共氧化法。前一种方法收到能耗较高并且受到设备要求的限制；而乙苯共氧化法存在反映复杂、副产物多、工艺过程长等缺点。随着生物合成方法兴起，一种苯丙氨酸通过苯丙氨酸解氨酶与肉桂酸脱羧酶经过脱氨和脱羧两步途径转化为苯乙烯的方法被开发，但也存在很多的限制。

4、karl a(payne k a,white m d,fisher k,et al.new cofactor supportsalpha,beta-unsaturated acid decarboxylation via 1,3-dipolar cycloaddition[j].nature,2015,522(7557):497-501)等人于nature第一次报道了prfmn辅因子，且推论阿魏酸脱羧酶催化肉桂酸与苯乙烯相互转化需要该种辅因子参与，emma(nagy e z a,nagy cl,filip a,et al.exploring the substrate scope of ferulic acid decarboxylase(fdc1)from saccharomyces cerevisiae[j].sci rep,2019,9(1):647)等人报道了fdc催化肉桂酸合成苯乙烯，其在全细胞催化剂24小时内可完全转化2mm肉桂酸。研究表明(marshall s a,payne k a p,fisher k,et al.the ubix flavin prenyltransferasereaction mechanism resembles class i terpene cyclase chemistry[j].nat commun,2019,10(1):2357)，fdc催化转化依赖辅因子prfmn的参与，然而prfmn辅因子因对光及氧气敏感等特性并不稳定。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，提高依赖prfmn辅因子的阿魏酸脱羧酶脱羧效率，本发明提供了一种利用阿魏酸脱羧酶高效催化肉桂酸合成苯乙烯的方法。本发明使用基因工程技术提高阿魏酸脱羧酶fdc内部辅因子prfmn的占比，在相当酶量的条件下，30min可以完全转化5mm的肉桂酸。

2、本发明提供了一组重组质粒，包括如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示的核苷酸序列。

3、进一步地，为质粒a和质粒b，所述质粒a包括seq id no.1和seq id no.2所示的核苷酸序列，所述质粒b包括seq id no.3和seq id no.4所示的核苷酸序列。

4、进一步地，所述seq id no.1所示的核苷酸序列为阿魏酸脱羧scfdc(ferulicacid decarboxylase)基因，所述seq id no.2所示的核苷酸序列为异戊烯基转移酶类基因ubix。

5、进一步地，所述seq id no.3所示的核苷酸序列为二甲氨基吡啶活化酶thim(hydroxyethylthiazole kinase)基因，所述seq id no.4所示的核苷酸序列为核黄素激酶rfk(riboflavin kinase)基因。

6、二甲氨基吡啶活化酶thim来自于大肠杆菌，uniport no.p76423；核黄素激酶rfk来自于产氨棒状杆菌，从其黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶(flavine ademine dinucleotidesynthase，fads)截取而来，ncbi no.wp_066840974,residues 183-338；异戊烯基转移酶ubix来自于铜绿假单胞菌，uniport no.q9hx08；阿魏酸脱羧酶scfdc来自于酿酒酵母，uniport no.a2qhe5。

7、进一步地，所述重组质粒的载体包括pacycduet、prsfduet。

8、本发明还提供了一种表达所述的一组重组质粒的重组工程菌。

9、进一步地，所述重组工程菌包括大肠杆菌工程菌。

10、本发明还提供了一种重组工程菌在催化肉桂酸合成苯乙烯中的应用。

11、进一步地，以重组工程菌全细胞为催化剂，在常温常压条件下催化肉桂酸合成苯乙烯。

12、进一步地，所述肉桂酸的终浓度为1-5mm，优选为2mm。

13、进一步地，所述重组工程菌粗酶液的量为40μl，反应时间为15min，反应温度为25-37℃，优选为30℃。

14、本发明通过构建阿魏酸脱羧酶fdc以及其辅因子prfmn高效供给的大肠杆菌工程菌株，以菌株粗酶液为全细胞催化剂，在15min条件下，菌株粗酶液肉桂酸转化效率为43％，在酶量加倍且30min条件下，底物转化效率可达100％。本发明所构建的prfmn辅因子高效供给的阿魏酸脱羧酶fdc菌株，在苯乙烯生物合成领域具有显著的应用前景。

技术特征：

1.一组重组质粒，其特征在于，包括如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seqid no.4所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一组重组质粒，其特征在于，为质粒a和质粒b，所述质粒a包括seq id no.1和seq id no.2所示的核苷酸序列，所述质粒b包括seq id no.3和seq idno.4所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的一组重组质粒，其特征在于，所述seq id no.1所示的核苷酸序列为阿魏酸脱羧scfdc基因，所述seq id no.2所示的核苷酸序列为异戊烯基转移酶ubix基因。

4.根据权利要求1所述的一组重组质粒，其特征在于，所述seq id no.3所示的核苷酸序列为二甲氨基吡啶活化酶thim基因，所述seq id no.4所示的核苷酸序列为核黄素激酶rfk基因。

5.根据权利要求1所述的一组重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体包括pacycduet、prsfduet。

6.一种表达权利要求1-5中任一项所述的一组重组质粒的重组工程菌。

7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包括大肠杆菌工程菌。

8.权利要求6或7所述的重组工程菌在催化肉桂酸合成苯乙烯中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，以重组工程菌全细胞为催化剂，在25-37℃、常压条件下催化肉桂酸合成苯乙烯。

技术总结
本发明公开了一种利用阿魏酸脱羧酶高效催化肉桂酸合成苯乙烯的方法，属于蛋白质与酶工程技术领域。通过构建阿魏酸脱羧酶Fdc以及其辅因子prFMN高效供给的大肠杆菌工程菌株，以菌株粗酶液为全细胞催化剂，在15min条件下，仅转化Fdc的菌株粗酶液测得肉桂酸的转化效率为6％；而辅因子高效供给菌株粗酶液肉桂酸转化效率为43％，相比提升了7倍，在酶量加倍且30min条件下，底物转化效率可达100％。本发明所构建的prFMN辅因子高效供给的阿魏酸脱羧酶Fdc菌株，在苯乙烯生物合成领域具有显著的应用前景。

技术研发人员：冯延宾,李鸿飞,朱小妮,薛松
受保护的技术使用者：大连理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13