一种细菌5α-还原酶及其应用

：本发明涉及一种来源于大肠杆菌的新型5α-还原酶基因及其应用，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该5α-还原酶的重组表达菌株，以及该新型细菌5α-还原酶在转化雄烯二酮(ad)到5α-雄烷二酮(5α-ad)的应用，属于酶的基因工程。

背景技术：

1、甾体5α-还原酶是一种还原型辅酶ⅱ(nadph)依赖型酶，它能够催化一系列类固醇底物在4,5位双键发生还原作用，并将c-5位上的氢加成为5α-还原产物。例如，睾酮(ts)在5α-还原酶的作用下被还原成一种活性更强的甾体激素：双氢睾酮(dht)，其在雄激素的生理调节以及人的两性分化等方面，发挥着极其重要的作用。

2、甾体类药物即类固醇，是机体中组成甾醇、胆酸、类固醇激素、性激素和维生素d的基本物质，对维持生命体生理功能的正常化运行具有重大意义。肿瘤、炎症等方面具有较好的疗效而被广泛应用，目前在全球市场的需求仅次于抗生素，具有广泛的市场前景。5α-ad作为合成美雄诺龙、美睾酮等数十种甾体激素类药物的关键中间体，具有重要的市场价值和研究前景。

3、一些化学法和生物法可用于合成重要甾体化合物5α-ad，但化学法往往伴随着反应步骤复杂、环境污染大、过程不易控制等问题。生物法因其条件温和、环境友好、专一性强等优势，已越来越受关注。但目前已发现的5α-还原酶，其对底物表现的活性并不能满足工业化生产的要求，在一定程度上限制了其应用。

4、大肠杆菌作为5α-ad生产菌株，具有生长迅速、营养需求简单、遗传操作简便等优点，还拥有底物代谢广泛和发酵技术成熟的优势，是最具发展潜力的高产5α-ad的菌种之一。所以本申请考虑通过同源表达策略，将筛选出的新型细菌5α-还原酶基因导入大肠杆菌中，构建一株以ad为底物生产5α-ad的重组表达菌株，通过在大肠杆菌中表达新型5α-还原酶，赋予大肠杆菌5α-还原能力，以实现从ad到5α-ad的一步生物转化。

5、在本发明中，新型细菌5α-还原酶来源于大肠杆菌，并通过在大肠杆菌中进行同源表达，能够得到5α-ad的高效转化菌株，为工业化生产5α-ad甾体化合物提供优良菌株。

技术实现思路

0、
技术实现要素：
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1、本发明的目的在于克服目前工业上生产5α-ad存在的诸多问题，并提供一种来源于大肠杆菌的新型细菌5α-还原酶和表达该新型细菌5α-还原酶基因的重组表达菌株及其应用。

2、本发明实现上述目的的技术方案如下：本发明获得一种来源于大肠杆菌的未知功能的蛋白，经鉴定其为具有5α-还原作用的新型细菌5α-还原酶，并将其基因命名为5αe。将筛选的大肠杆菌来源的新型细菌5α-还原酶基因用ce design进行无缝克隆引物设计(即seq id no.3和seq id no.4)；通过pcr扩增目标基因，将该新型细菌5α-还原酶基因和质粒pet29b通过酶切，连接，构建pet29b-5αe重组质粒，将重组质粒pet29b-5αe导入至大肠杆菌的bl21(de3)感受态细胞中，构建获得高产5α-ad的重组表达菌株bl21-pet29b-5αe，并进一步通过转化工艺优化获得高产的5α-ad。

3、为实现上述目的，本发明提供的技术方案之一是：一种新型细菌5α-还原酶，所述新型细菌5α-还原酶来源于大肠杆菌，其氨基酸序列如序列表seq id no.2所示；

4、进一步地，所述新型细菌5α-还原酶的编码基因5αe，具有seq id no.1所示的碱基序列。

5、为实现上述目的，本发明提供的技术方案之二是：含有5αe基因的重组质粒或重组菌株；

6、进一步地，所述重组质粒采用的表达载体为pet29b；

7、进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞为大肠杆菌；

8、更进一步地，所述重组菌株，是将5αe基因与pet29b载体构建重组质粒后导入大肠杆菌bl21(de3)所得。

9、为实现上述目的，本发明提供的技术方案之三是，上述重组质粒或重组表达菌株的应用，特别是在生产5α-还原酶中的应用，或者是在生物转化ad生成5α-ad中的应用。

10、为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之四是，seq id no.2所示5α-还原酶的应用，特别是在类固醇底物4,5位双键发生还原作用，并将c-5位上的氢加成为5α-还原产物中的应用，更特别地是在催化ad生成5α-ad中的应用。

11、有益效果：

12、1、本发明通过高通量菌株筛选，获得能够生产5α-ad的细菌菌株，即大肠杆菌，通过pcr扩增获得该菌株的能够生产5α-ad的基因片段，经测序为一段新的未知功能的碱基序列，鉴定为一种新型细菌5α-还原酶。

13、2、本发明构建的包含该新型5α-还原酶的重组表达菌株对转化ad生成5α-ad具有很好的效果，大大缩短了底物转化的时间，当底物ad浓度为3g/l时，全细胞催化9h的时候,重组菌株bl21-pet29b-5αe转化ad为5α-ad达到最大转化率89.9％，提高了转化效率。因此该新型5α-还原酶和重组表达菌株在工业生产中具有较大的应用潜力。

技术特征：

1.一种细菌来源的5α-还原酶，其特征在于，所述5α-还原其氨基酸序列如序列表seqid no.2所示。

2.权利要求1所述5α-还原酶的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，具有seq id no.1所示的碱基序列。

4.含有权利要求2所述5α-还原酶的编码基因的重组质粒或重组菌株。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，表达载体为pet29b。

6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌。

7.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，是将5α-还原酶的编码基因与pet29b载体构建重组质粒后导入大肠杆菌bl21(de3)所得。

8.权利要求2所述重组质粒或重组菌株的应用，其特征在于，是在生产5α-还原酶中的应用，或者是在生物转化ad生成5α-ad中的应用。

9.权利要求1所述5α-还原酶的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，是在类固醇底物4,5位双键发生还原作用，并将c-5位上的氢加成为5α-还原产物中的应用，或者是在催化ad生成5α-ad中的应用。

技术总结
本发明涉及一种来源于大肠杆菌的新型5α‑还原酶基因及其应用，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该5α‑还原酶的重组表达菌株，以及该新型细菌5α‑还原酶在转化雄烯二酮(AD)到5α‑雄烷二酮(5α‑AD)的应用，属于酶的基因工程技术领域。本发明构建的包含该新型5α‑还原酶的重组表达菌株对转化AD生成5α‑AD具有很好的效果，大大缩短了底物转化的时间，提高了转化效率，在工业生产中具有较大的应用潜力。

技术研发人员：申雁冰,王敏,夏梦雷,袁丛丛,苏振华,刘知宴,骆健美
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11